MicroRNA-378*通過(guò)抑制CTGF促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡*

董 珺， 曾波航， 劉寧寧， 莫 沛， 熊龍根,， 劉世明,， 黎 佼,△

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 1腫瘤科， 2心內(nèi)科， 3廣州心血管疾病研究所，廣東 廣州 510260)

MicroRNA-378*通過(guò)抑制CTGF促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡*

董 珺1,3， 曾波航1， 劉寧寧3， 莫 沛2， 熊龍根2,3， 劉世明2,3， 黎 佼2,3△

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院1腫瘤科，2心內(nèi)科，3廣州心血管疾病研究所，廣東 廣州 510260)

目的： 研究年齡相關(guān)microRNA-378* (miR-378*) 對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)存活和凋亡的調(diào)控作用。方法: 通過(guò)microRNA芯片和qRT-PCR檢測(cè)供體年齡對(duì)hMSCs 中miR-378*表達(dá)的影響；通過(guò)H2O2誘導(dǎo)hMSCs凋亡；通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-378*模擬物或抑制物，過(guò)表達(dá)或抑制miR-378*的表達(dá)；用MTT、LDH、caspase-3/7、TUNEL檢測(cè)等方法研究其對(duì)hMSCs存活和凋亡的影響；通過(guò)siRNA研究結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)對(duì)hMSCs存活和凋亡的影響。結(jié)果: 隨供體年齡增加，hMSCs 中miR-378*的表達(dá)增加。H2O2刺激可促進(jìn)miR-378*表達(dá)，抑制CTGF表達(dá)。過(guò)表達(dá)miR-378*可減少hMSCs的存活，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。相反，抑制miR-378*的表達(dá)促進(jìn)hMSCs的存活，減少細(xì)胞凋亡。同時(shí)抑制miR-378*和CTGF的表達(dá)，使miR-378*失去對(duì)hMSCs存活和凋亡的調(diào)控作用。直接抑制CTGF的表達(dá)可減少hMSCs的存活，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。結(jié)論: miR-378*通過(guò)抑制CTGF的表達(dá)減少hMSCs存活，促進(jìn)hMSCs凋亡。

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； MicroRNA-378*； 細(xì)胞凋亡

我們的前期研究證實(shí)，隨著供體年齡的增加，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、分化能力下降，細(xì)胞衰老增加，microRNA的表達(dá)發(fā)生改變[1-2]。而隨著人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stem cells, hMSCs)供體年齡的增加，表達(dá)發(fā)生改變的microRNA，影響了hMSCs的功能，例如：隨供體年齡增加，表達(dá)下降最顯著的microRNA-10a (miR-10a)，可通過(guò)Krupple樣受體4(Krupple-like receptor 4，KLF4)再生hMSCs的分化能力，減少細(xì)胞衰老，抑制hMSCs增殖[2]；而隨著供體年齡的增加，表達(dá)升高最顯著的miR-196a，可通過(guò)同源框B7(homeobox B7,HOXB7)及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)抑制hMSCs增殖[3]；最近的研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-378可以通過(guò)抑制胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R)促進(jìn)大鼠心肌細(xì)胞凋亡[4]。而我們的研究發(fā)現(xiàn)，隨著供體年齡的增加，miR-378家族中miR-378*的表達(dá)上調(diào)，hMSCs衰老增加[2]。基于miR-378*可能參與調(diào)控hMSCs的存活與凋亡，本研究探討了miR-378*對(duì)hMSCs存活及凋亡的調(diào)控作用，并進(jìn)一步探討其分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 人骨髓的提取 通過(guò)廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，與患者簽訂知情同意書(shū)后，在心臟瓣膜病患者手術(shù)過(guò)程中吸取人骨髓5 mL。供體為17～30歲者定義為年青組，65～80歲者定義為年老組，排除腫瘤、乙肝、HIV感染等因素。

