融合蛋白M-IL-2(88Arg,125Ala)在畢赤酵母中的表達(dá)及抗腫瘤活性研究

李 林 ， 錢冬萌， 邵光燦， 閆志勇， 宋旭霞， 陳 豪， 王 斌

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)教研室，山東 青島 266071)

融合蛋白M-IL-2(88Arg,125Ala)在畢赤酵母中的表達(dá)及抗腫瘤活性研究

李 林 ， 錢冬萌， 邵光燦， 閆志勇， 宋旭霞， 陳 豪， 王 斌*

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)教研室，山東 青島 266071)

構(gòu)建融合基因蜂毒肽(melittin)與人變構(gòu)白介素2(M-IL-2(88Arg,125Ala))畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPICZα A/M-IL-2(88Arg，125Ala)，轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株KM71H，甲醇誘導(dǎo)篩選出的多拷貝陽性菌株表達(dá)融合蛋白，純化融合蛋白，并進(jìn)行初步的抗腫瘤活性研究。經(jīng)測序及PCR鑒定，M-IL-2(88Arg,125Ala)正確插入pPICZα A中，電轉(zhuǎn)化后，重組載體通過同源重組整合到酵母基因組中，SDS-PAGE檢測在26 ku左右有明顯目的條帶，與理論相符。經(jīng)Western blot鑒定具有較高抗原性及特異性。BCA法測定甲醇誘導(dǎo)96 h融合蛋白表達(dá)量達(dá)315.2 mg/L。CCK-8法檢測融合蛋白對人卵巢癌細(xì)胞SKOV3細(xì)胞及Hela細(xì)胞生長抑制作用，表明純化的融合蛋白在體外能抑制人卵巢癌細(xì)胞SKOV3細(xì)胞及Hela細(xì)胞的生長增殖。該研究為融合蛋白M-IL-2(88Arg,125Ala)大規(guī)模制備和動物實(shí)驗(yàn)以及臨床前期研究奠定了基礎(chǔ)。

M-IL-2(88Arg，125Ala)；畢赤酵母；表達(dá)；純化；抗腫瘤活性

蜂毒肽(melittin)是蜂毒中的主要成分，是由26個氨基酸組成的堿性多肽[1]，具有抗炎、降壓、鎮(zhèn)痛、抑制血小板凝集、抗輻射、抗菌、抗HIV、抗風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及抗腫瘤等多種藥理活性[2-3]。研究表明蜂毒肽還具有免疫調(diào)節(jié)功能，對多種腫瘤細(xì)胞有直接殺傷作用。Hood JL等[4]研究表明蜂毒肽能夠干擾和抑制最初的HIV感染或潛在的其他膜病毒感染。然而蜂毒肽的溶血作用限制了其臨床應(yīng)用。人白細(xì)胞介素-2(human Interleukin-2, hIL-2)是一種細(xì)胞因子，能調(diào)節(jié)其他淋巴細(xì)胞的生長和分化，具有多種免疫調(diào)節(jié)功能相關(guān)的生物活性。臨床上已經(jīng)開始使用基因重組IL-2(rIL-2)作為治療腎細(xì)胞癌、黑色素瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、非何杰金氏淋巴瘤、結(jié)腸直腸癌、肝癌、膀胱癌等惡性腫瘤的藥物[5]。研究表明基因變構(gòu)IL-2能增強(qiáng)抗腫瘤活性，降低毒性[6-9]。但是IL-2對于其靶受體的選擇性不高，在使用過程中顯示出抗腫瘤的活性不夠特異等問題。為解決以上問題，青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室構(gòu)建了融合蛋白M-IL-2(88Arg，125Ala)，并在原核中得到成功表達(dá)[10-11]。初步研究融合蛋白M-IL-2(88Arg，125Ala) 具有較高的促進(jìn)PBMC增殖，增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷作用；體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有較顯著的抑制人卵巢癌細(xì)胞SKOV3、人宮頸癌Hela細(xì)胞等癌細(xì)胞的增殖，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)該融合蛋白具有抑制鼠卵巢癌腫瘤生長的作用[12-14]。鑒于該融合基因采用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)產(chǎn)量低且對自身菌株具有殺傷作用，而畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)與原核表達(dá)系統(tǒng)相比，具有表達(dá)量高，真核生物表達(dá)時的蛋白質(zhì)進(jìn)行正確加工、修飾及合理的空間折疊等功能，非常有利于真核基因的表達(dá)，能有效克服大腸埃希菌系統(tǒng)缺乏蛋白翻譯后加工、修飾的不足。為此本研究利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)M-IL-2(88Arg,125Ala)，并進(jìn)一步純化該融合蛋白，對其生物學(xué)活性進(jìn)行了初步研究，為大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)M-IL-2(88Arg,125Ala)及其抗腫瘤、抗病毒活性研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞株 重組質(zhì)粒pET/M-IL-2(88Arg,125Ala)，大腸埃希菌DH5α均由本室保存。P.pastoris分泌表達(dá)載體pPICZα A、宿主菌KM71H(muts)購自Invitrogen公司。 人卵巢癌細(xì)胞SKOV3及Hela細(xì)胞由本室保存。

