乳腺癌RCL、TAOK1、14-3-3 zeta、ZNF706蛋白表達的臨床病理意義

凌人，凌今，倪型灝，薛洪燕，施紅旗，陳仲華

（1.金華廣福腫瘤醫(yī)院 病理科，浙江 金華 321001；2.復旦大學 藥學院，上海 201203；3.浙江省腫瘤醫(yī)院 病理科，浙江 杭州 310001；4.金華市人民醫(yī)院 病理科，浙江 金華 321001；5.金華市中心醫(yī)院 病理科，浙江 金華 321001）

乳腺癌是一種遺傳異質性的惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展是一個多因素多階段的過程，往往涉及多個基因的改變[1]。以腫瘤生物學指標（包括ER、PR、HER2等）為依據(jù)的基因分型，不僅能夠判斷腫瘤的預后及轉移，還能預測腫瘤對治療的敏感性，并為腫瘤個體化治療提供依據(jù)[2-3]。然而，乳腺癌相關的癌基因遠不止這些，本研究通過對前期篩查與乳腺癌相關的4個新基因—RCL、TAOK1、14-3-3 zeta、ZNF706在乳腺癌中的表達情況進行檢測、分析，旨在探討這4個基因與乳腺癌臨床特征的關系，為臨床診治提供新的參考。

1 資料和方法

1.1 一般資料 標本取自2008年1月-2011年12月間在金華廣福腫瘤醫(yī)院接受手術治療的60例乳腺癌患者，均為女性，中位年齡53歲（38～82歲），術前均未做放化療以及內分泌治療，有完整的臨床資料。研究對象確診為浸潤性導管癌，參照WHO乳腺腫瘤組織學分類，術后根據(jù)患者臨床分期、病理分型進行化療及輔助內分泌治療，對于有淋巴結轉移且直徑5 cm以上者予以放療。

1.2 主要試劑和儀器 兔抗人RCL、TAOK1、14-3-3 zeta、ZNF706一抗以及對應二抗均購自美國Abcam公司?？贵w稀釋工作液、DAB顯色試劑盒購自Leica公司。免疫組織化學全自動染色儀為Leica公司的BOND-MAX。

1.3 實驗方法

1.3.1 標本：取上述存檔的石蠟包埋組織塊，連續(xù)切片，每份標本行常規(guī)HE染色對照。

1.3.2 免疫組織化學染色：采用S-P法[4]，結合預實驗確定的條件進行染色。石蠟組織切片脫蠟、水化后滅活內源性過氧化物酶，其中RCL、ZNF706組切片高壓抗原熱修復1 min，TAOK1、14-3-3 zeta組切片不修復，PBS溶液清洗，10%正常羊血清封閉30 min，傾去血清再滴加一抗（稀釋度：RCL 1∶100，TAOK1 1∶200，14-3-3 zeta 1∶100，ZNF706 1∶200）室溫下孵育120 min，二抗室溫下孵育30 min，加入顯色液顯色。蘇木素復染、脫水、分色、透明、中性樹膠封片。免疫組織化學染色由Leica全自動免疫組織化學染色儀完成。

1.3.3 質量控制：①做好預實驗，選擇最佳免疫組織化學條件。②對照設置：以說明書指定的組織切片染色陽性片為陽性對照，以普通羊血清代替一抗為陰性對照。③判定程序：連續(xù)10個高倍鏡視野下分別計數(shù)100個細胞，觀察各抗體的細胞定位，以定位處出現(xiàn)棕黃色顆粒狀染色為陽性表現(xiàn)，觀察染色強度并計數(shù)染色比例。④免疫組織化學染色結果判讀由2位病理科主治以上級別醫(yī)師在雙盲條件下獨立完成，判讀不一致時，經多鏡頭顯微鏡下討論得出一致結論。

1.3.4 判定標準：根據(jù)2009年版乳腺癌HER2檢測指南判定。強陽性染色（+++）：染色深，且染色細胞比例超過50%者；陽性染色（++）：染色強度中等，且染色細胞比例25%～50%者；弱陽性染色（+）：染色較淺，且染色細胞比例10%～25%者；陰性染色（-）：定位處沒有染色，或者染色細胞比例＜10%者。

1.4 臨床資料分類 乳腺癌病患分類分級采用國際抗癌聯(lián)盟UICC和美國癌癥聯(lián)合委員會AJCC制定的TNM分期第6版方法。

1.5 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件。計數(shù)資料采用卡方檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 免疫組織化學染色結果 RCL表達為胞漿染色，鏡下呈均勻一致細顆粒狀，偶見胞膜胞核染色，呈灶性或多點散在分布。RCL在內對照中多為弱表達（+）或不表達（-），乳腺癌組織內表現(xiàn)為強表達（++～+++），見圖1?？傮w強表達率為85%（51/60），其在癌組織與內對照中的表達差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.001，見表1）。

