艾納香的組織培養(yǎng)

嚴(yán)敏+劉艷+湯洪敏

摘要：以貴州藥用植物艾納香的葉片為材料，MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，探討影響艾納香組織培養(yǎng)的因素，為艾納香的組織培養(yǎng)快速繁殖提供重要的參考依據(jù)。結(jié)果表明：外植體滅菌組合以0.1%氯化汞8 min+75%乙醇5 s最佳；誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基以MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L最佳，誘導(dǎo)率為88.17%；愈傷組織繼代培養(yǎng)基以MS+6-BA 3.0 mg/L+ NAA 0.1 mg/L最佳；愈傷組織分化為芽的培養(yǎng)基以MS+6-BA 3.0mg/L+ NAA 0.1mg/L最佳，以試管苗（由野外艾納香培育出的完整幼苗）葉片為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，其分化率為93%；芽繼代培養(yǎng)基以MS+6-BA 3.0 mg/L+ NAA 0.1 mg/L最佳，平均苗高4.3 cm；IBA有利于艾納香的無(wú)根綠苗生根，以MS+IBA 1.4 mg/L 培養(yǎng)基培養(yǎng)，生根率為100%。

關(guān)鍵詞：艾納香；組織培養(yǎng)；愈傷組織；誘導(dǎo)；MS培養(yǎng)基

中圖分類號(hào)： Q943.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）02-0033-03

收稿日期：2013-07-12

基金項(xiàng)目：貴州省科技廳聯(lián)合課題（編號(hào)：黔科合J字LKM[2011]27、黔科合處G字[2011]7034號(hào)）。

作者簡(jiǎn)介：嚴(yán)敏（1973—），貴州印江人，碩士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)橹参锘瘜W(xué)。E-mail：577977087@qq.com。

通信作者：湯洪敏。E-mail：thm@gznc.edu.cn。艾納香（Blumea balsamifera DC）為菊科艾納香屬植物，在我國(guó)僅分布在貴州、云南、廣東、廣西等少數(shù)濕熱地區(qū)[1]。艾納香葉提取的揮發(fā)油有特殊的清香，具有顯著的抗菌、消炎、消腫、止痛、止癢等作用[2]。艾納香油的主要成分為L(zhǎng)-龍腦，主要用途之一是提制冰片（艾片），冰片具通竅、散熱、明目、止痛等功能。艾納香屬多年生宿根植物，主要以宿根分株繁殖，分生苗移栽成活率低；艾納香利用種子育苗，種子結(jié)實(shí)率低，休眠期長(zhǎng)，發(fā)芽率低于5.8%[3]。這些情況導(dǎo)致艾納香種苗短缺，嚴(yán)重制約艾納香大規(guī)模生產(chǎn)，因此必須研究艾納香的組織培養(yǎng)以快速獲得批量種苗，擴(kuò)大種植規(guī)模以滿足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)要求。國(guó)內(nèi)的報(bào)道主要著重在艾納香藥理研究上[4-5]，所以對(duì)艾納香進(jìn)行植物組織培養(yǎng)是一條全面研究艾納香的重要途徑。通過(guò)本項(xiàng)目的實(shí)施，以期為貴州省艾納香成功培育試管苗作參考，同時(shí)也可為貴州省其他特色藥用植物的組織培養(yǎng)快繁提供參考。

1材料與方法

1.1供試材料

來(lái)源于貴州省羅甸縣，由貴州大學(xué)林學(xué)院熊中華副教授鑒定。

1.2培養(yǎng)基

MS培養(yǎng)基；以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加激素、白砂糖30 g/L、瓊脂13 g/L。所有培養(yǎng)基均在 1.1 kg/cm2、121 ℃的滅菌鍋中滅菌25 min。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1艾納香外植體的滅菌處理將洗凈的外植體葉片用氯化汞和乙醇進(jìn)行不同滅菌劑、不同時(shí)間的比較試驗(yàn)及相同滅菌劑不同時(shí)間的比較試驗(yàn)，以篩選出外植體滅菌的最佳處理。

1.3.2艾納香的接種

1.3.2.1誘導(dǎo)接種將已沖洗的外植體放入超凈臺(tái)中，并將其滅菌，然后把葉片剪成大小為0.6 cm×0.6 cm的小塊，接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接種8塊葉片。