1.1.2 其他試劑EcoR I內(nèi)切酶、KpnI內(nèi)切酶、SacI內(nèi)切酶、T4 DNA Ligase 購自NEB公司；Taq聚合酶購自TaKaRa公司。質(zhì)粒提取試劑盒、切膠回收試劑盒購自康維公司；ZeocinTM抗生素購自Solarbio公司；兔抗人白介素2抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG購自北京博奧森生物技術(shù)公司；YNB、山梨醇、生物素等購自Solarbio公司。CCK-8溶液購自SAB；改良型細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI-1640購自賽默飛公司。

1.2方法

1.2.2 目的基因擴(kuò)增及載體構(gòu)建 通過引物P1、P2，以重組質(zhì)粒pET/M-IL-2(88Arg,125Ala)為模板擴(kuò)增目的基因(圖1),EcoR I、KpnI對PCR擴(kuò)增出的目的基因M-IL-2(88Arg,125Ala)及表達(dá)質(zhì)粒pPICZα A分別進(jìn)行雙酶切后，T4 DNA連接酶連接為重組表達(dá)載體pPICZα A/M-IL-2(88Arg,125Ala)。

1.2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5αCaCl2法制備大腸埃希菌感受態(tài)，化學(xué)法將重組質(zhì)粒pPICZα A/M-IL-2(88Arg,125Ala)、空質(zhì)粒pPICZα A轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌DH5α，37 ℃溫育1 h, 50、100、200 μL涂布含25 μg/mL ZeocinTM抗生素的低鹽LB培養(yǎng)基(LLB+Z)篩選陽性菌株，提取重組質(zhì)粒、空質(zhì)粒，經(jīng)EcoR I、KpnI雙酶切鑒定，并將重組質(zhì)粒送測序。

1.2.4 畢赤酵母KM71H的電擊轉(zhuǎn)化及陽性菌株的篩選 用SacI單酶切重組表達(dá)載體pPICZα A/M-IL-2(88Arg,125Ala)、空表達(dá)載體pPICZα A。回收線性化的質(zhì)粒5～10 μg，于1.5 kV，200 Ω，25 μF，8 ms條件進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母KM71H感受態(tài)后，立即向點(diǎn)擊杯中加入1 mL 1 mol/L的預(yù)冷山梨醇，30 ℃溫育1 h，分別50、100、200 μL涂布于含有100 μg/mL ZeocinTM的YPDS平板上(YPDS+Z)，30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d。將長出的菌株依次接種至含100、200、300 μg/mL ZeocinTM的YPD平板上，30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，篩選多拷貝菌株。

圖1 M-IL-2(88Arg, 125Ala) 基因序列Fig.1 The sequence of M-IL-2(88Arg, 125Ala)

