比色法測定木荷樹皮總皂苷的含量

鄧志勇+潘百明+陳興田+梁昌祥+黃宇

摘要：建立了比色法測定木荷樹皮提取物總皂苷含量的方法。研究香草醛-冰醋酸溶液濃度、高氯酸用量、反應(yīng)溫度和加熱時間對顯色反應(yīng)的影響，確定最佳比色條件為以7%香草醛-冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸溶液作為顯色劑，顯色溫度為70 ℃，顯色時間為25 min，在550 nm處測定吸光度?；貧w方程為y=4.915x+0.083 2（r2 =0.999 6），線性可靠，曲線顯著，精密度試驗的RSD為0.42%。該比色條件下測得木荷樹皮提取物總皂苷含量為2.25%。該方法操作簡單、準確、穩(wěn)定性較好，可用于測定木荷樹皮提取物總皂苷含量。

關(guān)鍵詞：木荷；皂苷；比色法；測定

中圖分類號：O657.32文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2014）02-0281-03

收稿日期：2013-10-11

基金項目：廣西壯族自治區(qū)自然科學(xué)基金青年項目（編號：2011GXNSFB018055）。

作者簡介：鄧志勇（1978—），男，廣西臨桂人，碩士，講師，主要從事植物源農(nóng)藥研究及天然藥物的開發(fā)與利用。E-mail：dengzhiyong05@163.com。木荷（Schima superba Gardn. et Champ.）別稱“荷木”，屬山茶科常綠喬木。目前國內(nèi)外報道木荷的化學(xué)成分主要有水解鞣質(zhì)類、三萜及皂苷類、揮發(fā)油類、表兒茶素、α-菠甾醇等。木荷皂苷具有抑制腫瘤細胞生長、驅(qū)蟲作用[1-3]；同時木荷提取物對小菜蛾和菜粉蝶有較高的生長發(fā)育抑制作用、拒食作用等[4-6]。但是目前還沒有關(guān)于木荷皂苷提取工藝研究的報道。皂苷的定量是皂苷研究利用的最大難題，皂苷本身沒有紫外吸收，也無專一性顯色劑，直接測定難度很大。因此本試驗對木荷樹皮提取物中總皂苷含量的比色法測定工藝進行了研究，為木荷樹皮中總皂苷的含量測定提供了快速、簡捷、準確的參考方法。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗材料與試劑木荷樹皮：采自廣西壯族自治區(qū)桂林市臨桂縣宛田鄉(xiāng)，自然晾干后，用高速多功能粉碎機粉碎，粉末于鼓風干燥箱內(nèi)60 ℃恒溫烘干至恒重，過40目標準篩備用。

無水乙醇、石油醚、正丁醇、香草醛、高氯酸、冰醋酸、皂苷標準品（純度≥98%）均為國產(chǎn)分析純（廣東光華化學(xué)廠有限公司）。

1.1.2儀器設(shè)備JP-350A-8型高速多功能粉碎機（浙江省永康市久品工貿(mào)有限公司）；FA1004電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；40目標準篩（江蘇省無錫市錫儀建材儀器廠）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵（河南省鞏義市予華儀器有限責任公司）；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任有限公司）；101-1型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）。

1.2試驗方法

1.2.1檢測波長的確定精確吸取對照品溶液（準確稱取12 mg皂苷標準品，加無水乙醇定容到50 mL，配成 0.24 mg/mL 對照品溶液）0.5 mL和供試品溶液（稱取20 g木荷樹皮，粉碎，稱重，置于索氏提取器中，用100 mL無水乙醇回流10 h；提取結(jié)束后趁熱抽濾，并將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮近干，得到流浸膏，將流浸膏用無水乙醇定容至 200 mL，取用時再稀釋10倍）0.5 mL分別加入試管中，于 70 ℃ 水浴揮干溶劑。然后，依次加入7%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，70 ℃水浴15 min，水浴后立即用冷水冷卻5 min，停止反應(yīng)，再加入1.25 mL冰醋酸，充分振蕩，靜置10 min。在波長400～700 nm范圍內(nèi)掃描，分別得到皂苷標準品和木荷樹皮提取液的可見光譜掃描圖。

1.2.2標準曲線的測定準確稱取5 mg皂苷標準品，放入50 mL容量瓶中，再加入乙醇溶解，定容至刻度。準確吸取04、0.6、0.8、1.0、1.2 mL皂苷標準液置于試管中70 ℃水浴揮干溶劑；然后依次加入7%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和 0.8 mL 高氯酸，70 ℃水浴15 min，水浴后立即用冷水冷卻 5 min，停止反應(yīng)；再加入1.25 mL冰醋酸，充分振蕩，靜置 10 min，在550 nm處測定吸光度。平行測定每一個濃度3次，并以3次的平均吸光度為縱坐標，皂苷標準品的質(zhì)量為橫坐標作圖，建立回歸線方程。

