雷帕霉素對(duì)順鉑作用下人肺腺癌A549及耐藥A549/DDP細(xì)胞增殖、侵襲、黏附及自噬凋亡的影響*

金 柱， 高寶安

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，宜昌市中心人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖北 宜昌 443003)

雷帕霉素對(duì)順鉑作用下人肺腺癌A549及耐藥A549/DDP細(xì)胞增殖、侵襲、黏附及自噬凋亡的影響*

金 柱， 高寶安△

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，宜昌市中心人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖北 宜昌 443003)

目的： 研究雷帕霉素(Rap)對(duì)順鉑(DDP)作用下人肺腺癌A549及耐藥A549/DDP 細(xì)胞增殖、遷移、黏附及其自噬凋亡的影響。方法: 培養(yǎng)人肺腺癌A549及耐藥A549/DDP細(xì)胞株，利用MTT方法分別檢測(cè)Rap和DDP單獨(dú)與聯(lián)合作用對(duì)A549及耐藥A549/DDP細(xì)胞增殖抑制率的影響；Transwell方法檢測(cè)Rap和DDP單獨(dú)與聯(lián)合作用對(duì)A549及耐藥A549/DDP細(xì)胞體外侵襲能力的影響；黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Rap和DDP單獨(dú)與聯(lián)合作用對(duì)A549及耐藥A549/DDP細(xì)胞體外侵襲能力的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Rap和DDP單獨(dú)與聯(lián)合作用對(duì)A549及耐藥A549/DDP細(xì)胞凋亡的影響；Western blotting檢測(cè)Rap和DDP單獨(dú)與聯(lián)合作用對(duì)A549及耐藥A549/DDP細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白beclin-1和LC3表達(dá)的影響。結(jié)果: 與Rap或DDP單獨(dú)作用組相比，Rap和DDP聯(lián)合作用能夠同時(shí)顯著抑制人肺腺癌A549及耐藥A549/DDP細(xì)胞增殖、體外侵襲能力及細(xì)胞黏附能力，并能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡和自噬標(biāo)志蛋白beclin-1和LC3的表達(dá)(均P<0.05)。結(jié)論: Rap能夠通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞自噬而增強(qiáng)DDP的作用，進(jìn)而抑制人肺腺癌A549及耐藥A549/DDP細(xì)胞的增殖、侵襲、黏附并促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用，具有協(xié)同作用。

雷帕霉素； 順鉑； 人肺腺癌細(xì)胞； 細(xì)胞凋亡； 細(xì)胞侵襲； 自噬

肺癌是目前世界上發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快的一種惡性腫瘤，在我國(guó)發(fā)病率和死亡率也一直呈上升趨勢(shì)，而其中以非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)為主，占到發(fā)病率的85%[1]。非小細(xì)胞肺癌患者一般發(fā)現(xiàn)較晚，確診時(shí)大多已不易采用直接手術(shù)治療，臨床上多采用化療作為NSCLC治療的重要手段[2]。NSCLC的化療多以鉑類(lèi)藥物作為聯(lián)合化療的基礎(chǔ)，順鉑(cis-diamminedichloroplatinum，DDP)是目前廣泛使用并較有效的一線化療藥物，其對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制毒性作用主要通過(guò)形成鉑-DNA復(fù)合物，但臨床上使用易產(chǎn)生其耐藥性從而制約了療效[3]。肺癌的鉑類(lèi)耐藥是影響化療療效的重要因素，因此如何解決肺癌的耐藥性對(duì)于臨床治療NSCLC具有重要意義，而侵襲、黏附和凋亡等細(xì)胞功能作為惡性腫瘤的重要生物學(xué)特征，也是臨床NSCLC患者治療復(fù)發(fā)和死亡的主要原因[4]。雷帕霉素(rapamycin，Rap)是mTOR信號(hào)通路的特異性抑制劑，可通過(guò)抑制mTOR信號(hào)通路活化自噬，從而發(fā)揮腫瘤抑制效應(yīng)[5]。A549/DDP是人肺腺癌系A(chǔ)549經(jīng)DDP誘導(dǎo)產(chǎn)生的多藥耐藥性NSCLC細(xì)胞系，它同時(shí)對(duì)卡鉑、氨甲喋呤等產(chǎn)生交叉耐藥性[6]。本研究將mTOR信號(hào)通路抑制劑雷帕霉素Rap和DDP單獨(dú)或聯(lián)合作用，觀察其能否增加DDP對(duì)人肺腺癌A549及耐藥A549/DDP細(xì)胞的敏感性及對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲、黏附、凋亡的影響，并探討其是否通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞自噬發(fā)揮作用。通過(guò)本研究對(duì)擺脫肺癌化療耐藥現(xiàn)象，顯著提高化療效果具有重要意義。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞株與試劑

