CB2受體激動(dòng)劑JWH133對(duì)百草枯中毒致急性肺損傷大鼠的保護(hù)作用*

劉振寧， 韓 軍， 鄭 強(qiáng)， 趙 敏

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院急診科，遼寧 沈陽(yáng) 110004)

CB2受體激動(dòng)劑JWH133對(duì)百草枯中毒致急性肺損傷大鼠的保護(hù)作用*

劉振寧， 韓 軍， 鄭 強(qiáng)， 趙 敏△

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院急診科，遼寧 沈陽(yáng) 110004)

目的： 研究大麻素CB2受體激動(dòng)劑JWH133對(duì)百草枯中毒致急性肺損傷大鼠的保護(hù)作用。方法: 72只SD雄性大鼠隨機(jī)平均分成4組。百草枯中毒組：按照20 mg/kg劑量腹腔注射；低劑量JWH133預(yù)處理組：在給予百草枯腹腔注射前1 h腹腔注射5 mg/kg JWH133；高劑量JWH133預(yù)處理組：在給予百草枯腹腔注射前1 h腹腔注射20 mg/kg JWH133；正常對(duì)照組：1 mL生理鹽水腹腔注射。在注射百草枯后8 h、1 d和3 d時(shí)，收集動(dòng)脈血、肺泡灌洗液和肺組織標(biāo)本。采用血?dú)夥治鰞x測(cè)定動(dòng)脈血氧分壓(PaO2)，采用ELISA方法檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液中IL-1β和TNF-α含量，行組織切片HE染色進(jìn)行肺損傷評(píng)分，利用Western blotting方法檢測(cè)肺組織中NF-κB和AP-1 蛋白表達(dá)水平。結(jié)果: 與正常對(duì)照組相比，百草枯中毒組大鼠的動(dòng)脈血PaO2明顯下降，肺組織結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間質(zhì)水腫，肺損傷指數(shù)增加，支氣管肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α含量明顯增加。JWH133預(yù)處理，尤其是高劑量JWH133可以減輕肺組織損傷程度，降低支氣管肺泡灌洗液中IL-1β和TNF-α含量，減少肺組織中NF-κB和AP-1 蛋白的表達(dá)。結(jié)論: 應(yīng)用CB2受體激動(dòng)劑JWH133可以抑制百草枯中毒大鼠肺組織中NF-κB和AP-1 蛋白的表達(dá)，減少炎性細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的分泌，減輕百草枯中毒導(dǎo)致的急性肺損傷。

百草枯； 急性肺損傷； 大麻素CB2受體； 核因子κB； 激活蛋白1

百草枯(paraquat,PQ)是目前我國(guó)農(nóng)業(yè)應(yīng)用廣泛的除草劑之一。在臨床上，自殺性口服百草枯中毒患者較多，其病死率可達(dá)到60%～80%[1]，成為致死性最高的農(nóng)藥中毒事件。百草枯化學(xué)結(jié)構(gòu)與多胺結(jié)構(gòu)十分相似，所以百草枯很容易被肺組織中的多胺攝取系統(tǒng)[2]所攝取，并通過(guò)氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)損傷肺泡上皮細(xì)胞，破壞肺泡組織結(jié)構(gòu)，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，急性期患者臨床上表現(xiàn)為呼吸衰竭甚至多器官功能障礙[3]。

百草枯進(jìn)入體內(nèi)后，除了氧化應(yīng)激反應(yīng)以外，免疫細(xì)胞的激活以及炎性細(xì)胞因子分泌等炎癥反應(yīng)是肺損傷的重要因素。百草枯可以激活免疫細(xì)胞，激活炎癥反應(yīng)關(guān)鍵調(diào)控因子——核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)[4]和激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)[5]，導(dǎo)致下游的炎細(xì)胞因子表達(dá)增加。大麻素CB2受體(cannabinoid CB2 receptor)為G蛋白偶聯(lián)受體，主要分布于外周免疫系統(tǒng)，能夠激活多種信號(hào)通路。在骨性關(guān)節(jié)炎[6]、動(dòng)脈粥樣硬化[7]以及缺血再灌注損傷[8]過(guò)程中，CB2受體的激活參與抑制免疫細(xì)胞的活化、增殖和遷移，抑制炎癥細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的表達(dá)[9]，發(fā)揮重要的抗炎作用。而CB2受體的激活能否對(duì)百草枯致大鼠急性肺損傷能否產(chǎn)生保護(hù)作用，國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)未見(jiàn)報(bào)道。本研究將采用CB2受體激動(dòng)劑JWH133對(duì)百草枯中毒大鼠進(jìn)行預(yù)處理，研究分析對(duì)肺損傷的保護(hù)作用以及對(duì)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 和AP-1的影響。