1.3.2.2愈傷組織繼代接種將由外植體誘導(dǎo)出的愈傷組織接種于繼代培養(yǎng)基中。

1.3.2.3愈傷組織分化接種將愈傷組織接入分化培養(yǎng)基中，分化出芽。

1.3.2.4芽繼代培養(yǎng)接種將分化出的芽切分，轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基，每瓶接5株左右。

1.3.2.5生根壯苗接種將繼代培養(yǎng)出的具有3 cm左右的芽剪下來(lái)，接種在生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。

1.3.3培養(yǎng)氣候條件誘導(dǎo)愈傷組織階段：將材料置于 25 ℃ 條件下培養(yǎng)，前5 d在黑暗條件下，之后每天接受自然光照。愈傷組織繼代、愈傷組織分化、芽繼代及生根壯苗階段：將材料置于25 ℃條件下培養(yǎng)，接受光照。

1.3.4NAA與6-BA對(duì)組織培養(yǎng)效果的影響以MS為基本培養(yǎng)基，探討不同濃度NAA與不同濃度6-BA組合對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織、愈傷組織繼代培養(yǎng)、愈傷組織分化、芽繼代的效果的影響。

1.3.5生根壯苗試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)材料為從艾納香葉片上誘導(dǎo)的芽。經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)可知，IBA 1.4 mg/L的生根效果較好[6]，所以生根培養(yǎng)基設(shè)計(jì)為MS+IBA 1.4 mg/L。

2結(jié)果與分析

2.1不同滅菌處理對(duì)艾納香外植體的滅菌效果

2.1.1單一滅菌劑的滅菌效果由表1、表2可知，單獨(dú)使用乙醇滅菌沒(méi)有效果，材料全部被污染。高濃度的氯化汞雖然能降低外植體的污染率，但是外植體褐化嚴(yán)重，難以誘導(dǎo)出愈傷組織。所以，單一滅菌劑對(duì)外植體的滅菌效果不佳。

2.1.2氯化汞和乙醇混合滅菌劑的滅菌效果從表3可知，最佳滅菌組合為0.1%氯化汞8 min+75%乙醇5 s。由于氯化汞對(duì)外植體的傷害大，難以誘導(dǎo)出愈傷組織，所以其濃度不宜增大，其作用時(shí)間也不宜延長(zhǎng)。因?yàn)橐掖紩?huì)使外植體褐化，影響外植體誘導(dǎo)成愈傷組織，甚至使外植體死亡，所以在能滅菌的情況下其作用時(shí)間越小越好。

2.2愈傷組織的誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1不同濃度NAA與相同濃度6-BA組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的效果由表4可知，NAA 0.1 mg/L+6-BA 3.0 mg/L培養(yǎng)基最適合艾納香誘導(dǎo)愈傷組織。

2.2.2不同濃度6-BA和與相同濃度NAA組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的效果由表5可知，6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L 培養(yǎng)基最適合艾納香誘導(dǎo)愈傷組織。

2.3愈傷組織的繼代培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1不同濃度NAA和與相同濃度6-BA配組對(duì)愈傷組織繼代培養(yǎng)的影響由表6可知，NAA 0.1 mg/L+6-BA 3.0 mg/L 處理的愈傷組織增殖倍數(shù)最高，為298倍，其褐化率也相對(duì)最低，所以NAA 0.1 mg/L+6-BA 3.0 mg/L為最佳繼代培養(yǎng)基。

2.3.2不同濃度6-BA和與相同濃度NAA配組對(duì)愈傷組織繼代培養(yǎng)的影響由表7可知，6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L 處理的愈傷組織增殖倍數(shù)最高，為3.2倍，為最適宜愈傷組織繼代培養(yǎng)的激素濃度

2.4愈傷組織的分化培養(yǎng)結(jié)果與分析

2.4.1不同濃度NAA和與相同濃度6-BA配組對(duì)愈傷組織分化的影響由表8可看出，隨著NAA濃度的提高，芽分化率呈先上升后下降的趨勢(shì)，褐化率隨之升高，只有在NAA 0.1 mg/L+6-BA 3.0 mg/L條件下，芽分化率最高，為4%。所以，只有添加適宜濃度的NAA，才能使芽分化率最大。

2.4.2不同濃度6-BA和與相同濃度NAA配組對(duì)愈傷組織分化的影響由表9可看出，隨著6-BA濃度的提高，芽分化率呈上升的趨勢(shì)，褐化率先降低后升高，只有在6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L處理時(shí)，芽分化率最高為4%。所以，只有添加適宜濃度的 6-BA，才能使芽分化率達(dá)到最大。