人肺腺癌A549及耐藥A549/DDP細(xì)胞株購(gòu)自北京中科院腫瘤醫(yī)院中心細(xì)胞庫(kù)，最大耐藥倍數(shù)為12.47；RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基、EDTA和胰酶購(gòu)自HyClone；胎牛血清購(gòu)自Gibco；雷帕霉素、順鉑和二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自Sigma；噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自上海生工公司；Transwell Permeable Supports購(gòu)自Corning；Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自B&D；Annexin V細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)公司；兔抗人beclin-1、LC3和β-actin多克隆抗體購(gòu)自Abcam；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG II抗、ECL化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自北京碧云天公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 人肺腺癌A549及耐藥A549/DDP細(xì)胞株的培養(yǎng) 將購(gòu)買(mǎi)的人肺腺癌A549細(xì)胞及其耐藥A549/DDP細(xì)胞株在含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素雙抗的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。隔12 h換新培養(yǎng)基1次，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶80%左右后進(jìn)行細(xì)胞傳代和凍存。將傳代的A549及A549/DDP細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)以備實(shí)驗(yàn)使用。

2.2 MTT方法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549及A549/DDP細(xì)胞經(jīng)含0.25%胰蛋白酶消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并用RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞濃度為5×107/L接種于96孔板中，每孔為100 μL，每組同時(shí)設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄去上清培養(yǎng)基，并先后分別在A549及A549/DDP細(xì)胞中加入含不同濃度的Rap(0、0.5、1、2、4 μmol/L)、不同濃度的DDP(0、5、10、15、10 μmol/L)及Rap與DDP的聯(lián)合作用組。設(shè)置調(diào)零組和空白對(duì)照組，連續(xù)培養(yǎng)48 h。每孔加入20 μL MTT(5 g/L)溶液繼續(xù)溫育4 h，后棄去上清，每孔加入150 μL DMSO振蕩15 min，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)570 nm處各孔吸光值(A)，并計(jì)算各組細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。按公式計(jì)算各組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=[1-(加藥組A值-調(diào)零A值)/(對(duì)照組A值-調(diào)零A值)]×100%。

2.3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞體外侵襲能力 將各組分別用10 μmol/L DDP、2 μmol/L Rap、10 μmol/L DDP+2 μmol/L Rap預(yù)處理及對(duì)照組的A549細(xì)胞及其耐藥A549/DDP細(xì)胞用0.25%含EDTA的胰酶消化液消化，離心后收集細(xì)胞并用RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞濃度為5×108/L。分別在各組Transwell板上室膜上涂勻1 g/L的Matrigel膠50 μL，并置于37 ℃、30 min使之在微孔膜上重塑成基底膜結(jié)構(gòu)。將稀釋的A549和A549/DDP細(xì)胞每組取100 μL接種于Transwell上室內(nèi)，下室加入含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基600 μL，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。結(jié)束后，用4%多聚甲醛固定小室濾膜，用棉簽擦去上表面的細(xì)胞，然后用結(jié)晶紫染色10 min后用PBS清洗2遍，在200倍顯微鏡下觀察每組濾膜上穿過(guò)膜侵襲的細(xì)胞，并隨機(jī)拍照計(jì)數(shù)計(jì)算各組腫瘤細(xì)胞侵襲抑制率。侵襲抑制率(%)=(1-處理組平均侵襲細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組平均侵襲細(xì)胞數(shù))×100%。

2.4 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞黏附能力變化 在96孔板中每孔加入100 μL Matrigel膠(1 g/L)，4 ℃下處理過(guò)夜后吸出Matrigel膠，37 ℃放置1 h。在Matrigel預(yù)處理的96孔板中每孔分別接種1×108/L的A549及A549/DDP細(xì)胞200 μL。設(shè)置空白對(duì)照組、10 μmol/L DDP組、2 μmol/L Rap組和10 μmol/L DDP+2 μmol/L Rap組，每組6個(gè)復(fù)孔。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0.5 h后棄去培養(yǎng)基并用PBS清洗2遍后(參照組不處理)，加入100 μL培養(yǎng)液和20 μL MTT(5 g/L)，在37 ℃孵育4 h后，吸出上清，加入150 μL DMSO，振蕩10 min后，在酶聯(lián)儀上測(cè)定490 nm波長(zhǎng)時(shí)A值，計(jì)算各組細(xì)胞黏附率(%)=實(shí)驗(yàn)組黏附細(xì)胞A值/參照組黏附細(xì)胞A值×100%