TAOK1表達為胞漿著色，鏡下呈均勻一致的棕黃色細顆粒狀，偶見胞膜線性著色。TAOK1在內對照中多不表達（-），乳腺癌組織內表達強弱不等（+～+++），見圖1?？傮w表達率為90%（54/60），其在癌組織與內對照中的表達差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.001，見表1）。

14-3-3 zeta表達為胞漿著色，鏡下呈均勻一致的棕黃色細顆粒狀。TAOK1在內對照中多不表達（-），乳腺癌組織內表達強弱不等（+～+++），見圖1?？傮w表達率為80%（48/60），其在癌組織與內對照中的表達差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.001，見表1）。

ZNF706表達為胞核著色為主，偶見胞漿染色，染色中等到弱。ZNF706在內對照中多不表達（-），乳腺癌組織內表達強弱不等（+～+++），見圖1?？傮w表達率為83%（50/60），其在癌組織與內對照中的表達差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.001，見表1）。

圖1 免疫組織化學法檢測RCL、TAOK1、14-3-3 zeta、ZNF706的表達情況（低倍鏡：×100，高倍鏡：×400）

表1 RCL、TAOK1、14-3-3 zeta、ZNF706的基因蛋白表達與乳腺癌及癌旁組織表達比較（n=60）

2.2 4個新靶基因的表達與臨床病理因素的相關性本研究進一步對RCL、TAOK1、14-3-3 zeta、ZNF706在乳腺癌組織中的表達情況與患者臨床病理資料進行歸類，通過對其表達情況與各臨床病理因素的統(tǒng)計學分析得出：RCL的表達在不同腫瘤大?。≒=0.012）、病理分級（P=0.044）之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與年齡、有無淋巴結轉移無關（P＞0.05）；TAOK1、14-3-3 zeta的表達與年齡、腫瘤大小、病理分級、有無淋巴結轉移均無關（P＞0.05）；ZNF706的表達與淋巴結轉移（P=0.001）有關（P＜0.05），與年齡、腫塊大小、病理分級無關（P＞0.05）。見表2。

2.3 4個新靶基因的表達與乳腺癌分子分型標志物的相關性 ER、PR、HER2、Ki67是乳腺癌分子分型的重要依據(jù)，本研究對樣本標志物的表達與本課題研究的新基因表達進行了統(tǒng)計分析，結果顯示：RCL的表達與Ki67高低[5]之間的差異有統(tǒng)計學意義（P=0.032），Ki67≥14組中RCL表達強陽性明顯增多；TAOK1的表達與ER、HER2表達之間差異均有統(tǒng)計學意義（P=0.031、P=0.04），ER（-）組中TAOK1表達升高，在HER2（+）中表達亦增多；14-3-3 zeta和ZNF706的表達分別與ER的表達差異有統(tǒng)計學意義（P=0.01、P=0.038），在ER（+）組中14-3-3 zeta和ZNF706均呈高表達。見表3。

表2 RCL、TAOK1、14-3-3 zeta、ZNF706的蛋白表達與臨床病理指標的關系

表3 RCL、TAOK1、14-3-3 zeta、ZNF706的表達與乳腺癌分子分型標志物的關系

3 討論

隨著腫瘤分子標志物研究的不斷深入，越來越多的標志物被逐步發(fā)現(xiàn)，它們與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系，其表達的改變在協(xié)助診斷疾病、指導臨床治療方面有著重要價值。近年來，除對乳腺癌進行傳統(tǒng)的組織學分類以外，根據(jù)分子標志物表達的不同，還可以將其分為4個分子亞型：luminal A型、luminal B型、HER2型、基底樣/三陰性乳腺癌[6]。臨床上雖然對已分型的各個亞型制定了有針對性的治療方案，然而，乳腺癌癌基因的研究仍不夠透徹，導致亞型分類不完善，同亞型的患者預后和對藥物的敏感性依然存在差異，這大大阻礙了乳腺癌個性化治療的開展[7]。因此，探尋乳腺癌中新的分子標志物，更加科學地實施個性化診療顯得意義重大。