1.2 主要試劑及儀器 胎牛血清和OPTI-MEM 培養(yǎng)基(Gibco)；Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑和Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)；LDH細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒和MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(碧云天)；caspase-3/7活性檢測(cè)試劑盒(Promega)；原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Roche)；SYBR Green熒光定量試劑盒和RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Toyobo)；淋巴細(xì)胞分離液(MPBIO)；熒光定量PCR儀(ABI)；多功能酶標(biāo)儀(TECAN)。

2 方法

2.1 hMSCs的提取及鑒定 將人骨髓小心疊加于等體積的淋巴細(xì)胞分離液上層，4 ℃下以2 000 r/min離心20 min，吸取分離液和血漿界面的云霧狀的單個(gè)核細(xì)胞層，用無(wú)血清IMDM懸浮后，以1 000 r/min離心。按2×109/m2密度接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。48 h后換液，貼壁細(xì)胞每3 d換液，待細(xì)胞融合度達(dá)80%以上時(shí)，胰酶消化傳代，第3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究并通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面特異性抗原的表達(dá)(CD29，CD31，CD34，CD44，CD45和CD166)[2]。

2.2 MicroRNA芯片檢測(cè)及qRT-PCR檢測(cè) 分別選取年青組(17歲、20歲、25歲)及年老組(78歲、80歲、75歲)hMSCs送于北京博奧生物有限公司進(jìn)行mico-RNA芯片檢測(cè)。用1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)miR-378*及結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor,CTGF)的表達(dá)，分別選取U6及GAPDH作為內(nèi)參照。各引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-378*模擬物、抑制物和si-CTGF及其相應(yīng)的陰性對(duì)照均由上海吉瑪公司合成，具體序列見(jiàn)表2。hMSCs培養(yǎng)于 24 孔板，無(wú)血清培養(yǎng)過(guò)夜后，更換為新鮮無(wú)血清及抗生素培養(yǎng)基(500 μL/孔)。將小分子 RNA 稀釋于100 μL Opti-MEM培養(yǎng)基中，加入1 μL Lipofectamine RNAiMAX，輕柔混勻后室溫放置15 min；將 RNAiMAX與miRNA/siRNA的稀釋液加入 24 孔板的各孔細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h按實(shí)驗(yàn)需要處理細(xì)胞。miR-378*模擬物及陰性對(duì)照的終濃度為100 nmol/L；miR-378*抑制物及陰性對(duì)照的終濃度為200 nmol/L；siRNA及其對(duì)照的終濃度為20 nmol/L。

2.4 MTT檢測(cè) H2O2(300 μmol/L，5 h)刺激不同預(yù)處理組 hMSCs后(詳見(jiàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)方法)，通過(guò)MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)hMSCs活性(hMSCs以1×108/m2密度培養(yǎng))。

表2 MicroRNA與siRNA序列

2.5 LDH及caspase-3/7檢測(cè) H2O2(300 μmol/L，5 h)刺激不同預(yù)處理組 hMSCs后，通過(guò)LDH細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒及caspase-3/7活性檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)不同預(yù)處理組中LDH酶及caspase-3/7的活性(hMSCs以3×108/m2密度培養(yǎng))。

2.6 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 H2O2(300 μmol/L，5 h)刺激不同預(yù)處理組 hMSCs后，通過(guò)原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)不同預(yù)處理組中細(xì)胞凋亡的表達(dá)(hMSCs以1.5×109/m2密度培養(yǎng))。DAPI復(fù)染細(xì)胞核，熒光顯微鏡下檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況(每實(shí)驗(yàn)組做3復(fù)孔，每孔隨機(jī)選取6個(gè)區(qū)域，行染色陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù))。

2.7 Western blotting檢測(cè)CTGF蛋白表達(dá) 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞處理完畢后，加入細(xì)胞裂解液，4 ℃裂解30 min后收取蛋白液，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量?？偟鞍捉?jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移到NC膜上。用5%BSA封閉1 h，后加入CTGF抗體(1∶100)，4 ℃過(guò)液，用TBST洗3次，每次10 min。ECL法顯色，用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-378*隨供體年齡增加而表達(dá)上調(diào)