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549及A549/DDP細(xì)胞消化后分別接種于6孔板中，培養(yǎng)12 h細(xì)胞貼壁后，各自分成4組，即control組(PBS對(duì)照)、Rap組(2 μmol/L Rap)、DDP組(10 μmol/L DDP組)和Rap與DDP聯(lián)合組(10 μmol/L DDP+2 μmol/L Rap)，分別作用48 h后用PBS洗滌3次后，消化離心收集細(xì)胞。按照Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒操作，先用500 μL PBS重懸各組細(xì)胞，再加入5 μL FITC標(biāo)記的Annexin V和5 μL PI混勻避光孵育20 min，用PBS洗滌1次后，離心并用150 μL重懸細(xì)胞。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率。

2.6 Western blotting檢測(cè)細(xì)胞自噬 利用Western blotting檢測(cè)細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白beclin-1和LC3的表達(dá)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549及A549/DDP細(xì)胞，消化后用含10%的胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)并各分成4組處理。Control組加入PBS為對(duì)照， DDP處理組加入濃度為10 μmol/L的DDP， Rap處理組加入濃度為2 μmol/L 的Rap，而Rap和DDP聯(lián)合處理組加入10 μmol/L DDP+2 μmol/L Rap，作用48 h后分別收集各組A549及A549/DDP細(xì)胞。用預(yù)冷PBS洗滌2次后，各加入100 μL的RIPA細(xì)胞裂解液振蕩混勻后冰上裂解15 min提取細(xì)胞中總蛋白。后利用BCA試劑盒測(cè)定各組中細(xì)胞總蛋白濃度。各組上樣30 μg總蛋白進(jìn)行12%的SDS-PAGE 2 h，電泳結(jié)束后進(jìn)行半干法轉(zhuǎn)PVDF膜，用5%脫脂奶粉溶液封閉1 h后分別孵育兔抗人多克隆beclin-1、LC3和β-actin的I抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜后TBST溶液洗滌10 min 3次，加入HRP標(biāo)記山羊抗兔II抗(1∶5 000),室溫孵育2 h后TBST溶液洗滌10 min 3次。利用化學(xué)發(fā)光ECL試劑顯影，曝光拍照。細(xì)胞自噬標(biāo)志物beclin-1和LC3蛋白表達(dá)強(qiáng)度用Quantity One軟件分析目的條帶和內(nèi)參照β-actin條帶的灰度值表示。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 雷帕霉素和順鉑對(duì)A549及A549/DDP細(xì)胞增殖的影響

如表1所示，與control對(duì)照組相比，不同濃度的Rap均能抑制A549及A549/DDP細(xì)胞增殖，增加細(xì)胞增殖抑制率。不同濃度Rap間，當(dāng)Rap濃度大于2 μmol/L時(shí)能同時(shí)顯著抑制A549及耐藥A549/DDP細(xì)胞增殖(P<0.05)。但Rap對(duì)耐藥A549/DDP細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)明顯弱于同濃度組的A549細(xì)胞(P<0.05)。而不同濃度的DDP均能顯著抑制A549細(xì)胞的增殖(P<0.05)，但其對(duì)耐藥A549/DDP細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)不明顯，僅當(dāng)DDP濃度大于15 μmol/L時(shí)，不同濃度組間A549/DDP細(xì)胞增殖才受顯著抑制。同時(shí)同濃度組的DDP對(duì)A549/DDP細(xì)胞的抑制效應(yīng)均顯著低于A549細(xì)胞(P<0.05)，驗(yàn)證了耐藥A549/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑具有強(qiáng)耐藥性，見(jiàn)表2。為了揭示Rap和DDP聯(lián)合作用對(duì)A549及A549/DDP細(xì)胞增殖的影響，利用MTT檢測(cè)了2 μmol/L Rap和不同濃度DDP聯(lián)合作用對(duì)A549及A549/DDP細(xì)胞增殖抑制率，結(jié)果見(jiàn)圖1。研究發(fā)現(xiàn)與2 μmol/L Rap單獨(dú)作用組相比，Rap和DDP聯(lián)合作用均能顯著抑制A549細(xì)胞的增殖(P<0.05)；而聯(lián)合作用DDP濃度大于10 μmol/L時(shí)，Rap和DDP聯(lián)合作用同樣能夠顯著抑制耐藥A549/DDP細(xì)胞增殖(P<0.05)。因此，選擇2 μmol/L Rap和10 μmol/L DDP研究其聯(lián)合作用對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株A549及耐藥A549/DDP細(xì)胞的影響。

表1 不同濃度的雷帕霉素作用48 h對(duì)人肺腺癌A549及耐藥A549/DDP細(xì)胞增殖抑制率的影響

Table 1.The inhibitory effect of rapamycin at different concentrations on the proliferation of A549 and A549/DDP cells (%.Mean±SD.n=6)

CellsRapconcentration(μmol/L)00.5124A5491.48±0.4310.32±2.4113.67±1.8727.86±2.13*39.67±2.43*A549/DDP1.20±0.236.25±0.23#8.37±1.87#16.29±1.04*#28.33±1.89*#

TableP<0.05vsother concentrations of Rap;#P<0.05vsA549 cells.