1.2.5 重組酵母的PCR鑒定 利用玻璃珠破碎法提取重組有pPICZα A/M-IL-2(88Arg,125Ala)、pPICZα A重組酵母基因組及KM71H酵母基因組DNA，分別用AOX1通用引物(5′AOX1: GACTGGTTCCAATTGACAAGC，3′AOX1：GCAAATGGC ATTCTGACATCC)及M-IL-2(88Arg,125Ala)引物P1、P2兩對引物檢測外源基因的整合情況。

1.2.6 甲醇誘導(dǎo)表達(dá) 按畢赤酵母表達(dá)手冊方法[15]，從含300 mg/mL ZeocinTM的YPD平板上挑去多拷貝轉(zhuǎn)化菌單菌落，接種至100 mL新鮮的BMGY培養(yǎng)基中，28～30 ℃，250 r/min條件下振蕩培養(yǎng)18～24 h至OD600=2～6，收集菌液，3 000×g離心5 min，去除上清培養(yǎng)基，替換為20 mL BMMY培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為8層滅菌紗布封口，28 ℃，250 r/min振蕩培養(yǎng)。每24 h補(bǔ)加甲醇至終濃度為0.5%，連續(xù)誘導(dǎo)72 h后，收集菌液，離心，將上清及沉淀分別置于-80 ℃保存。

1.2.7 優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)時間及表達(dá)量測定 挑取陽性克隆接種于100 mL新鮮的BMGY培養(yǎng)基中，28～30 ℃，250 r/min條件下振蕩培養(yǎng)18～24 h至OD600=2～6，收集菌液，離心，去上清，用20 mL BMMY替換，繼續(xù)培養(yǎng)，每24 h添加100%甲醇至終濃度為0.5%。每24 h吸取1 mL菌液，離心，取上清進(jìn)行 SDS-PAGE，同時BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。

1.2.8 TCA沉淀、SDS-PAGE及Western blot檢測表達(dá)產(chǎn)物 取200 μL表達(dá)酵母上清經(jīng)TCA法濃縮，加20 μL超純水溶解， 加20 μL載樣緩沖液，沸水浴5 min，加樣至聚丙烯酰胺凝膠中，跑電泳。同樣，取適量誘導(dǎo)產(chǎn)物電泳后，將帶有目的條帶的凝膠切下，經(jīng)電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉3 h，羊抗人IL-2多抗封閉過夜，二抗辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG封閉2 h，每次換封閉液時用TBST清洗3次，每次10 min?；瘜W(xué)發(fā)光試劑盒處理，在VILBER熒光凝膠成像儀中觀察結(jié)果。

1.2.9 表達(dá)產(chǎn)物的純化 將高表達(dá)菌體誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE及BCA法測試蛋白濃度得出在誘導(dǎo)96 h目的蛋白表達(dá)量達(dá)到最高峰，將誘導(dǎo)96 h表達(dá)上清過濾除去菌體殘渣，經(jīng)硫酸銨分級沉淀，將沉淀物重溶再經(jīng)透析法透析，最后產(chǎn)物經(jīng)Ni+親和層析法純化，經(jīng)0.5 mol/L NaCl，0.02 mol/L PBS(pH 7.4)平衡液平衡Ni-瓊脂糖凝膠6FF，分別用50、100、200、300、400 mmol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl，0.02 mol/L PBS(pH 7.4)洗脫液洗脫，收集各個洗脫峰，經(jīng)SDS-PAGE鑒定分析目的蛋白所在洗脫峰。收集的目的蛋白經(jīng)Millipore超濾管濃縮目的蛋白，-80 ℃保存，用于分析鑒定及生物活性研究。

1.2.10 融合蛋白對人卵巢癌細(xì)胞SKOV3生長增殖的作用 參考文獻(xiàn)[13]，以人卵巢癌細(xì)胞SKOV3為實(shí)驗(yàn)對象，分別加入不同濃度梯度的純化的融合蛋白(40、60、80、100、120、140 mg/L濃度各1份)，以0.01 mol/L PBS(pH 7.2～7.4)作為陰性對照，反應(yīng)體系為100 μL，每一濃度設(shè)6個復(fù)孔，設(shè)3塊96孔板，分別培養(yǎng)24、48、72 h。在3個時間點(diǎn)分別加入CCK-8試劑檢測細(xì)胞增殖作用。