通過(guò)Affymetrixr GeneChip 2.0 miRNA芯片分析，我們發(fā)現(xiàn)miR-378*隨供體年齡的增加而表達(dá)上調(diào)，見(jiàn)圖1A。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)，我們進(jìn)一步證實(shí)，與年青組相比，年老組hMSCs中miR-378*表達(dá)上調(diào)4.71倍，見(jiàn)圖1B。

Figure 1.Alternation of miR-378* and CTGF expression in aged hMSCs. A: miR-378* expression in young (Y) and old (O) hMSCs was determined by microarray analysis； B: miR-378* expression in Y, O， control(C) and H2O2(H) treated hMSCs was determined by qRT-PCR； C: CTGF mRNA expression in Y, O， C and H2O2(H) treated hMSCs； D: CTGF protein expression in Y and O hMSCs. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsY;#P<0.05vsC.

圖1 供體年齡對(duì)hMSCs中miR-378*及CTGF表達(dá)的影響

2 H2O2誘導(dǎo)hMSCs凋亡

H2O2刺激可減少hMSCs存活，誘導(dǎo)hMSCs凋亡。通過(guò)MTT、LDH和caspase-3/7檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)H2O2刺激使hMSCs細(xì)胞存活率下降，LDH和caspase-3/7活性升高，見(jiàn)圖2D～F。并且，H2O2可促進(jìn)hMSCs中miR-378*的表達(dá)，抑制CTGF的表達(dá)，見(jiàn)圖1B～D。

Figure 2.Effects of miR-378* and CTGF on hMSC survival and apoptosis. A: up-regulated miR-378* expression in hMSCs by miR-378* mimic (M) and down-regulated miR-378* expression in hMSCs by miR-378* inhibitor (I)； B and C: the mRNA and protein expression of CTGF in hMSCs transfected with miR-378* mimic, miR-378* inhibitor, si-CTGF (S), or miR-378* inhibitor and si-CTGF (I+s)； D, E and F: MTT, LDH and caspase-3/7 assays of young (Y), old (O) or H2O2-treated hMSCs which transfected with miR-378* mimic, miR-378* inhibitor, si-CTGF, or miR-378* inhibitor and si-CTGF.C1～3： controls. Mean±SD.n=4.*P<0.05vsC1;#P<0.05vsC2;△P<0.05vsY;▲P<0.05vsY+H2O2.

圖2 miR-378*及CTGF對(duì)hMSCs存活與凋亡的調(diào)控作用

3 miR-378*促進(jìn)H2O2誘導(dǎo)的hMSCs凋亡

轉(zhuǎn)染miR-378*模擬物，可在hMSCs中過(guò)表達(dá)miR-378*(上調(diào)5.1倍)；相反，轉(zhuǎn)染miR-378*抑制物，可抑制miR-378*的表達(dá)(下調(diào)0.21倍)，見(jiàn)圖2A。過(guò)表達(dá)miR-378*后，通過(guò)MTT、LDH、caspase-3/7檢測(cè)及TUNEL染色，我們發(fā)現(xiàn)hMSCs細(xì)胞存活率下降(MTT檢測(cè)，下調(diào)0.58倍)，細(xì)胞凋亡增加；LDH活性上調(diào)1.75倍；caspase-3/7活性上調(diào)1.28倍；TUNEL染色陽(yáng)性率上調(diào)8.14倍。相反，抑制miR-378*表達(dá)后，hMSCs細(xì)胞存活率提高(MTT檢測(cè)，上調(diào)1.24倍)，細(xì)胞凋亡減少；LDH活性下調(diào)0.58倍；caspase-3/7活性下調(diào)0.83倍；TUNEL染色陽(yáng)性率下調(diào)0.36倍，見(jiàn)圖2D～F及圖3。

Figure 3.Effects of miR-378* and CTGF on hMSC apoptosis [TUNEL (red) and DAPI (blue) staining，×200].Mean±SD.n=3.*P<0.05vsC1;#P<0.05vsC2;△P<0.05vsY.