表2 不同濃度的順鉑作用48 h對(duì)人肺腺癌A549及耐藥A549/DDP細(xì)胞增殖抑制率的影響

Table 2.The inhibitory effect of DDP at different concentrations on the proliferation of A549 and A549/DDP cells (%.Mean±SD.n=6)

CellsDDPconcentration(μmol/L)05101520A5492.25±0.8526.65±1.25*43.35±1.28*53.65±3.23*67.83±2.45*A549/DDP1.68±0.646.67±1.83#10.38±2.65#14.48±1.84#21.48±2.23*#

TableP<0.05vsother concentrations of DDP;#P<0.05vsA549 cells.

Figure 1.The inhibitory effects of Rap combined with DDP for 48 h on the proliferation of A549 and A549/DDP cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsRap group.

圖1 雷帕霉素和順鉑聯(lián)合作用48 h對(duì)人肺腺癌A549及耐藥A549/DDP細(xì)胞增殖抑制率的影響

2 雷帕霉素和順鉑對(duì)A549及A549/DDP細(xì)胞侵襲的影響

如圖2所示，與control組相比，10 μmol/L DDP單獨(dú)作用能夠顯著抑制A549細(xì)胞的體外侵襲能力，但對(duì)于耐藥A549/DDP細(xì)胞作用不明顯；2 μmol/L Rap單獨(dú)作用對(duì)A549及A549/DDP細(xì)胞體外侵襲能力均有抑制作用；而2 μmol/L Rap和10 μmol/L DDP聯(lián)合作用組中，A549及A549/DDP細(xì)胞體外侵襲能力均受到顯著抑制，均強(qiáng)于單獨(dú)作用組。對(duì)各組細(xì)胞侵襲抑制率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，DDP單獨(dú)作用對(duì)A549細(xì)胞侵襲的抑制作用明顯(P<0.05)，但對(duì)于耐藥A549/DDP細(xì)胞卻無(wú)明顯作用。與Rap和DDP單獨(dú)作用組相比，Rap與DDP聯(lián)合作用組可以顯著增加對(duì)A549及A549/DDP細(xì)胞的侵襲抑制率(P<0.05)，說(shuō)明Rap可以提升DDP對(duì)耐藥A549/DDP細(xì)胞發(fā)揮侵襲抑制作用，且具有協(xié)同效應(yīng)。

3 雷帕霉素和順鉑對(duì)A549及A549/DDP細(xì)胞黏附的影響

細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Rap和DDP聯(lián)合作用同樣可以顯著抑制A549及耐藥A549/DDP細(xì)胞的黏附能力，結(jié)果見(jiàn)圖3。與control組相比，10 μmol/L DDP單獨(dú)作用對(duì)A549細(xì)胞的黏附能力均有顯著抑制效應(yīng)(P<0.05)，但對(duì)耐藥A549/DDP細(xì)胞黏附抑制無(wú)明顯作用。而2 μmol/L Rap作用于A549及A549/DDP細(xì)胞，對(duì)其黏附抑制能力均有明顯抑制作用(P<0.05)。當(dāng)Rap和DDP同時(shí)作用于A549及耐藥A549/DDP細(xì)胞時(shí)，對(duì)細(xì)胞黏附抑制率顯著提高，均高于Rap和DDP單獨(dú)作用組(P<0.05)。

Figure 2.The invasion ability of A549 and A549/DDP cells treated with Rap and DDP by Transwell assay. A: the invasion ability of A549 and A549/DDP cells detected by Transwell assay (×100).B: the results of quantitative analysis. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsDDP or Rap.

圖2 Transwell檢測(cè)雷帕霉素和順鉑對(duì)A549及A549/DDP細(xì)胞侵襲能力的影響

Figure 3.The adhesion ability of A549 and A549/DDP cells treated with Rap and DDP. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsDDP or Rap.

圖3 雷帕霉素和順鉑對(duì)A549及A549/DDP細(xì)胞黏附能力的影響

4 雷帕霉素和順鉑對(duì)A549及A549/DDP細(xì)胞凋亡的影響

與control組相比，2 μmol/L Rap和10 μmol/L DDP單獨(dú)作用于A549細(xì)胞時(shí)，均能顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡(P<0.05)；而Rap和DDP聯(lián)合作用對(duì)A549細(xì)胞凋亡促進(jìn)作用更加明顯，均高于單獨(dú)作用組(P<0.05)，說(shuō)明Rap和DDP促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡具有協(xié)同效應(yīng)。與control組相比，10 μmol/L DDP單獨(dú)作用于A549/DDP細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞凋亡效應(yīng)不明顯，說(shuō)明了A549/DDP細(xì)胞的耐藥性。而當(dāng)2 μmol/L Rap和10 μmol/L DDP同時(shí)作用于A549/DDP細(xì)胞時(shí)，耐藥A549/DDP細(xì)胞的凋亡率卻顯著增加(P<0.05)。說(shuō)明在Rap的作用下可以逆轉(zhuǎn)耐藥A549/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的耐藥性，見(jiàn)圖4。

Figure 4.The apoptosis of A549 and A549/DDP cells treated with Rap and DDP. A: the apoptosis of A549 and A549/DDP cells detected by flow cytometry.B: the quantitative analysis of apoptotic rates. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsDDP or Rap.