材 料 和 方 法

1 試劑與儀器

百草枯(Sigma)；JWH133(Enzo Life Sciences)；TNF-α和IL-1β ELISA試劑盒(R&D)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物公司)；NF-κB p65和β-actin抗體(Abcam)；c-Fos和c-Jun抗體(Santa Cruz)；動(dòng)脈血?dú)夥治鰞x(ABL)；其余均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純化學(xué)試劑。

2 動(dòng)物與分組

清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley大鼠，體重200～250 g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，大鼠飼養(yǎng)的溫度控制在20～25 ℃，濕度控制在40%～70%，晝夜節(jié)律控制為12 h，自由進(jìn)食水。該實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)過(guò)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

將72只大鼠隨機(jī)平均分成4組：百草枯中毒組(PQ組)：按照20 mg/kg劑量腹腔注射；低劑量JWH133預(yù)處理組(LJWH133組)在給予PQ腹腔注射前1 h腹腔注射5 mg/kg JWH133；高劑量JWH133預(yù)處理組(HJWH133組)在給予PQ腹腔注射前1 h腹腔注射20 mg/kg JWH133；對(duì)照組(control組)：1 mL生理鹽水腹腔注射。在相同條件下常規(guī)飼料飼養(yǎng)，自由取食和飲水，房間溫度(25±5)℃、濕度(50±10)%，人工照明，明暗各12 h。

3 主要方法

3.1 標(biāo)本的采集及保存 在腹腔注射后8 h、1 d和3 d時(shí)，每組取出6只大鼠，使用10%水合氯醛300 mg/kg腹腔麻醉。待麻醉充分后，將大鼠仰臥于鼠臺(tái)上固定，常規(guī)消毒后，切除皮膚，并逐層暴露股動(dòng)脈鞘，完全游離股動(dòng)脈約1 cm，將1 mL注射器以1%的肝素鈉潤(rùn)管后，向股動(dòng)脈近心端穿刺采血1 mL，以備血?dú)夥治鍪褂?。打開(kāi)大鼠胸腔暴露出肺臟，結(jié)扎右側(cè)肺門(mén)。血管夾夾閉右主支氣管，將頂端圓鈍的特制針頭插入氣管，用4 mL生理鹽水行肺泡灌洗，回收肺泡灌洗液，重復(fù)3次。將標(biāo)本計(jì)量后，4 ℃離心(1 000×g)10 min，分離并收集上清液置于-80 ℃保存。取肺左葉部分置于-80 ℃保存以備檢測(cè)，另一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h以上，石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅(HE)染色。

3.2 動(dòng)脈血氧分壓(arterial partial pressure of oxygen, PaO2)的測(cè)定 將動(dòng)脈血標(biāo)本約1 mL放入動(dòng)脈血?dú)夥治鰞x中，測(cè)定動(dòng)脈血氧分壓。

3.3 支氣管肺泡灌洗液IL-1β和TNF-α含量的測(cè)定 將收集的大鼠支氣管肺泡灌洗液，使用ELISA方法嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中IL-1β 和TNF-α含量。

3.4 肺組織損傷評(píng)分 將固定好的大鼠肺組織切割組織塊，至厚度約0.5 cm左右，常規(guī)組織梯度乙醇脫水、透明、浸蠟、包埋后連續(xù)切片，行HE 染色。光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化，并按Mikawa等[10]方法進(jìn)行肺損傷評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：對(duì)肺泡充血、出血、肺泡腔或血管壁中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)或聚集、肺泡壁增厚和(或)透明膜形成4項(xiàng)指標(biāo)，分別依病變輕重評(píng)0～4分(0：無(wú)病變或非常輕微；1：輕度病變；2：中度病變；3：重度病變；4：極重度病變)。各項(xiàng)評(píng)定分?jǐn)?shù)相加為肺損傷總評(píng)分。