2.5芽繼代培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.5.1不同濃度NAA和與相同濃度6-BA配組對(duì)芽繼代的影響由表10可知，芽在繼代培養(yǎng)過(guò)程中，芽的增殖倍數(shù)差異不大；其平均苗高呈先升后降再升的趨勢(shì)。

2.5.2不同濃度6-BA和與相同濃度NAA配組對(duì)芽繼代培養(yǎng)的影響由表11可知，不同濃度的激素組合對(duì)芽繼代培養(yǎng)的情況不同，以MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 3.0 mg/L組合為最佳組合，平均苗高4.3 cm。

2.6生根壯苗的試驗(yàn)結(jié)果與分析

經(jīng)過(guò)生根培養(yǎng)基MS+IBA 1.4 mg/L 培養(yǎng)出來(lái)的幼苗，1個(gè)月后生根率為100%，平均根長(zhǎng)為4.3 cm，平均苗高為 7.4 cm。圖1為生根培養(yǎng)基MS+IBA 1.4 mg/L培養(yǎng)出來(lái)的幼苗。

3結(jié)論

本試驗(yàn)以艾納香葉片為材料，篩選出最佳滅菌劑組合及滅菌時(shí)間、誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基配方、愈傷組織繼代培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基配方、愈傷組織分化的最佳培養(yǎng)基配方、芽繼代的最佳培養(yǎng)基配方、生根壯苗的培養(yǎng)基配方。從外植體的滅菌到成為一株完整幼苗的過(guò)程中每一步都很重要，缺了任何一個(gè)步驟本試驗(yàn)都無(wú)法成功。本試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)外植體進(jìn)行滅菌的最佳組合為0.1%氯化汞 8 min+75%乙醇 5 s；單獨(dú)使用氯化汞或者乙醇對(duì)艾納香滅菌效果不好。不同濃度的激素組合對(duì)艾納香葉片誘導(dǎo)愈傷組織情況不同，以MS+ 6-BA 30 mg/L+NAA 0.1 mg/L組合為最佳組合，誘導(dǎo)率為8817%；不同濃度的激素組合對(duì)愈傷組織繼代培養(yǎng)的情況不同，以MS+6-BA 3.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L組合為最佳組合；不同濃度的激素組合處理的艾納香葉片愈傷組織分化為芽的情況不同，以MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L 組合為最佳組合，以野外艾納香葉片為外植體誘導(dǎo)出的愈傷組織分化率為4%；以試管苗（由野外艾納香培育出的完整幼苗）葉片為外植體誘導(dǎo)出的愈傷組織分化率為93%；不同濃度的激素組合處理的葉片的芽繼代培養(yǎng)情況不同，以MS+ 6-BA 3.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L 組合為最佳組合，平均苗高4.3 cm。IBA有利于艾納香的無(wú)根綠苗生根，以MS+IBA 1.4 mg/L 培養(yǎng)基培養(yǎng)的生根率為100%。

參考文獻(xiàn)：

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[2]貴州省衛(wèi)生廳.貴州省藥品標(biāo)準(zhǔn)[M]. 貴陽(yáng)：貴州人民出版社，1994：43.

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[5]許實(shí)波，趙金華. 艾鈉香二氫黃酮對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性肝損傷的保護(hù)作用[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，1998，14（2）：191-192.

[6]高山林，朱丹妮，徐德然. 徐長(zhǎng)卿組織培養(yǎng)技術(shù)的研究[J]. 藥物生物技術(shù)，1995，2（4）：33-36.蘇江，岑忠用，吳月圓，等. 鐵皮石斛叢生芽增殖和生長(zhǎng)影響因素的研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（2）：36-39.