1.2.11 融合蛋白對Hela細(xì)胞生長增殖的作用 參考文獻(xiàn)[13]，以Hela細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象，分別加入不同濃度梯度的純化的融合蛋白(2.5、5、10、20、40 mg/L 濃度各1份)，以阿霉素作為陽性對照，以0.01 mol/L PBS(pH 7.2～7.4)作為陰性對照，反應(yīng)體系為100 μL，每一濃度設(shè)6個復(fù)孔，培養(yǎng)72 h。加入CCK-8試劑檢測細(xì)胞增殖作用。根據(jù)以下公式計算融合蛋白對細(xì)胞的抑制率：細(xì)胞生長抑制率=1-(融合蛋白OD/陰性對照OD)。

2 結(jié)果與分析

2.1重組酵母的表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

圖2 質(zhì)粒pPICZα A圖譜(A)重組質(zhì)粒pPICZα A/M-IL-2(88Arg, 125Ala) (B)構(gòu)建過程Fig.2 The map of vector pPICZα A (A) Construction of the secreted expression vector pPICZαA/M-IL-2(88Arg, 125Ala) (B)

重組質(zhì)粒構(gòu)建策略如圖2。用設(shè)計的引物P1、P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因，將擴(kuò)增的條帶插入酵母表達(dá)載體pPICZα A(圖2A)中，重組質(zhì)粒以EcoR I、KpnI雙酶切，電泳顯示重組質(zhì)粒酶切出現(xiàn)2條帶，且插入片段長度約為500 bp，與理論值一致(圖3)。同時提取重組質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司測序，測序結(jié)果與理論一致，無堿基突變。

圖3 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果Fig.3 Identification of recombinant expression vector by EcoR I and Kpn I digestion

1：EcoR I 和KpnI 雙酶酶切空質(zhì)粒pPICZα A；2：EcoR I 和KpnI雙酶酶切重組質(zhì)粒pPICZαA/M-IL-2(88Arg,125Ala) ; M: DL 2000分子量標(biāo)準(zhǔn)

1: pPICZα A digested withEcoR I andKpnI; 2: recombinant clones digested withEcoR I andKpnI; M: DNA marker DL 2000

2.2重組酵母菌的鑒定

轉(zhuǎn)化的陽性菌株經(jīng)ZeocinTM梯度篩選，獲得多拷貝陽性菌株，提取重組有pPICZα A/M-IL-2(88Arg,125Ala)、pPICZα A重組酵母基因組及KM71H酵母基因組DNA，經(jīng)PCR鑒定結(jié)果見圖4，從圖4中可以看出，轉(zhuǎn)化有空質(zhì)粒的KM71H DNA 以P1、P2為引物PCR鑒定沒有產(chǎn)生條帶；以 5′AOX1、3′AOX1為引物PCR鑒定的目的條帶約590 bp。轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的KM71H DNA 以P1、P2為引物PCR鑒定的目的條帶約500 bp；以 5′AOX1、3′AOX1為引物PCR鑒定的目的條帶約為1.1 kb，與理論一致。

圖4 重組酵母PCR鑒定

1：以5′AOX1 和3′AOX1為引物 KM71H DNA為模板擴(kuò)增目的基因；2：以P1和P2為引物KM71H DNA為模板擴(kuò)增目的基因；3：以P1和P2為引物KM71H/pPICZα A DNA為模板擴(kuò)增目的基因；4：以5′AOX1和3′AOX1為引物KM71H/pPICZα A DNA為模板擴(kuò)增目的基因；5：以P1和P2為引物KM71H/pPICZα A/M-IL-2(88Arg,125Ala) DNA為模板擴(kuò)增目的基因；6：以5′AOX1和3′AOX1為引物KM71H/pPICZα A/M-IL-2(88Arg,125Ala) DNA為模板擴(kuò)增目的基因；M: DL 2000分子量標(biāo)準(zhǔn)