3.5 Western blotting 法檢測(cè)肺組織NF-κB和AP-1的表達(dá) 按照細(xì)胞核蛋白提取試劑盒說(shuō)明，提取肺組織核蛋白，進(jìn)行蛋白定量后，加樣品緩沖液煮沸5 min，各取20 μL 加樣；使用10% 聚丙烯酰胺凝膠在150 V、30 mA條件下電泳1.5 h；50 V 條件下PVDF 膜轉(zhuǎn)膜2 h；5%脫脂牛奶封閉，滴加NF-κB p65Ⅰ抗(1∶50)和c-Fos、c-JunⅠ抗(1∶50)，4 ℃過(guò)夜; 用含0.1% Tween 20 的TBS 沖洗5 min 3次，再加入Ⅱ抗(1∶500)室溫下孵育2 h，用0.1% TBST 沖洗15 min 3 次，ECL 發(fā)光檢測(cè)，X 線片顯影，掃描圖像，測(cè)得各條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)后，比較其表達(dá)量的變化。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠PaO2的變化

正常對(duì)照組大鼠PaO2在90 mmHg以上，百草枯中毒以后PaO2明顯下降，中毒3 d時(shí)比較顯著；當(dāng)使用CB2受體激動(dòng)劑JWH133預(yù)處理以后，尤其是高劑量組(20 mg/kg)，隨時(shí)間的延長(zhǎng)PaO2下降的程度有所緩和，在中毒1 d 和3 d時(shí)，與百草枯中毒組比較具有顯著差異(P< 0.05)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.PaO2levels of rats in different groups at different time points. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsPQ group.

圖1 不同組別大鼠在不同時(shí)點(diǎn)動(dòng)脈血氧分壓的變化

2 支氣管肺泡灌洗液IL-1β和TNF-α含量測(cè)定

百草枯中毒組隨著中毒時(shí)間的延長(zhǎng)，支氣管肺泡灌洗液中IL-1β和TNF-α含量明顯增加；當(dāng)使用CB2激動(dòng)劑JWH133預(yù)處理后二者表達(dá)量明顯下降，在百草枯中毒1 d 和3 d，與百草枯中毒組比較有顯著差異(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The levels of IL-1β (A)and TNF-α (B)in BALF of the rats in different groups at different time points. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsPQ group.

圖2 不同組別大鼠在不同時(shí)點(diǎn)支氣管肺泡灌洗液IL-1β和TNF-α含量的變化

3 肺組織損傷評(píng)分

光鏡下所見(jiàn)正常肺組織肺泡結(jié)構(gòu)完整，間質(zhì)清晰，無(wú)炎性滲出，而百草枯中毒組3 d 時(shí)大鼠肺組織損傷嚴(yán)重，顯微鏡下可見(jiàn)肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺間質(zhì)水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。百草枯中毒組肺組織損傷評(píng)分較正常組比較明顯增加，而 JWH133預(yù)處理組的肺損傷程度明顯減輕，損傷評(píng)分下降，與百草枯中毒組比較有顯著差異(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

4 NF-κB p65和AP-1(c-Fos、c-Jun)蛋白在肺組織中的量化分析

Western blotting 結(jié)果提示NF-κB p65和AP-1(c-Fos、c-Jun)蛋白在百草枯中毒組中表達(dá)較正常組明顯增加，而JWH133預(yù)處理組二者表達(dá)明顯下降，高劑量JWH133組更為顯著，與百草枯中毒組相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4、5。

討 論

百草枯中毒后，主要造成急性肺損傷，而且發(fā)展迅速。目前其機(jī)制并不是很清楚，除了本身可以造成氧化還原反應(yīng)，炎性細(xì)胞因子的參與也起到非常重要的作用。百草枯中毒后產(chǎn)生大量活性氧自由基等除了直接的細(xì)胞毒性外，還通過(guò)激活炎性細(xì)胞，增加花生四烯酸代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，增加肺組織中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)-2和MMP-9的表達(dá)[11]，刺激炎癥細(xì)胞因子如TNF-α和IL-1β分泌，參與炎癥反應(yīng)[12]。在組織病理學(xué)上可表現(xiàn)為肺泡結(jié)構(gòu)破壞、肺間質(zhì)水腫以及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

Figure 3.HE staining of rat lung tissue (×200) and the lung injury scores in different groups at 3 d after PQ poisoning. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsPQ group.