2.3愈傷組織的繼代培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1不同濃度NAA和與相同濃度6-BA配組對(duì)愈傷組織繼代培養(yǎng)的影響由表6可知，NAA 0.1 mg/L+6-BA 3.0 mg/L 處理的愈傷組織增殖倍數(shù)最高，為298倍，其褐化率也相對(duì)最低，所以NAA 0.1 mg/L+6-BA 3.0 mg/L為最佳繼代培養(yǎng)基。

2.3.2不同濃度6-BA和與相同濃度NAA配組對(duì)愈傷組織繼代培養(yǎng)的影響由表7可知，6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L 處理的愈傷組織增殖倍數(shù)最高，為3.2倍，為最適宜愈傷組織繼代培養(yǎng)的激素濃度

2.4愈傷組織的分化培養(yǎng)結(jié)果與分析

2.4.1不同濃度NAA和與相同濃度6-BA配組對(duì)愈傷組織分化的影響由表8可看出，隨著NAA濃度的提高，芽分化率呈先上升后下降的趨勢(shì)，褐化率隨之升高，只有在NAA 0.1 mg/L+6-BA 3.0 mg/L條件下，芽分化率最高，為4%。所以，只有添加適宜濃度的NAA，才能使芽分化率最大。

2.4.2不同濃度6-BA和與相同濃度NAA配組對(duì)愈傷組織分化的影響由表9可看出，隨著6-BA濃度的提高，芽分化率呈上升的趨勢(shì)，褐化率先降低后升高，只有在6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L處理時(shí)，芽分化率最高為4%。所以，只有添加適宜濃度的 6-BA，才能使芽分化率達(dá)到最大。

2.5芽繼代培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.5.1不同濃度NAA和與相同濃度6-BA配組對(duì)芽繼代的影響由表10可知，芽在繼代培養(yǎng)過(guò)程中，芽的增殖倍數(shù)差異不大；其平均苗高呈先升后降再升的趨勢(shì)。

2.5.2不同濃度6-BA和與相同濃度NAA配組對(duì)芽繼代培養(yǎng)的影響由表11可知，不同濃度的激素組合對(duì)芽繼代培養(yǎng)的情況不同，以MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 3.0 mg/L組合為最佳組合，平均苗高4.3 cm。

2.6生根壯苗的試驗(yàn)結(jié)果與分析

經(jīng)過(guò)生根培養(yǎng)基MS+IBA 1.4 mg/L 培養(yǎng)出來(lái)的幼苗，1個(gè)月后生根率為100%，平均根長(zhǎng)為4.3 cm，平均苗高為 7.4 cm。圖1為生根培養(yǎng)基MS+IBA 1.4 mg/L培養(yǎng)出來(lái)的幼苗。

3結(jié)論

本試驗(yàn)以艾納香葉片為材料，篩選出最佳滅菌劑組合及滅菌時(shí)間、誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基配方、愈傷組織繼代培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基配方、愈傷組織分化的最佳培養(yǎng)基配方、芽繼代的最佳培養(yǎng)基配方、生根壯苗的培養(yǎng)基配方。從外植體的滅菌到成為一株完整幼苗的過(guò)程中每一步都很重要，缺了任何一個(gè)步驟本試驗(yàn)都無(wú)法成功。本試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)外植體進(jìn)行滅菌的最佳組合為0.1%氯化汞 8 min+75%乙醇 5 s；單獨(dú)使用氯化汞或者乙醇對(duì)艾納香滅菌效果不好。不同濃度的激素組合對(duì)艾納香葉片誘導(dǎo)愈傷組織情況不同，以MS+ 6-BA 30 mg/L+NAA 0.1 mg/L組合為最佳組合，誘導(dǎo)率為8817%；不同濃度的激素組合對(duì)愈傷組織繼代培養(yǎng)的情況不同，以MS+6-BA 3.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L組合為最佳組合；不同濃度的激素組合處理的艾納香葉片愈傷組織分化為芽的情況不同，以MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L 組合為最佳組合，以野外艾納香葉片為外植體誘導(dǎo)出的愈傷組織分化率為4%；以試管苗（由野外艾納香培育出的完整幼苗）葉片為外植體誘導(dǎo)出的愈傷組織分化率為93%；不同濃度的激素組合處理的葉片的芽繼代培養(yǎng)情況不同，以MS+ 6-BA 3.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L 組合為最佳組合，平均苗高4.3 cm。IBA有利于艾納香的無(wú)根綠苗生根，以MS+IBA 1.4 mg/L 培養(yǎng)基培養(yǎng)的生根率為100%。

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[5]許實(shí)波，趙金華. 艾鈉香二氫黃酮對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性肝損傷的保護(hù)作用[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，1998，14（2）：191-192.