圖4 雷帕霉素和順鉑對(duì)A549及A549/DDP細(xì)胞凋亡的影響

5 雷帕霉素和順鉑對(duì)A549及A549/DDP細(xì)胞自噬的影響

利用Western blotting檢測(cè)細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白beclin-1和自噬體雙層膜形成蛋白LC3的表達(dá)，可以檢測(cè)Rap和DDP對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株A549及耐藥A549/DDP細(xì)胞自噬的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。與control組相比，DDP和Rap單獨(dú)處理A549細(xì)胞可以顯著誘導(dǎo)自噬標(biāo)志蛋白beclin-1及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白的表達(dá)(P<0.05)。而Rap和DDP同時(shí)作用于A549細(xì)胞時(shí)，beclin-1及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)均顯著高于DDP或Rap單獨(dú)作用組(P<0.05)，說(shuō)明Rap和DDP聯(lián)合作用可以促進(jìn)A549細(xì)胞自噬。當(dāng)DDP單獨(dú)作用于耐藥A549/DDP細(xì)胞時(shí)，自噬標(biāo)志蛋白beclin-1及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白均未見(jiàn)明顯的表達(dá)變化，說(shuō)明DDP對(duì)A549/DDP細(xì)胞自噬影響不明顯。但Rap作為自噬活化劑，對(duì)耐藥A549/DDP自噬仍然具有顯著誘導(dǎo)作用，可以顯著誘導(dǎo)自噬標(biāo)志蛋白beclin-1及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)(P<0.05)。當(dāng)Rap和DDP聯(lián)合作用于A549/DDP細(xì)胞時(shí)，與單獨(dú)作用組相比，自噬標(biāo)志蛋白beclin-1及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.05)，說(shuō)明Rap可以促進(jìn)DDP對(duì)耐藥A549/DDP細(xì)胞發(fā)揮自噬誘導(dǎo)作用，同時(shí)DDP對(duì)Rap發(fā)揮自噬誘導(dǎo)具有協(xié)同作用。

Figure 5.The autophagy of A549 and A549/DDP cells treated with Rap and DDP. A: the autophagy of A549 and A549/DDP cells detected by Western blotting； B: the ratio of LC3Ⅱ/LC3Ⅰ； C: the relative protein expression of beclin-1. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsDDP or Rap.

圖5 雷帕霉素和順鉑對(duì)A549及A549/DDP細(xì)胞自噬的影響

討 論

目前，針對(duì)肺癌腫瘤的治療不斷有新化療藥物出現(xiàn)并且方案也更趨于完善，但肺癌細(xì)胞常常對(duì)化療藥物產(chǎn)生原發(fā)性或繼發(fā)性耐藥效應(yīng)，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和化療失敗[7]。如何有效增加化療藥物的敏感性并抑制肺癌細(xì)胞的耐藥性是當(dāng)前亟需解決的難題。有數(shù)據(jù)表明[8]，DDP作為廣泛使用的化療藥物在多種惡性腫瘤治療中均有較好效果，但NSCLC極易對(duì)順鉑藥物產(chǎn)生耐藥性。因此，臨床上尋找可抵抗NSCLC對(duì)DDP耐藥的方法和提升DDP化療效果對(duì)于肺癌患者具有重要意義。本研究以NSCLC耐藥標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系A(chǔ)549和A549/DDP細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察在Rap干預(yù)下DDP對(duì)A549及耐藥A549/DDP細(xì)胞增殖、遷移、黏附等細(xì)胞功能的影響變化，以揭示Rap能否對(duì)肺癌細(xì)胞A549/DDP的耐藥性產(chǎn)生抵抗作用并增強(qiáng)DDP的藥性。