圖3 TUNEL檢測(cè)miR-378*及CTGF對(duì)hMSCs凋亡的調(diào)控作用

4 miR-378*通過(guò)抑制CTGF表達(dá)發(fā)揮調(diào)控作用

通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)與年青組相比，年老組hMSCs中CTGF表達(dá)下調(diào)0.24倍，見(jiàn)圖1C。H2O2刺激后引起hMSCs中miR-378*表達(dá)上調(diào)時(shí)，CTGF表達(dá)下調(diào)0.27倍，見(jiàn)圖1B、C。轉(zhuǎn)染miR-378*模擬物在hMSCs中過(guò)表達(dá)miR-378*時(shí)，CTGF表達(dá)下調(diào)0.49倍，而在hMSCs中抑制miR-378*表達(dá)時(shí)，CTGF表達(dá)升高3.31倍；通過(guò)si-CTGF，我們可在hMSCs中抑制CTGF mPNA及蛋白的表達(dá)(下調(diào)0.19倍)，見(jiàn)圖2B、C。在H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中，直接抑制CTGF的表達(dá)，使hMSCs存活率下降(MTT檢測(cè)，下調(diào)0.55倍)，細(xì)胞凋亡增加；LDH活性上調(diào)2倍；caspase-3/7活性上調(diào)1.31倍；TUNEL染色陽(yáng)性率上調(diào)6.22倍。而在hMSCs中同時(shí)抑制miR-378*及CTGF表達(dá)后，使抑制miR-378*所引起的細(xì)胞存活增加、凋亡減少的作用消失，見(jiàn)圖2D～F及圖3。

討 論

本課題組前期研究證實(shí)，隨供體年齡改變而差異表達(dá)的miRNAs，與年齡因素引起的hMSCs功能改變相關(guān)，例如：miRNAs表達(dá)的改變可能與細(xì)胞增殖、分化、衰老及凋亡相關(guān)。本研究進(jìn)一步探討了miR-378*對(duì)hMSCs存活和凋亡的調(diào)控作用及其機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)miR-378*可通過(guò)抑制CTGF的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，減少細(xì)胞存活。

研究證實(shí)microRNA參與調(diào)控細(xì)胞生存、復(fù)制、衰老、增殖及分化等過(guò)程，其中在最近的研究中，miR-378家族被證實(shí)參與多種細(xì)胞功能的調(diào)控。例如：在抑制miR-378*表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，抑制miR-378*可以通過(guò)上調(diào)整合素β3及波形蛋白的表達(dá)，促進(jìn)傷口愈合[5]。Zhang等[6]在結(jié)直腸癌中的研究發(fā)現(xiàn)，miR-378是一種抑癌因子，可通過(guò)抑制其靶基因波形蛋白的表達(dá)，抑制腫瘤的增殖和侵襲。然而，由于信號(hào)通路調(diào)控機(jī)制和細(xì)胞類型的不同，miR-378家族對(duì)細(xì)胞存活和凋亡的調(diào)控作用尚無(wú)定論。例如：在人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株(U87)、乳腺癌細(xì)胞株(MT-1)及混合腫瘤細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn)，miR-378*可以抑制轉(zhuǎn)錄因子SuFu和Fus-1的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活，腫瘤組織生長(zhǎng)及血管生成[7]。而相反，Kim等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，在電刺激預(yù)處理的小鼠心臟干細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-378，使電刺激的細(xì)胞保護(hù)作用喪失，通過(guò)LDH釋放和TUNEL染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-378使細(xì)胞的存活能力下降。在小鼠心肌細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn)，miR-378隨供體年齡的增加而表達(dá)上調(diào)。miR-378通過(guò)抑制IGF1R和Akt信號(hào)途徑，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡[4]。與此結(jié)果類似，我們的研究發(fā)現(xiàn)miR-378*的表達(dá)隨hMSCs供體年齡的增加而升高，miR-378*可促進(jìn)hMSCs凋亡。