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2.3愈傷組織的繼代培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1不同濃度NAA和與相同濃度6-BA配組對(duì)愈傷組織繼代培養(yǎng)的影響由表6可知，NAA 0.1 mg/L+6-BA 3.0 mg/L 處理的愈傷組織增殖倍數(shù)最高，為298倍，其褐化率也相對(duì)最低，所以NAA 0.1 mg/L+6-BA 3.0 mg/L為最佳繼代培養(yǎng)基。

2.3.2不同濃度6-BA和與相同濃度NAA配組對(duì)愈傷組織繼代培養(yǎng)的影響由表7可知，6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L 處理的愈傷組織增殖倍數(shù)最高，為3.2倍，為最適宜愈傷組織繼代培養(yǎng)的激素濃度

2.4愈傷組織的分化培養(yǎng)結(jié)果與分析

2.4.1不同濃度NAA和與相同濃度6-BA配組對(duì)愈傷組織分化的影響由表8可看出，隨著NAA濃度的提高，芽分化率呈先上升后下降的趨勢(shì)，褐化率隨之升高，只有在NAA 0.1 mg/L+6-BA 3.0 mg/L條件下，芽分化率最高，為4%。所以，只有添加適宜濃度的NAA，才能使芽分化率最大。

2.4.2不同濃度6-BA和與相同濃度NAA配組對(duì)愈傷組織分化的影響由表9可看出，隨著6-BA濃度的提高，芽分化率呈上升的趨勢(shì)，褐化率先降低后升高，只有在6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L處理時(shí)，芽分化率最高為4%。所以，只有添加適宜濃度的 6-BA，才能使芽分化率達(dá)到最大。

2.5芽繼代培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.5.1不同濃度NAA和與相同濃度6-BA配組對(duì)芽繼代的影響由表10可知，芽在繼代培養(yǎng)過(guò)程中，芽的增殖倍數(shù)差異不大；其平均苗高呈先升后降再升的趨勢(shì)。

2.5.2不同濃度6-BA和與相同濃度NAA配組對(duì)芽繼代培養(yǎng)的影響由表11可知，不同濃度的激素組合對(duì)芽繼代培養(yǎng)的情況不同，以MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 3.0 mg/L組合為最佳組合，平均苗高4.3 cm。

2.6生根壯苗的試驗(yàn)結(jié)果與分析

經(jīng)過(guò)生根培養(yǎng)基MS+IBA 1.4 mg/L 培養(yǎng)出來(lái)的幼苗，1個(gè)月后生根率為100%，平均根長(zhǎng)為4.3 cm，平均苗高為 7.4 cm。圖1為生根培養(yǎng)基MS+IBA 1.4 mg/L培養(yǎng)出來(lái)的幼苗。

3結(jié)論

本試驗(yàn)以艾納香葉片為材料，篩選出最佳滅菌劑組合及滅菌時(shí)間、誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基配方、愈傷組織繼代培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基配方、愈傷組織分化的最佳培養(yǎng)基配方、芽繼代的最佳培養(yǎng)基配方、生根壯苗的培養(yǎng)基配方。從外植體的滅菌到成為一株完整幼苗的過(guò)程中每一步都很重要，缺了任何一個(gè)步驟本試驗(yàn)都無(wú)法成功。本試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)外植體進(jìn)行滅菌的最佳組合為0.1%氯化汞 8 min+75%乙醇 5 s；單獨(dú)使用氯化汞或者乙醇對(duì)艾納香滅菌效果不好。不同濃度的激素組合對(duì)艾納香葉片誘導(dǎo)愈傷組織情況不同，以MS+ 6-BA 30 mg/L+NAA 0.1 mg/L組合為最佳組合，誘導(dǎo)率為8817%；不同濃度的激素組合對(duì)愈傷組織繼代培養(yǎng)的情況不同，以MS+6-BA 3.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L組合為最佳組合；不同濃度的激素組合處理的艾納香葉片愈傷組織分化為芽的情況不同，以MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L 組合為最佳組合，以野外艾納香葉片為外植體誘導(dǎo)出的愈傷組織分化率為4%；以試管苗（由野外艾納香培育出的完整幼苗）葉片為外植體誘導(dǎo)出的愈傷組織分化率為93%；不同濃度的激素組合處理的葉片的芽繼代培養(yǎng)情況不同，以MS+ 6-BA 3.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L 組合為最佳組合，平均苗高4.3 cm。IBA有利于艾納香的無(wú)根綠苗生根，以MS+IBA 1.4 mg/L 培養(yǎng)基培養(yǎng)的生根率為100%。

參考文獻(xiàn)：

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