A549細(xì)胞為對(duì)化療藥物敏感細(xì)胞株，而A549/DDP細(xì)胞為化療藥物耐受性細(xì)胞株[9]。當(dāng)用相同濃度DDP同時(shí)處理A549和A549/DDP細(xì)胞時(shí)，DDP對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制率均顯著高于耐藥A549/DDP細(xì)胞，驗(yàn)證了A549/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的耐藥性。Rap作為臨床免疫抑制劑，可通過(guò)影響mTOR信號(hào)通路抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期，但關(guān)于其對(duì)肺癌細(xì)胞的功能影響研究尚較少[10]。在本研究中當(dāng)Rap濃度大于2 μmol/L時(shí)，對(duì)A549和A549/DDP細(xì)胞增殖均能產(chǎn)生顯著抑制作用，因此選擇2 μmol/L Rap和不同濃度的DDP聯(lián)合作用研究其對(duì)A549和A549/DDP增殖抑制率的影響變化。當(dāng)Rap和不同濃度DDP聯(lián)合作用時(shí)，A549細(xì)胞的增殖抑制率均顯著高于同濃度DDP單獨(dú)作用組；而當(dāng)聯(lián)合作用DDP濃度大于10 μmol/L時(shí)，耐藥A549/DDP細(xì)胞的增殖也受到顯著抑制，但同濃度DDP單獨(dú)作用對(duì)耐藥A549/DDP細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響。說(shuō)明Rap可以提升DDP對(duì)A549及耐藥A549/DDP細(xì)胞的敏感性。

肺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移是肺癌腫瘤惡性的生物標(biāo)志，也常常是肺癌病人治療失敗和死亡的主要原因[11]。本研究利用Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)人肺腺癌A549及耐藥A549/DDP細(xì)胞在體外均具有較強(qiáng)侵襲能力，而當(dāng)DDP和Rap單獨(dú)作用于A549細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞侵襲能力均受顯著抑制，但DDP單獨(dú)作用對(duì)耐藥A549/DDP細(xì)胞的侵襲能力無(wú)明顯影響。當(dāng)Rap和DDP聯(lián)合作用時(shí)，耐藥A549/DDP細(xì)胞的體外侵襲能力卻能顯著下降，說(shuō)明在Rap的作用下能夠提升DDP對(duì)耐藥A549/DDP細(xì)胞的侵襲抑制能力。而Rap和DDP聯(lián)合作用對(duì)A549及A549/DDP的侵襲抑制能力均顯著高于Rap和DDP各自單獨(dú)作用組，說(shuō)明Rap和DDP對(duì)抑制細(xì)胞體外侵襲能夠發(fā)揮協(xié)同作用。同時(shí)肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移機(jī)制不僅與侵襲能力有關(guān)，還涉及到細(xì)胞的黏附能力[12]。有研究指出，腫瘤細(xì)胞黏附力的強(qiáng)弱動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)在腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、轉(zhuǎn)移和侵襲過(guò)程中發(fā)揮重要作用[13]。本文證實(shí)人肺腺癌A549及耐藥A549/DDP細(xì)胞均具有較強(qiáng)黏附能力，與未處理對(duì)照組相比，DDP和Rap單獨(dú)作用對(duì)A549細(xì)胞有明顯的黏附抑制作用，且DDP發(fā)揮作用比Rap更明顯。對(duì)耐藥的A549/DDP細(xì)胞，DDP單獨(dú)作用對(duì)其細(xì)胞黏附能力影響作用不明顯，只有當(dāng)Rap和DDP聯(lián)合作用時(shí)耐藥A549/DDP細(xì)胞的黏附能力才受顯著抑制，且均高于Rap和DDP單獨(dú)作用組，再次說(shuō)明Rap可以作為DDP抑制耐藥性肺腺癌A549/DDP細(xì)胞黏附能力的增敏劑。