圖3 不同組別大鼠肺組織HE染色及肺組織的損傷評(píng)分

Figure 4.The protein expression of NF-κB p65 in different groups at 3 d after PQ poisoning. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsPQ group.

圖4 不同組別大鼠肺組織NF-κB p65蛋白在百草枯中毒3 d的表達(dá)

Figure 5.The protein expression of c-Fos and c-Jun in different groups at 3 d after PQ poisoning. Mean±SD.n=6.*P< 0.05vsPQ group.

圖5 不同組別大鼠肺組織c-Fos和c-Jun蛋白在百草枯中毒3 d的表達(dá)

NF-κB是由Rel/NF-κB家族的多肽成員組成的一組轉(zhuǎn)錄因子，被稱為是免疫炎癥反應(yīng)的中樞調(diào)節(jié)者[13]。在細(xì)胞靜息狀態(tài)下，Rel/NF-κB轉(zhuǎn)錄復(fù)合物以無(wú)活性的狀態(tài)存在于細(xì)胞漿中，當(dāng)細(xì)胞暴露于各種細(xì)菌、病毒以及其代謝產(chǎn)物時(shí)，或者在缺血/再灌注、出血及休克等應(yīng)激狀態(tài)下，NF-κB便可以被激活，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，啟動(dòng)和調(diào)控多種與炎癥反應(yīng)有關(guān)的細(xì)胞因子(IL-1β、TNF-α等)、黏附分子(ICAM-1、VCAM-1、E-選擇素等)和趨化因子(IL-8等)的基因表達(dá)。AP-1是由 c-Fos 和 c-Jun 蛋白組成的同源或異源二聚體。靜息狀態(tài)下，AP-1 的蛋白濃度和活性極低，當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)，c-Jun和c-Fos 表達(dá)水平增高，參與調(diào)控炎性細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6和IL- 8的表達(dá)，影響炎癥反應(yīng)持續(xù)和發(fā)展[14]。TNF-α 是導(dǎo)致細(xì)胞或組織損傷的主要細(xì)胞因子，在局部或全身?yè)p傷后幾分鐘內(nèi)由巨噬細(xì)胞釋放，然后直接作用于細(xì)胞并造成損傷；作用于中性粒細(xì)胞時(shí)，生成自由基，釋放各種蛋白酶和水解酶，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。IL-1β對(duì)巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞有趨化和黏附作用，增強(qiáng)血管通透性，能夠誘導(dǎo)IL-6合成[16]。

我們研究結(jié)果提示在百草枯中毒導(dǎo)致急性肺損傷的過(guò)程中，大鼠動(dòng)脈血氧分壓隨著時(shí)間延長(zhǎng)明顯降低，顯微鏡下所見(jiàn)大鼠肺泡組織結(jié)構(gòu)破壞，肺間質(zhì)水腫，中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞數(shù)量增加，肺組織中NF-κB和AP-1蛋白的表達(dá)增加，下游炎性細(xì)胞因子如IL-1β和TNF-α的表達(dá)不斷增加。分析升高的原因可能有兩方面原因：一是百草枯中毒后產(chǎn)生的大量氧自由基，導(dǎo)致其N(xiāo)F-κB和AP-1的激活；另一方面細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β等的大量釋放，也進(jìn)一步參與兩者的活化。