一個(gè)microRNA可能調(diào)控多個(gè)靶基因，多個(gè)microRNA也可能只調(diào)控一個(gè)靶基因。研究證實(shí)miR-378*可調(diào)控多種蛋白的表達(dá)，例如整合素β3、波形蛋白、Nodal 蛋白、纖連蛋白等[5, 7]。而與Kim等[8]的研究結(jié)果類似，我們發(fā)現(xiàn)miR-378*可以抑制CTGF基因及蛋白的表達(dá)。CTGF被證實(shí)不僅可調(diào)控黏附、遷移、增殖、分化、衰老、存活和凋亡等細(xì)胞功能，而且也被證實(shí)可參與調(diào)控血管生成、成骨細(xì)胞分化、成軟骨細(xì)胞分化、傷口愈合和動(dòng)脈硬化等生物過(guò)程[9]。例如：在細(xì)胞存活、凋亡的研究中發(fā)現(xiàn)，CTGF可以減少缺氧應(yīng)激等細(xì)胞微環(huán)境改變引起的細(xì)胞損傷，減少缺氧應(yīng)激引起的胰腺癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[10]。而在人橫紋肌肉瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，抑制CTGF的表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，減少細(xì)胞存活和向成肌細(xì)胞分化[11]。 同樣，在CTGF基因敲除小鼠中的研究發(fā)現(xiàn)，敲除CTGF基因后，小鼠肺細(xì)胞增殖能力下降，凋亡增加，最終導(dǎo)致小鼠肺組織發(fā)育不良[12]。Tsai等[13]在骨肉瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，CTGF可以通過(guò)促進(jìn)生存蛋白的表達(dá)，減少紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。與這些研究結(jié)果類似，我們的研究證實(shí)，CTGF隨hMSCs供體年齡的增加而表達(dá)下調(diào)。進(jìn)一步的功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CTGF的表達(dá)下降是引起hMSCs存活下降和凋亡增加的主要因素。

我們的研究發(fā)現(xiàn)：miR-378*隨hMSCs供體年齡的增加而表達(dá)上調(diào)，從而抑制了其靶基因CTGF的表達(dá)，導(dǎo)致hMSCs存活下降和凋亡增加。本課題闡述了miR-378*調(diào)控hMSCs存活及凋亡的機(jī)制，為年齡相關(guān)microRNAs——miR-378*的運(yùn)用提供了理論基礎(chǔ)和新的研究方向。

[1] 黎 佼，陳敏生，楊偉健，等. 年輕骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可通過(guò)細(xì)胞融合改善年老骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞功能[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2010, 26(5):976-981.

[2] Li J, Dong J, Zhang ZH, et al. miR-10a restores human mesenchymal stem cell differentiation by repressing KLF4[J]. J Cell Physiol, 2013, 228(12):2324-2336.

[3] 黎 佼，董 珺，張振輝，等. MicroRNA-196a通過(guò)HOXB7調(diào)控人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖功能[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2014, 30(2):278-285.

[4] Knezevic I, Patel A, Sundaresan NR, et al. A novel cardiomyocyte-enriched microRNA, miR-378, targets insulin-like growth factor 1 receptor: implications in postnatal cardiac remodeling and cell survival[J]. J Biol Chem, 2012, 287(16):12913-12926.

[5] Li H, Chang L, Du WW, et al. Anti-microRNA-378a enhances wound healing process by up-regulating integrin beta-3 and vimentin[J]. Mol Ther, 2014，22(10)：1839-1850.

[6] Zhang GJ, Zhou H, Xiao HX, et al. MiR-378 is an independent prognostic factor and inhibits cell growth and invasion in colorectal cancer[J]. BMC Cancer, 2014, 14:109.