細(xì)胞自噬，是亞細(xì)胞水平的自我吞噬，當(dāng)細(xì)胞處于外界刺激或饑餓狀態(tài)下時(shí)可通過(guò)消化自身細(xì)胞器清除細(xì)胞內(nèi)垃圾，為細(xì)胞的再循環(huán)提供能量，因此低水平的細(xì)胞自噬在特定細(xì)胞環(huán)境下是一種自身保護(hù)機(jī)制，但當(dāng)大量自噬發(fā)生時(shí)卻能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。細(xì)胞自噬在維持細(xì)胞自身穩(wěn)態(tài)中起著重要作用，而細(xì)胞自噬功能異常在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中也扮演重要角色。前期研究表明[15]，細(xì)胞自噬作用既能使某些腫瘤細(xì)胞耐受應(yīng)激刺激而獲得更好生存，也能夠發(fā)揮腫瘤抑制機(jī)制殺死腫瘤細(xì)胞，在腫瘤發(fā)展過(guò)程中起著抑制和促進(jìn)的雙重作用并可能相互轉(zhuǎn)換。但針對(duì)許多相關(guān)腫瘤的研究也表明[16]，腫瘤細(xì)胞的自噬能力常常低于正常細(xì)胞，而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的自噬活性能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡水平，提示能夠通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的自噬水平來(lái)防治腫瘤惡化。Beclin-1是細(xì)胞自噬作用中的關(guān)鍵蛋白，也是自噬的直接執(zhí)行者，常被作為細(xì)胞自噬檢測(cè)的標(biāo)記蛋白[17]。LC3也是檢測(cè)細(xì)胞自噬體形成的特異性標(biāo)記蛋白，當(dāng)細(xì)胞自噬形成時(shí)LC3可由胞漿型LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)變成自噬體膜型LC3-Ⅱ，而LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的大小可估計(jì)細(xì)胞自噬水平的高低[18]。因此，本研究利用Western blotting檢測(cè)Rap和DDP誘導(dǎo)處理人肺腺癌A549及耐藥A549/DDP細(xì)胞中beclin-1和LC3蛋白的表達(dá)以揭示其對(duì)細(xì)胞自噬的影響變化。在未處理對(duì)照組中A549及耐藥A549/DDP細(xì)胞中自噬標(biāo)志蛋白beclin-1表達(dá)和LC3-Ⅱ/Ⅰ比值均較小，說(shuō)明人肺腺癌A549及耐藥A549/DDP細(xì)胞中自身自噬水平較低。當(dāng)用自噬誘導(dǎo)劑Rap處理A549及耐藥A549/DDP細(xì)胞時(shí)，beclin-1蛋白表達(dá)及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值均有所上升；而DDP單獨(dú)作用A549細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞自噬水平同樣上升，但對(duì)耐藥A549/DDP細(xì)胞自噬水平影響不明顯，說(shuō)明耐藥A549/DDP細(xì)胞對(duì)DDP化療藥物的耐受性也可能與抑制細(xì)胞自噬作用有關(guān)。而當(dāng)Rap和DDP聯(lián)合作用時(shí)，A549及耐藥A549/DDP細(xì)胞中自噬標(biāo)記蛋白beclin-1表達(dá)和LC3-Ⅱ/Ⅰ比值均顯著上升且高于Rap單獨(dú)誘導(dǎo)組，說(shuō)明Rap可以刺激DDP對(duì)耐藥A549/DDP細(xì)胞自噬發(fā)揮促進(jìn)作用。另研究表明，當(dāng)細(xì)胞自噬水平發(fā)生變化會(huì)影響細(xì)胞增殖、遷移、黏附、凋亡等細(xì)胞功能，而自噬與惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性[19]。本研究中Rap和DDP聯(lián)合作用時(shí)，A549及耐藥A549/DDP細(xì)胞增殖抑制率、侵襲抑制能力、黏附抑制能力及細(xì)胞凋亡率均顯著上升，和其誘導(dǎo)細(xì)胞自噬水平具有一致性，說(shuō)明Rap可以通過(guò)提升DDP對(duì)人肺腺癌A549及耐藥A549/DDP細(xì)胞的自噬誘導(dǎo)作用，從而抑制細(xì)胞增殖、侵襲、黏附并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此，通過(guò)本研究首次發(fā)現(xiàn)Rap和DDP聯(lián)合作用可以降低耐藥A549/DDP細(xì)胞的耐藥性并提高化療藥物DDP的敏感性，對(duì)于臨床治療非小細(xì)胞肺癌具有重要的指導(dǎo)意義。

[1] Shackelford DB, Abt E, Gerken L, et al. LKB1 inactivation dictates therapeutic response of non-small cell lung cancer to the metabolism drug phenformin[J]. Cancer Cell, 2013, 23(2):143-158.

[2] 劉換新, 吳曉霞, 張 燕, 等. 鉀離子通道蛋白 Kir2. 1/KCNJ2 及多藥耐藥蛋白 MRP1/ABCC1 在小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及相關(guān)性[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2013, 29(11):1940-1945.

[3] Valle J, Wasan H, Palmer DH, et al. Cisplatin plus gemcitabine versus gemcitabine for biliary tract cancer[J]. New Engl J Med, 2010, 362(14): 1273-1281.

[4] Tang CH, Parham C, Shocron E, et al. Picoplatin overcomes resistance to cell toxicity in small-cell lung cancer cells previously treated with cisplatin and carboplatin[J]. Cancer Chemother Pharmacol, 2011, 67(6):1389-1400.

[5] 許成芳, 李小毛, 李 田, 等. 雷帕霉素增強(qiáng)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2011, 27(11):2090-2095.

[6] 李文艷, 朱 珺. 雷帕霉素對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株 A549 生長(zhǎng)及增殖的影響[J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版, 2011， 31(3):275-278.

[7] Joshi M, Liu X, Belani CP. Taxanes, past, present, and future impact on non-small cell lung cancer[J]. Anti-cancer Drugs, 2014, 25(5):571-583.

[8] Gao Y, Baird AM, Barr M, et al. Epigenetic therapy for cisplatin resistance in non-small-cell lung cancer: the way forward?[J]. Lung Cancer Mgt, 2013, 2(1):1-4.