CB2受體作為內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)重要組成部分之一，主要在包括B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞中表達(dá)[17-18]。CB2受體被激活以后可通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)cAMP生成來(lái)發(fā)揮作用，減少T淋巴細(xì)胞的增殖，降低巨噬細(xì)胞生物活性和功能，明顯抑制脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)所誘發(fā)的炎性細(xì)胞因子TNF-α和 IL-1β的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)[19]。有研究報(bào)道在LPS誘導(dǎo)的葡萄膜炎實(shí)驗(yàn)研究中，使用CB2受體激動(dòng)劑HU308可以降低轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和AP-1表達(dá)，減少致炎因子TNF-α、 IL-1β、 IL-6、 CCL5和CXCL2表達(dá)[20]。與該研究結(jié)果類(lèi)似，我們研究發(fā)現(xiàn)百草枯中毒致大鼠急性肺損傷模型中，使用CB2受體激動(dòng)劑JWH133進(jìn)行預(yù)處理以后，肺組織損傷程度較百草枯中毒組有所緩解，動(dòng)脈氧分壓較中毒組有一定程度的提高，肺泡灌洗液中的炎性細(xì)胞因子TNF-α和 IL-1β濃度均有不同程度減少，肺組織中NF-κB和AP-1蛋白表達(dá)含量明顯下降，尤其是高劑量組JWH133組更為明顯。分析認(rèn)為JWH133激活肺組織中免疫細(xì)胞CB2受體，抑制免疫細(xì)胞活性和功能，進(jìn)而抑制炎癥調(diào)控因子NF-κB和AP-1，減少下游TNF-α和 IL-1β等細(xì)胞因子的表達(dá)，減輕百草枯所導(dǎo)致的肺部炎癥反應(yīng)，具體生物學(xué)機(jī)制需要進(jìn)一步研究探討。

綜上所述，JWH133作為CB2受體激動(dòng)劑，可以激活CB2受體，抑制NF-κB和AP-1蛋白的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)，緩解百草枯中毒所導(dǎo)致的大鼠急性肺損傷。CB2受體可以作為研究和治療百草枯中毒的新靶點(diǎn)。

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CB2 receptor agonist JWH133 exerts protective effects on rat model of paraquat-induced acute lung injury

LIU Zhen-ning, HAN Jun, ZHENG Qiang, ZHAO Min

(DepartmentofEmergencyMedicine,ShengjingHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110004,China.E-mail:wfzd999@126.com)

AIM: To study the protective effects of cannabinoid CB2 receptor agonist JWH133 on rat acute lung injury induced by paraquat (PQ).METHODS: Male Sprague-Dawley rats (n=72) were randomly divided into 4 groups. PQ group: PQ was administered intraperitoneally at the dose of 20 mg/kg; Low-dose JWH133 pretreatment group (L-JWH133 group): JWH133 (5 mg/kg, ip) was administered 1 h before PQ exposure; high-dose JWH133 pretreatment group (H-JWH133 group): JWH133 (20 mg/kg, ip) was administered 1 h before PQ exposure; control group: 1 mL saline was administered intraperitoneally. Arterial blood, bronchoalveolar lavage fluid (BALF) and lung tissue samples were collected at 8 h, 1 d and 3 d after PQ exposure. PaO2and the levels of TNF-α and IL-1β in BALF were measured via blood gas analyzer and ELISA, respectively. The pathological changes and lung injury scores were assessed at 3 d after PQ exposure. NF-κB and AP-1 protein levels were also determined by Western blotting.RESULTS: The decrease in PaO2, structural injury of the lung tissues, interstitial pulmonary edema, and the increase in IL-1β and TNF-α in BALF were observed in PQ-treated rats compared with control group. JWH133 pretreatment reduced the degree of lung tissue injury, decreased the levels of IL-1β and TNF-α in BALF and the NF-κB and AP-1 protein expression in the lung tissue compared with PQ group, especially in H-JWH133 group. CONCLUSION: CB2 receptor agonist JWH133 inhibits NF-κB and AP-1 protein expression in the lung tissues, and reduces the secretion of IL-1β and TNF-α in BALF after paraquat exposure, thus attenuating paraquat-induced acute lung injury.

Paraquat; Acute lung injury; Cannaboid CB2 receptor; Nuclear factor-κB; Activator protein-1

1000- 4718(2014)12- 2179- 06

2014- 07- 21

2014- 09- 13

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81171793/H1503)； 遼寧省科學(xué)計(jì)劃項(xiàng)目(No.201102278)；遼寧省教育廳高等學(xué)校科學(xué)研究一般項(xiàng)目(No. L2014300)

R392.32

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.011

△通訊作者 Tel: 024-96615-64131； E-mail: wfzd999@126.com