1: KM71H DNA PCR by 5′AOX1 and 3′AOX1; 2: KM71H DNA PCR by P1 and P2; 3: KM71H/pPICZα A DNA PCR by P1 and P2; 4: KM71H/pPICZα A DNA PCR by 5′AOX1 and 3′AOX1; 5: KM71H/pPICZα A/M-IL-2(88Arg,125Ala) DNA PCR by P1 and P2; 6: KM71H/pPICZα A/M-IL-2(88Arg,125Ala) DNA PCR by 5′AOX1 and 3′AOX1; M: DL2000

2.3表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測及濃度測定

圖5 96 h重組酵母菌株酵母培養(yǎng)基上清液SDS-PAGEFig.5 SDS-PAGE analysis of 96 h culture supernatant of KM71H/pPICZα A/M-IL-2(88Arg, 125Ala)

1：KM71H/pPICZα A表達(dá)上清樣品；2：KM71H/pPICZα A/M-IL-2(88Arg,125Ala)表達(dá)上清樣品；3：KM71H上清樣品；M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1: culture supernatant sample from KM71H/pPICZα A; 2: culture supernatant sample from KM71H/pPICZα A/M-IL-2(88Arg,125Ala); 3: culture supernatant sample from KM71H; M: protein Marker

考馬斯亮藍(lán)染色電泳圖(圖5)顯示，KM71H轉(zhuǎn)化重組子在26 ku左右表達(dá)出特異性條帶，而未轉(zhuǎn)化的菌株及轉(zhuǎn)化了空載體的酵母菌株均未有特異條帶產(chǎn)生。圖6A顯示每24 h KM71H/pPICZα A/M-IL-2(88Arg,125Ala) 重組酵母菌株表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE。經(jīng)BCA法檢測(圖6B)分泌蛋白表達(dá)量隨培養(yǎng)時間增加而上升(P<0.05)，在96 h時達(dá)到最高峰。因此判斷最佳誘導(dǎo)表達(dá)時間為96 h，分泌蛋白總濃度達(dá)到435.3 mg/L，經(jīng)灰度軟件Image J分析，目的蛋白占分泌總蛋白的72.4%，即在誘導(dǎo)表達(dá)時間為96 h時，畢赤酵母分泌目的蛋白濃度為315.2 mg/L。

圖6 分泌蛋白與誘導(dǎo)時間關(guān)系Fig.6 The relatronship of secretory proteins with induction time

1：0 h 分泌上清液樣品；2：24 h 分泌上清液樣品；3：48 h分泌上清液樣品；4：72 h分泌上清液樣品；5：96 h分泌上清液樣品；6:120 h 分泌上清液樣品；M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1: 0 h culture supernatant; 2: 24 h culture supernatant; 3: 48 h culture supernatant; 4: 72 h culture supernatant; 5: 96 h culture supernatant ; 6: 120 h culture supernatant; M: protein Marker

2.4Westernblot鑒定目的蛋白

將位于26 ku左右的蛋白條帶切下，用羊抗人IL-2多克隆抗體進(jìn)行Western blot分析鑒定，圖7結(jié)果顯示，融合蛋白能與羊抗人IL-2多抗反應(yīng)結(jié)合，具有特異性和抗原活性。

圖7 融合蛋白的Western blot鑒定

1：融合蛋白M-IL-2(88Arg,125Ala)樣品；2：陰性對照

1: M-IL-2(88Arg,125Ala) fusion protein；2: negative control

2.5目的蛋白純化

陽性重組酵母KM71H經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)96 h，收集菌液上清，硫酸銨分級沉淀法初步純化分泌蛋白(30%、80%)，目的蛋白M-IL-2(88Arg,125Ala)在硫酸銨80%飽和度析出；經(jīng)透析、鎳離子親和層析得到純化目的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分析(圖8)， 目的蛋白在200 mmol/L咪唑+PBS(pH 7.4)處可被洗脫。經(jīng)Image J軟件進(jìn)行灰度分析，融合蛋白純度達(dá)到99%。純化的M-IL-2(88Arg，125Ala)經(jīng)millipore濃縮至2 mL。BCA法檢測濃縮后融合蛋白濃度為273.5 mg/L。