[9] Wang Q, Zhong M, Liu W, et al. Alterations of micro-RNAs in cisplatin-resistant human non-small cell lung cancer cells (A549/DDP)[J]. Exp Lung Res, 2011, 37(7):427-434.

[10]鄧守恒, 喻雄杰, 柯賢柱, 等. 雷帕霉素增強(qiáng) Ishikawa 細(xì)胞化療敏感性實(shí)驗(yàn)研究[J]. 武漢大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版, 2012, 33(1):55-58.

[11]Ramer R, Bublitz K, Freimuth N, et al. Cannabidiol inhibits lung cancer cell invasion and metastasis via intercellular adhesion molecule-1[J]. FASEB J, 2012, 26(4):1535-1548.

[12]Yang X, Popescu NC, Zimonjic DB. DLC1 interaction with S100A10 mediates inhibition ofinvitrocell invasion and tumorigenicity of lung cancer cells through a RhoGAP-independent mechanism[J]. Cancer Res, 2011, 71(8): 2916-2925.

[13]Chien ST, Lin SS, Wang CK, et al. Acacetin inhibits the invasion and migration of human non-small cell lung cancer A549 cells by suppressing the p38α MAPK signaling pathway[J]. Mol Cell Biochem, 2011, 350(1-2):135-148.

[14]呂 雷, 林 康, 高偉陽(yáng), 等. 饑餓誘導(dǎo)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞自噬發(fā)生[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2013, 29(2):330-333.

[15]蔣 倩, 羅招陽(yáng), 張志偉, 等. 自噬與腫瘤關(guān)系的研究與進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2013, 13(14):2783-2785.

[16]Xiong HY, Guo XL, Bu XX, et al. Autophagic cell death induced by 5-FU in Bax or PUMA deficient human colon cancer cell[J]. Cancer Lett, 2010,288(1):68-74.

[17]Kang R, Zeh HJ, Lotze MT, et al. The Beclin 1 network regulates autophagy and apoptosis[J]. Cell Death Differ, 2011, 18(4):571-580.

[18]Tanida I, Minematsu-Ikeguchi N, Ueno T, et al. Lysosomal turnover, but not a cellular level, of endogenous LC3 is a marker for autophagy[J]. Autophagy, 2005, 1(2):84-91.

[19]翁軍權(quán), 侯勁松. 自噬與惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)性[J]. 國(guó)際腫瘤學(xué)雜志, 2012, 39(6):408-411.

Effect of rapamycin on proliferation, invasion, adhesion, apoptosis and autophagy of human lung adenocarcinoma A549 and resistant A549/DDP cells treated with cis-diamminedichloroplatinum

JIN Zhu, GAO Bao-an

(DepartmentofRespiratoryMedicine,YichangCentralPeople’sHospital,TheFirstClinicalMedicalCollegeofChinaThreeGorgesUniversity,Yichang443003,China.E-mail: 222xiaozhao@163.com)

AIM: To study the effect of rapamycin (Rap) on the proliferation, invasion, adhesion, apoptosis and autophagy of human adenocarcinoma A549 and resistant A549/DDP cells treated with cis-diamminedichloroplatinum (DDP). METHODS: Human adenocarcinoma A549 and resistant A549/DDP cell lines were cultured. The inhibitory effects of Rap alone or combined with DDP on A549 and resistant A549/DDP cells were detected by MTT assay. Theinvitroinvasion abilities of the 2 cell lines treated with Rap alone or combined with DDP were detected by Transwell methods. Theinvitroadhesion abilities of the 2 cell lines treated with Rap alone or combined with DDP were detected by adhesion experiments. The apoptosis of A549 and resistant A549/DDP cells induced by Rap alone or combined with DDP was analyzed by flow cytometry. The cell autophagy marker proteins beclin-1 and LC3 in A549 and resistant A549/DDP cells treated with Rap alone or combined with DDP were detected by Western blotting.RESULTS: Compared with Rap or DDP alone group, the combination of Rap and DDP significantly inhibited the proliferation, invasion and adhesion of A549 and resistant A549/DDP cellsinvitro, and promoted the cell apoptosis and autophagy marker proteins beclin-1 and LC3 expression (allP<0.05).CONCLUSION: Rap enhances the effect of DDP through promoting the cell autophagy, thereby inhibiting the proliferation, invasion and adhesion of A549 and resistant A549/DDP cells and inducing the cell apoptosis with a synergistic effect.

Rapamycin; Cis-diamminedichloroplatinum; Human lung adenocarcinoma cells; Apoptosis; Cell invasion; Autophagy

1000- 4718(2014)12- 2120- 08

2014- 09- 23

2014- 10- 22

湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 2011CDB178)；湖北省教育廳中青年人才基金資助項(xiàng)目(No. Q20111202)

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.002

△通訊作者Tel: 0717-6526428； E-mail：222xiaozhao@163.com