1.2.3最佳測定條件的確定

1.2.3.1香草醛-冰醋酸溶液濃度精確吸取0.5 mL供試品溶液，70 ℃水浴揮干溶劑，依次配置1%、3%、5%、7%、9%的香草醛-冰醋酸溶液，分別加入香草醛-冰醋酸溶液 0.2 mL 和高氯酸0.8 mL，70 ℃水浴15 min，水浴后立即用冷水冷卻5 min，停止反應(yīng)，再加入1.25 mL冰醋酸，充分振蕩，測定吸光度。

1.2.3.2高氯酸用量準確量取供試樣品0.5 mL于試管中，并放入70 ℃水浴揮發(fā)溶劑，準確量取7% 香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL加入，再分別依次加入高氯酸0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，充分振蕩后于70 ℃水浴靜置加熱15 min，取出用冷水冷卻，加入1.25 mL冰醋酸，以不加供試樣品的平行樣為空白，測定吸光度。

1.2.3.3反應(yīng)溫度準確量取供試樣品0.5 mL，70 ℃水浴揮干溶劑，然后依次加入7%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，70 ℃水浴15 min，水浴后立即用冷水冷卻 5 min，停止反應(yīng)，再加入1.25 mL冰醋酸，充分振蕩，依次改變水浴溫度為40、50、60、70、80 ℃，再測定其吸光度。

1.2.3.4加熱時間準確量取供試樣品0.5 mL，70 ℃水浴揮干溶劑，然后依次加入7%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，70 ℃水浴15 min，水浴后立即用冷水冷卻 5 min，停止反應(yīng)，再加入1.25 mL冰醋酸，充分振蕩，于70 ℃水浴中分別加熱10、15、20、25、30 min，測定吸光度。endprint

1.2.4穩(wěn)定性試驗 精確吸取0.5 mL供試品溶液，70 ℃水浴揮干溶劑，然后依次加入7%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，70 ℃水浴15 min，水浴后立即用冷水冷卻5 min，停止反應(yīng)，再加入1.25 mL冰醋酸，充分振蕩，分別在10、20、30、40、50、60、70、80、90 min時在最大吸收波長處測定吸光度。

1.2.5精密度試驗取7份供試品溶液，每份0.5 mL，70 ℃水浴揮干溶劑，然后依次加入7%香草醛-冰醋酸溶液 0.2 mL 和高氯酸0.8 mL，70 ℃水浴15 min，水浴后立即用冷水冷卻5 min，停止反應(yīng)，再加入1.25 mL冰醋酸，充分振蕩，測定吸光度。

1.2.6木荷樹皮提取物樣品總皂苷含量的測定稱取20 g木荷樹皮，粉碎，稱重，置于索氏提取器中，用100 mL無水乙醇回流10 h，提取結(jié)束后趁熱抽濾，并將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮近干，得到流浸膏，將流浸膏用無水乙醇定容至 200 mL，取用時再稀釋10倍。取供試品溶液3份，每份精確吸取0.5 mL，70 ℃水浴揮干溶劑，然后依次加入7%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，70 ℃水浴15 min，水浴后立即用冷水冷卻5 min，停止反應(yīng)，再加入1.25 mL冰醋酸，充分振蕩，測定吸光度，計算樣品含量。

2結(jié)果與分析

2.1檢測波長的確定

由圖1、圖2可以看出，在400～700 nm波長范圍內(nèi)，皂苷標準品在550 nm附近有最大吸收峰，木荷樹皮提取物在 460 nm 處有最大吸收波長，綜合分析后選擇550 nm作為木荷樹皮提取物總皂苷吸光度的檢測波長。

2.2皂苷標準曲線結(jié)果與分析

由圖3可知，r2>0.999，說明線性關(guān)系良好，設(shè)計合理，準確度高。

2.3最佳測定條件的確定

2.3.1香草醛-冰醋酸溶液濃度由圖4可知，1%～7%的香草醛-冰醋酸溶液吸光度隨濃度的升高而增大，濃度為7%時吸光度最高，濃度大于7% 時吸光度開始降低，因此顯色反應(yīng)中香草醛-冰醋酸溶液的最佳濃度為7%。