圖8 純化后目的蛋白M-IL-2(88Arg, 125Ala) SDS-PAGE

1：純化后融合蛋白M-IL-2(88Arg,125Ala)樣品；M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1: purified M-IL-2(88Arg,125Ala); M: protein Marker

2.6融合蛋白對人卵巢癌細(xì)胞SKOV3生長抑制作用

如圖9所示，融合蛋白對人卵巢癌細(xì)胞SKOV3有明顯的生長抑制作用。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，融合蛋白抑制率40 mg/L和60 mg/L比較，沒有顯著性，P>0.05。在60 mg/L后，隨濃度升高和作用時間的延長，抑制率提高，其抑制作用具有濃度和時間顯著性(P<0.05)。

圖9 融合蛋白M-IL-2(88Arg, 125Ala)抑制人卵巢癌細(xì)胞SKOV3生長增殖關(guān)系曲線Fig.9 Effect of M-IL-2(88Arg, 125Ala) fusion protein on ovarian cancer SKOV3 cells

2.7融合蛋白對Hela細(xì)胞生長抑制作用

融合蛋白不同濃度(2.5、5、10、20、40 mg/L)處理Hela 細(xì)胞，分別作用24、48及72 h后檢測Hela增長率表明，在所有濃度下，作用72 h時抑制效果最佳。因此在以后的檢測中，只檢測不同濃度融合蛋白作用72 h時對Hela細(xì)胞的抑制作用。 如圖10所示，融合蛋白對Hela 細(xì)胞生長具有明顯的抑制作用，且在10、20、40 mg/L濃度下與阿霉素作用相比P<0.05，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖10 融合蛋白M-IL-2(88Arg，125Ala)抑制Hela細(xì)胞生長增殖關(guān)系曲線Fig.10 Effect of M-IL-2(88Arg，125Ala) fusion protein on Hela cells

3 討 論

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是應(yīng)用最為廣泛的酵母表達(dá)系統(tǒng)，近年來發(fā)展迅速，目前國內(nèi)外已利用該系統(tǒng)表達(dá)了一系列重要具有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)，如白細(xì)胞介素2(IL-2)[9]、CTLA-4[16]、內(nèi)毒素中和蛋白[17]、甘油激酶[18]、融合蛋白rhIL-2-HSA[19]等。畢赤酵母能夠廣泛應(yīng)用，原因在于其具有以下優(yōu)點(diǎn)：具有目前最強(qiáng)，調(diào)控機(jī)理最嚴(yán)格的啟動子之一醇氧化酶AOX1基因啟動子；表達(dá)質(zhì)粒能在基因組的特定位點(diǎn)以單拷貝或多拷貝的形式穩(wěn)定整合； 菌株易于進(jìn)行高密度發(fā)酵，外源蛋白表達(dá)量高；畢赤酵母中存在過氧化物酶體，表達(dá)的蛋白貯存其中，可免受蛋白酶的降解，而且減少對細(xì)胞的毒害作用；高效分泌表達(dá)質(zhì)粒能將外源蛋白表達(dá)后，進(jìn)行翻譯后加工處理，將外源蛋白分泌到細(xì)胞外，不但提高表達(dá)蛋白的活性，而且有利于產(chǎn)物的純化；菌株易于進(jìn)行高密度發(fā)酵，外源蛋白表達(dá)量高，適于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。

本研究首次成功地在畢赤酵母系統(tǒng)中分泌表達(dá)了具有抗腫瘤活性的融合蛋白M-IL-2(88Arg,125Ala)。經(jīng)過5 d連續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)，通過BCA法測定每24 h蛋白表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)隨著誘導(dǎo)時間的延長，M-IL-2(88Arg,125Ala)在酵母上清中含量呈上升趨勢，表明該融合蛋白穩(wěn)定性較好。本研究中該融合蛋白在0.5%甲醇誘導(dǎo)、8層紗布封口、28 ℃、250 r/min條件下?lián)u瓶表達(dá)量達(dá)到了315.2 mg/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于目前大腸埃希菌表達(dá)水平，如果使用發(fā)酵罐表達(dá)，預(yù)期目的蛋白表達(dá)量將會進(jìn)一步提高。