[7] Lee DY, Deng Z, Wang CH, et al. MicroRNA-378 promotes cell survival, tumor growth, and angiogenesis by targeting SuFu and Fus-1 expression[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007, 104(51):20350-20355.

[8] Kim SW, Kim HW, Huang W, et al. Cardiac stem cells with electrical stimulation improve ischaemic heart function through regulation of connective tissue growth factor and miR-378[J]. Cardiovasc Res, 2013, 100(2):241-251.

[9] Charrier A, Brigstock DR. Regulation of pancreatic function by connective tissue growth factor (CTGF, CCN2)[J]. Cytokine Growth Factor Rev, 2013, 24(1):59-68.

[10]Bennewith KL, Huang X, Ham CM, et al. The role of tumor cell-derived connective tissue growth factor (CTGF/CCN2) in pancreatic tumor growth[J]. Cancer Res, 2009, 69(3):775-784.

[11]Croci S, Landuzzi L, Astolfi A, et al. Inhibition of connective tissue growth factor (CTGF/CCN2) expression decreases the survival and myogenic differentiation of human rhabdomyosarcoma cells[J]. Cancer Res, 2004, 64(5):1730-1736.

[12]Baguma-Nibasheka M, Kablar B. Pulmonary hypoplasia in the connective tissue growth factor (Ctgf) null mouse[J]. Dev Dyn, 2008, 237(2):485-493.

[13]Tsai HC, Huang CY, Su HL, et al. CTGF increases drug resistance to paclitaxel by upregulating survivin expression in human osteosarcoma cells[J]. Biochim Biophys Acta, 2014, 1843(5):846-854.

MicroRNA-378*enhances apoptosis of human mesenchymal stem cells by repressing expression of CTGF

DONG Jun1,3, ZENG Bo-hang1, LIU Ning-ning3, MO Pei2, XIONG Long-gen2,3, LIU Shi-ming2,3, LI Jiao2,3

(1DepartmentofOncology,2DepartmentofCardiology,3GuangzhouInstituteofCardiovascularDisease,TheSecondAffiliatedHospital,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510260,China.E-mail:gzlijiao@163.com)

AIM: To investigate the effects of microRNA-378* (miR-378*) on the survival and apoptosis of human mesenchymal stem cells (hMSCs). METHODS: The expression of miR-378* was determined by microRNA arrays and quantitative real-time PCR (qRT-PCR). H2O2was used to induce hMSCs apoptosis. By transfection of miR-378* mimic or inhibitor, we up-regulated or down-regulated miR-378* expression in hMSCs. The effect of miR-378* and connective tissue growth factor (CTGF) on hMSC survival and apoptosis were detected by MTT, LDH, caspase-3/7 and TUNEL assays. RESULTS: The expression of miR-378* was up-regulated in the old hMSCs compared with the young hMSCs. H2O2increased the expression of miR-378*, decreased the expression of CTGF. Up-regulation of miR-378* resulted in increasing apoptosis and decreasing survival of hMSCs. Conversely, down-regulation of miR-378* resulted in decreasing cell apoptosis and increasing survival. The regulation of miR-378* on hMSC apoptosis and survival was attenuated by inhibiting the expression of miR-378* and CTGF together. Direct repression of CTGF expression inhibited the hMSC survival and increased apoptosis. CONCLUSION: miR-378* enhances apoptosis of hMSCs by repressing the expression of CTGF.

Human mesenchymal stem cells; MicroRNA-378*; Apoptosis

1000- 4718(2014)12- 2238- 05

2014- 07- 11

2014- 07- 30

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(No. 81401156)； 廣州市屬高?？蒲杏?jì)劃項(xiàng)目(No. 2012C232)；廣州醫(yī)科大學(xué)博士科研項(xiàng)目(No. 2012C42)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.021

△ 通訊作者 Tel: 020-34153522; E-mail: gzlijiao@163.com