2.3.2高氯酸用量由圖5可知，在本試驗范圍內(nèi)，高氯酸用量小于0.8 mL時，吸光度逐漸增大，在0.8 mL時有最大吸光度，大于0.8 mL后吸光度又逐漸減小，因此高氯酸最佳用量為0.8 mL。

2.3.3反應(yīng)溫度由圖6可知，在本試驗范圍內(nèi)，溫度為 70 ℃ 時，吸光度最大，當溫度超過70 ℃以后，吸光度開始下降，因此最佳水浴溫度為70 ℃。

2.3.4加熱時間由圖7可知，在本試驗范圍內(nèi)，反應(yīng)時間在25 min時，吸光度最大，因此最適顯色時間為25 min。

2.4穩(wěn)定性試驗

由圖8可以看出，經(jīng)香草醛-高氯酸法顯色后在60 min時數(shù)值基本穩(wěn)定，可以達到測定的要求。

2.5精密度試驗

分別準確量取7份皂苷樣品，每份0.5 mL，根據(jù)香草醛-高氯酸顯色用比色法在最佳條件測定供試樣品的吸光度（表1）。通過計算得出相對標準差RSD=0.42%（n=7）， 表

2.6木荷樹皮提取物樣品總皂苷含量的測定

根據(jù)香草醛-高氯酸顯色用比色法在最佳條件測定供試樣品的吸光度，由標準曲線得到木荷試樣品的質(zhì)量濃度，再計算出木荷樹皮總皂苷的含量為2.25%。

3結(jié)論與討論

通過香草醛-高氯酸比色法對木荷樹皮提取物總皂苷含量進行了詳細的條件試驗，建立了木荷樹皮提取物總皂苷含量的測定方法。由試驗結(jié)果可以得出，以0.8 mL的高氯酸溶液和7%的香草醛-冰醋酸溶液作為顯色劑，顯色時間為 25 min，顯色溫度為70 ℃時，比色體系最佳、最穩(wěn)定。在 550 nm 下測定所得的回歸線方程為y=4.915x+0.083 2（r2=0.999 6），精密度試驗相對標準差RSD=0.42%。該方法操作簡單，準確，穩(wěn)定性較好，失擬性小，在該條件下測得木荷樹皮提取物總皂苷含量為2.25%。

參考文獻：

[1]Ohtsuki T，Miyagawa T，Koyano T，et，al. Acylated triterpenoid saponins from Schima noronhae and their cell growth inhibitory activity[J]. J Nat Prod，2008，71：918-921.

[2]Ohtsuki T，Sato M，Koyano T，et al. Steroidal saponins from Calamus insignis，and their cell growth and cell cycle inhibitory activities[J]. Bioorg Med Chem，2006，14（3）：659-665.

[3]陳維新，吳大剛. 銀木荷皂苷元研究[J]. 化學(xué)學(xué)報，1977，36（3）：229-232.

[4]鄧志勇，鄧業(yè)成，劉艷華. 木荷提取物對小菜蛾和菜青蟲的拒食活性[J]. 農(nóng)藥，2007，46（12）：854-856.

[5]鄧志勇. 木荷提取物對小菜蛾和菜粉蝶生長發(fā)育的抑制效果[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（4）：129-130.

[6]鄧志勇，鄧業(yè)成，周國永，等. 木荷樹皮殺蟲活性成分追蹤的初步試驗[J]. 農(nóng)藥，2010，49（8）：612-614.endprint

1.2.4穩(wěn)定性試驗 精確吸取0.5 mL供試品溶液，70 ℃水浴揮干溶劑，然后依次加入7%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，70 ℃水浴15 min，水浴后立即用冷水冷卻5 min，停止反應(yīng)，再加入1.25 mL冰醋酸，充分振蕩，分別在10、20、30、40、50、60、70、80、90 min時在最大吸收波長處測定吸光度。

1.2.5精密度試驗取7份供試品溶液，每份0.5 mL，70 ℃水浴揮干溶劑，然后依次加入7%香草醛-冰醋酸溶液 0.2 mL 和高氯酸0.8 mL，70 ℃水浴15 min，水浴后立即用冷水冷卻5 min，停止反應(yīng)，再加入1.25 mL冰醋酸，充分振蕩，測定吸光度。