在大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)中，該目的蛋白占蛋白總量36%，而本研究中M-IL-2(88Arg,125Ala)的含量占酵母分泌蛋白總量的72.4%左右，優(yōu)于大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)。酵母菌自身分泌蛋白少，給下游純化帶來了極大的方便。本實(shí)驗(yàn)采用硫酸銨分級沉淀、透析法、鎳離子親和層析的純化流程對目的蛋白進(jìn)行純化，純化工藝相對簡單，避免了多步層析對蛋白量及蛋白活性的損害，目的蛋白純度達(dá)到99%。將不同濃度的純化的融合蛋白對人卵巢癌細(xì)胞SKOV3及Hela細(xì)胞進(jìn)行直接作用，CCK-8法檢測細(xì)胞增殖率，表明M-IL-2(88Arg,125Ala)對卵巢癌細(xì)胞SKOV3細(xì)胞生長和Hela細(xì)胞具有明顯生長抑制作用，且抑制效率遠(yuǎn)高于該融合蛋白在大腸埃希菌中表達(dá)后檢測的結(jié)果[11-13]。

通過以上分析，本研究成功利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)了具有抗腫瘤活性的融合蛋白M-IL-2(88Arg,125Ala)，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)活性，用于動物實(shí)驗(yàn)以及抗腫瘤、抗病毒感染等研究奠定了基礎(chǔ)。

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Expression&AntitumorActivityofFusionProteinM-IL-2(88Arg,125Ala)inPichiapastoris

LI Lin, QIAN Dong-meng, SHAO Guang-can, YAN Zhi-yong, SONG Xu-xia, CHEN Hao, WANG Bin

(Teach. &Res.Div.ofPathog.Biology,QingdaoUni.Med.Coll.,Qingdao266071)

Pichiapastorisexpression vector of excretive type pPICZα A/M-IL-2(88Arg,125Ala) was constructed by fusion gene melittin and human metamer interleukin 2(M-IL-2(88Arg,125Ala)) inP.pastoris, and transformedP.pastorisstrain KM71H, methanol-induced and screened out a multicopy positive expression fusion protein, purified the fusion protein, and carried out initial study on its antitumor activity. It was identified through sequencing and PCR thatM-IL-2(88Arg,125Ala) was correctly inserted into pPICZαA and after electro-transformation, the recombinant vector was integrated into the genome of the yeast through homologous recombination, and it was tested by SDS-PAGE that there was an obvious band of 26 ku that accorded with theory. It had fairly high antigenicity and specificity through Western blot. The methanol-induced for 96 h protein expression was as high as 315.2 mg/L through BCA testing method. The fusion protein was tested by CCK-8 method for its inhibition against human oophocarcinoma cell SKOV3 and HeLa cell, suggested that the purified fusion protein could in vitro inhibit the growth and proliferation of oophocarcinoma cell SKOV3 and HeLa cell. The study had laid a foundation for large-scale preparation of fusion protein of M-IL-2(88Arg,125Ala) and animal experiment as well as early stage of clinical research.

M-IL-2(88Arg,125Ala);Pichiapastoris; expression; purification; antitumor activity

山東省科技攻關(guān)項目(2007GG3WZ05009)；山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎勵基金(BS2011SW005)

李林 女，碩士研究生。主要從事病毒基因工程與蛋白質(zhì)組學(xué)研究。Tel：0532-83780059，E-mail: linzi211@126.com

* 通訊作者。男，博士，博士生導(dǎo)師。研究方向?yàn)椴《净蚬こ膛c蛋白質(zhì)組學(xué)研究。Tel：0532-83780032，E-mail: qdmblm@163.com

2013-11-04；

2013-11-14

Q789

A

1005-7021(2014)02-0047-07

10.3969/j.issn.1005-7021.2014.02.010