目前，在乳腺癌中已發(fā)現(xiàn)多種成熟的分子標志物，包括HER2、ER、PR、Ki67等。其中HER2被認為是乳腺癌細胞增殖的驅動基因，其高表達往往提示不良預后。研究表明，在乳腺癌中HER2和ETV1可以協(xié)同上調RCL的表達[8]；同時RCL是C-MYC反應基因，其反應產物參與嘌呤或嘧啶補救合成、糖酵解和血管形成，因此與乳腺癌的進展高度相關[9]。在Oncomine數(shù)據(jù)庫中，RCL表達在7個不同類型的腫瘤（淋巴瘤、結腸癌、腦腫瘤、肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、白血病）中表達上調，也同樣表明RCL廣泛參與腫瘤形成。本研究顯示RCL在乳腺癌組織中顯著高表達，且高表達組中腫瘤大小、病理分級、Ki67明顯增大，提示RCL在乳腺癌分化、增殖進展中發(fā)揮重要作用。RCL的強表達提示乳腺癌分化低、惡性程度高，預后較差，其與腫瘤的轉移并無明顯相關性。本研究結果與先前的研究結果基本一致。然而在本研究中未發(fā)現(xiàn)RCL與HER2基因之間存在聯(lián)系，這可能是由于RCL的強表達是由ETV1和HER2共同控制上調所引起的，具體機制需進一步深入研究。

有絲分裂元激活蛋白激酶（metogen-activated protein kinases，MAPK）通路是促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的又一重要信號通路。MAPK可經Ras通路磷酸化激活，提高乳腺癌細胞的增殖和侵襲能力。TAOK1處于p38MAPK上游，其可通過磷酸化MKK3進一步激活p38MAPK，調節(jié)核內轉錄因子，介導細胞增殖、分化、抑制凋亡[10]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，TAOK1在乳腺癌組織中高表達，暗示其與乳腺癌之間存在聯(lián)系。然而TAOK1與患者臨床病理因素之間并無相關性，可能是由于本研究中樣本量較少，或是TAOK1信號調控并不占據(jù)主要地位[11]。

14-3-3 zeta蛋白是細胞調控的又一重要信號分子，作用包括：抑制整個細胞周期進程，造成G1/S、G2/M阻滯；作用于多種細胞因子受體，參與信號轉導及轉錄的調控；通過對MAPK、Bcl-2和凋亡相關激酶調控參與細胞凋亡過程[12]。有研究表明，14-3-3 zeta在多種癌癥中高表達，若敲除人肺腺癌A549細胞的14-3-3 zeta基因，可以恢復癌細胞對失巢凋亡的敏感性，控制癌細胞生長，說明14-3-3 zeta高表達可以通過抑制凋亡來促進癌癥進展。國外學者研究發(fā)現(xiàn)，14-3-3 zeta在乳腺癌中高表達與內分泌治療的耐藥相關，14-3-3 zeta高表達的患者在進行內分泌治療后耐藥率顯著高于低表達組[13]。在本實驗中，14-3-3 zeta在乳腺癌組織中顯著高表達，然而統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)其與臨床病理因素無明顯相關，推測其與腫瘤分化、進展無直接聯(lián)系，不能提示預后。14-3-3 zeta在ER（+）組中表達顯著高于ER（-）組，提示14-3-3 zeta在乳腺癌中的上調可能受到激素影響，進一步分析14-3-3 zeta（+）和ER（+）的患者內分泌治療的預后可能會得到其與內分泌治療抵抗的相關性結論，這將成為本課題組后續(xù)研究的一個方向。

ZNF706是一種結構蛋白，屬于鋅指蛋白家族中的成員，它與表觀遺傳以及核信號轉錄相關。國內外對于ZNF706的研究均較少，其具體功能未知。近期基因組學研究發(fā)現(xiàn)，ZNF706在胃癌和肝癌中的基因拷貝數(shù)和表達上調，這些結果提示ZNF706與癌癥相關[14-15]。本課題對ZNF706在乳腺癌中的臨床病理意義進行了初步探討，發(fā)現(xiàn)ZNF706在內對照中表達少，而在乳腺癌組織中廣泛表達，且統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)表達與腫瘤轉移、ER（+）有關，提示ZNF706與乳腺癌轉移存在一定聯(lián)系，可能成為新的乳腺癌轉移風險評估的新指標。

綜上所述，本實驗對于乳腺癌組織中RCL、TAOK1、14-3-3 zeta、ZNF706蛋白表達情況進行了初步研究，這4種蛋白表達與乳腺癌密切相關，其中RCL、ZNF706分別與腫瘤大小、病理分級、有無淋巴結轉移存在關聯(lián)，對于乳腺癌的風險評估具有一定的臨床意義。未來希望能深入論證這4種蛋白在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中扮演的角色，為乳腺癌的預后評估、治療的新方向提供理論依據(jù)。