1.2.6木荷樹皮提取物樣品總皂苷含量的測定稱取20 g木荷樹皮，粉碎，稱重，置于索氏提取器中，用100 mL無水乙醇回流10 h，提取結(jié)束后趁熱抽濾，并將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮近干，得到流浸膏，將流浸膏用無水乙醇定容至 200 mL，取用時再稀釋10倍。取供試品溶液3份，每份精確吸取0.5 mL，70 ℃水浴揮干溶劑，然后依次加入7%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，70 ℃水浴15 min，水浴后立即用冷水冷卻5 min，停止反應(yīng)，再加入1.25 mL冰醋酸，充分振蕩，測定吸光度，計算樣品含量。

2結(jié)果與分析

2.1檢測波長的確定

由圖1、圖2可以看出，在400～700 nm波長范圍內(nèi)，皂苷標準品在550 nm附近有最大吸收峰，木荷樹皮提取物在 460 nm 處有最大吸收波長，綜合分析后選擇550 nm作為木荷樹皮提取物總皂苷吸光度的檢測波長。

2.2皂苷標準曲線結(jié)果與分析

由圖3可知，r2>0.999，說明線性關(guān)系良好，設(shè)計合理，準確度高。

2.3最佳測定條件的確定

2.3.1香草醛-冰醋酸溶液濃度由圖4可知，1%～7%的香草醛-冰醋酸溶液吸光度隨濃度的升高而增大，濃度為7%時吸光度最高，濃度大于7% 時吸光度開始降低，因此顯色反應(yīng)中香草醛-冰醋酸溶液的最佳濃度為7%。

2.3.2高氯酸用量由圖5可知，在本試驗范圍內(nèi)，高氯酸用量小于0.8 mL時，吸光度逐漸增大，在0.8 mL時有最大吸光度，大于0.8 mL后吸光度又逐漸減小，因此高氯酸最佳用量為0.8 mL。

2.3.3反應(yīng)溫度由圖6可知，在本試驗范圍內(nèi)，溫度為 70 ℃ 時，吸光度最大，當溫度超過70 ℃以后，吸光度開始下降，因此最佳水浴溫度為70 ℃。

2.3.4加熱時間由圖7可知，在本試驗范圍內(nèi)，反應(yīng)時間在25 min時，吸光度最大，因此最適顯色時間為25 min。

2.4穩(wěn)定性試驗

由圖8可以看出，經(jīng)香草醛-高氯酸法顯色后在60 min時數(shù)值基本穩(wěn)定，可以達到測定的要求。

2.5精密度試驗

分別準確量取7份皂苷樣品，每份0.5 mL，根據(jù)香草醛-高氯酸顯色用比色法在最佳條件測定供試樣品的吸光度（表1）。通過計算得出相對標準差RSD=0.42%（n=7）， 表

2.6木荷樹皮提取物樣品總皂苷含量的測定

根據(jù)香草醛-高氯酸顯色用比色法在最佳條件測定供試樣品的吸光度，由標準曲線得到木荷試樣品的質(zhì)量濃度，再計算出木荷樹皮總皂苷的含量為2.25%。

3結(jié)論與討論

通過香草醛-高氯酸比色法對木荷樹皮提取物總皂苷含量進行了詳細的條件試驗，建立了木荷樹皮提取物總皂苷含量的測定方法。由試驗結(jié)果可以得出，以0.8 mL的高氯酸溶液和7%的香草醛-冰醋酸溶液作為顯色劑，顯色時間為 25 min，顯色溫度為70 ℃時，比色體系最佳、最穩(wěn)定。在 550 nm 下測定所得的回歸線方程為y=4.915x+0.083 2（r2=0.999 6），精密度試驗相對標準差RSD=0.42%。該方法操作簡單，準確，穩(wěn)定性較好，失擬性小，在該條件下測得木荷樹皮提取物總皂苷含量為2.25%。

參考文獻：

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[2]Ohtsuki T，Sato M，Koyano T，et al. Steroidal saponins from Calamus insignis，and their cell growth and cell cycle inhibitory activities[J]. Bioorg Med Chem，2006，14（3）：659-665.

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[5]鄧志勇. 木荷提取物對小菜蛾和菜粉蝶生長發(fā)育的抑制效果[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（4）：129-130.

[6]鄧志勇，鄧業(yè)成，周國永，等. 木荷樹皮殺蟲活性成分追蹤的初步試驗[J]. 農(nóng)藥，2010，49（8）：612-614.endprint

1.2.4穩(wěn)定性試驗 精確吸取0.5 mL供試品溶液，70 ℃水浴揮干溶劑，然后依次加入7%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，70 ℃水浴15 min，水浴后立即用冷水冷卻5 min，停止反應(yīng)，再加入1.25 mL冰醋酸，充分振蕩，分別在10、20、30、40、50、60、70、80、90 min時在最大吸收波長處測定吸光度。

1.2.5精密度試驗取7份供試品溶液，每份0.5 mL，70 ℃水浴揮干溶劑，然后依次加入7%香草醛-冰醋酸溶液 0.2 mL 和高氯酸0.8 mL，70 ℃水浴15 min，水浴后立即用冷水冷卻5 min，停止反應(yīng)，再加入1.25 mL冰醋酸，充分振蕩，測定吸光度。

1.2.6木荷樹皮提取物樣品總皂苷含量的測定稱取20 g木荷樹皮，粉碎，稱重，置于索氏提取器中，用100 mL無水乙醇回流10 h，提取結(jié)束后趁熱抽濾，并將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮近干，得到流浸膏，將流浸膏用無水乙醇定容至 200 mL，取用時再稀釋10倍。取供試品溶液3份，每份精確吸取0.5 mL，70 ℃水浴揮干溶劑，然后依次加入7%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，70 ℃水浴15 min，水浴后立即用冷水冷卻5 min，停止反應(yīng)，再加入1.25 mL冰醋酸，充分振蕩，測定吸光度，計算樣品含量。

2結(jié)果與分析

2.1檢測波長的確定

由圖1、圖2可以看出，在400～700 nm波長范圍內(nèi)，皂苷標準品在550 nm附近有最大吸收峰，木荷樹皮提取物在 460 nm 處有最大吸收波長，綜合分析后選擇550 nm作為木荷樹皮提取物總皂苷吸光度的檢測波長。

2.2皂苷標準曲線結(jié)果與分析

由圖3可知，r2>0.999，說明線性關(guān)系良好，設(shè)計合理，準確度高。

2.3最佳測定條件的確定

2.3.1香草醛-冰醋酸溶液濃度由圖4可知，1%～7%的香草醛-冰醋酸溶液吸光度隨濃度的升高而增大，濃度為7%時吸光度最高，濃度大于7% 時吸光度開始降低，因此顯色反應(yīng)中香草醛-冰醋酸溶液的最佳濃度為7%。

2.3.2高氯酸用量由圖5可知，在本試驗范圍內(nèi)，高氯酸用量小于0.8 mL時，吸光度逐漸增大，在0.8 mL時有最大吸光度，大于0.8 mL后吸光度又逐漸減小，因此高氯酸最佳用量為0.8 mL。

2.3.3反應(yīng)溫度由圖6可知，在本試驗范圍內(nèi)，溫度為 70 ℃ 時，吸光度最大，當溫度超過70 ℃以后，吸光度開始下降，因此最佳水浴溫度為70 ℃。

2.3.4加熱時間由圖7可知，在本試驗范圍內(nèi)，反應(yīng)時間在25 min時，吸光度最大，因此最適顯色時間為25 min。

2.4穩(wěn)定性試驗

由圖8可以看出，經(jīng)香草醛-高氯酸法顯色后在60 min時數(shù)值基本穩(wěn)定，可以達到測定的要求。

2.5精密度試驗

分別準確量取7份皂苷樣品，每份0.5 mL，根據(jù)香草醛-高氯酸顯色用比色法在最佳條件測定供試樣品的吸光度（表1）。通過計算得出相對標準差RSD=0.42%（n=7）， 表

2.6木荷樹皮提取物樣品總皂苷含量的測定

根據(jù)香草醛-高氯酸顯色用比色法在最佳條件測定供試樣品的吸光度，由標準曲線得到木荷試樣品的質(zhì)量濃度，再計算出木荷樹皮總皂苷的含量為2.25%。

3結(jié)論與討論

通過香草醛-高氯酸比色法對木荷樹皮提取物總皂苷含量進行了詳細的條件試驗，建立了木荷樹皮提取物總皂苷含量的測定方法。由試驗結(jié)果可以得出，以0.8 mL的高氯酸溶液和7%的香草醛-冰醋酸溶液作為顯色劑，顯色時間為 25 min，顯色溫度為70 ℃時，比色體系最佳、最穩(wěn)定。在 550 nm 下測定所得的回歸線方程為y=4.915x+0.083 2（r2=0.999 6），精密度試驗相對標準差RSD=0.42%。該方法操作簡單，準確，穩(wěn)定性較好，失擬性小，在該條件下測得木荷樹皮提取物總皂苷含量為2.25%。

參考文獻：

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[6]鄧志勇，鄧業(yè)成，周國永，等. 木荷樹皮殺蟲活性成分追蹤的初步試驗[J]. 農(nóng)藥，2010，49（8）：612-614.endprint