黔西北蜜環(huán)菌的誘變選育與母種培養(yǎng)基篩選*

楊清艷，蔡傳濤，劉貴周，文 平

(1.中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶植物園，云南 昆明 650223；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.大方縣九龍?zhí)炻殚_發(fā)有限公司，貴州 大方 551600)

黔西北蜜環(huán)菌的誘變選育與母種培養(yǎng)基篩選*

楊清艷1,2，蔡傳濤1**，劉貴周1，文 平3

(1.中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶植物園，云南 昆明 650223；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.大方縣九龍?zhí)炻殚_發(fā)有限公司，貴州 大方 551600)

為解決黔西北蜜環(huán)菌菌種退化造成的天麻減產(chǎn)問題，首次對(duì)其進(jìn)行誘變選育和母種培養(yǎng)基篩選，結(jié)果表明，接種菌索部位在尖端0～1.0 cm時(shí)生長(zhǎng)最好；氨水的誘變效果最好，1%氨水誘變2 min獲得穩(wěn)定遺傳的優(yōu)良突變株；最適合優(yōu)良突變株生長(zhǎng)的培養(yǎng)基配方為葡萄糖20 g、黃豆粉20 g、馬鈴薯200 g、瓊脂15 g、磷酸二氫鉀2 g，水1 000 mL，pH自然。

蜜環(huán)菌；菌索；誘變選育；培養(yǎng)基篩選

蜜環(huán)菌(Armillariamellea)別名蜜環(huán)蕈、榛蘑、青岡蕈，屬于真菌門、擔(dān)子菌亞門、層菌綱、傘菌目、口蘑科、蜜環(huán)菌屬真菌[1，2]。蜜環(huán)菌是一類經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的大型真菌，分布極廣，包括果園、葡萄園、森林地區(qū)[3，4]和城市地區(qū)[5-7]，對(duì)樹木有較強(qiáng)的侵染性[8]，為名貴中藥天麻(GastrodiaelataBl.)和豬苓(Grifolaumbellata)生長(zhǎng)繁殖所必需。

天麻沒有根、莖、葉的分化，因此它不能通過(guò)根吸收營(yíng)養(yǎng)，不能進(jìn)行光合作用，天麻原球莖需要蜜環(huán)菌侵入原球莖提供營(yíng)養(yǎng)才能發(fā)育成成體球莖。目前野生天麻被大量采挖，資源短缺，進(jìn)行仿野生種植成為開發(fā)天麻市場(chǎng)、提高天麻產(chǎn)量的重點(diǎn)，然而選育出當(dāng)?shù)貎?yōu)良的蜜環(huán)菌菌株成為天麻仿野生栽培綜合配套技術(shù)研究的瓶頸。

天麻栽培的蜜環(huán)菌連續(xù)無(wú)性繁殖，菌種會(huì)發(fā)生嚴(yán)重退化，從而導(dǎo)致天麻的產(chǎn)量和天麻素質(zhì)量分?jǐn)?shù)急劇下降[9]，黔西北天麻栽培所用的蜜環(huán)菌已出現(xiàn)生長(zhǎng)速度慢、菌索細(xì)、易被雜菌抑制甚至殺死、抗旱能力差等缺陷，這些問題嚴(yán)重影響了天麻的產(chǎn)量和品質(zhì)，仿野生栽培中出現(xiàn)菌索過(guò)細(xì)、“空窩”、菌索過(guò)早干枯等狀況。所以，選育出黔西北適合于天麻栽培的蜜環(huán)菌優(yōu)良菌株，已成為提高天麻產(chǎn)量與品質(zhì)的迫切問題。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

貴州省畢節(jié)市大方縣九龍?zhí)炻殚_發(fā)有限公司采自野生天麻生長(zhǎng)地青岡樹根的野生蜜環(huán)菌菌索，已應(yīng)用于當(dāng)?shù)靥炻樵耘唷?/p>

1.2 培養(yǎng)基

配方1：麥麩30 g、葡萄糖20 g、磷酸二氫鉀1.5 g、瓊脂18 g，水1 000 mL，pH自然；配方2：玉米粉120 g、黃豆粉20 g、蔗糖20 g、瓊脂15 g，水1 000 mL，pH自然；配方3：麥芽糖20 g、瓊脂20 g，水1 000 mL，pH自然；配方4：馬鈴薯(削皮，下同)200 g、麥麩30 g、瓊脂20 g，水1 000 mL，pH自然；配方5：麥麩50 g、玉米粉100 g、葡萄糖10 g、瓊脂5 g，水1 000 mL，pH自然；配方6：胡蘿卜150 g、葡萄糖20 g、硫酸鎂1 g、瓊脂20 g，水1 000 mL，pH自然；配方7：馬鈴薯100 g、木屑30 g、玉米粉60 g、瓊脂10 g、磷酸二氫鉀1.5 g、硫酸鎂1 g、維生素B1 10 mg，水1 000 mL，pH自然；配方8：麥芽糖10 g、葡萄糖10 g、蛋白胨4 g、磷酸二氫鉀0.46 g、磷酸氫二鉀1 g、硫酸鎂1 g、瓊脂20 g，水1 000 mL，pH自然；配方9：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、芝麻粉20 g、玉米粉10 g、磷酸二氫鉀2 g、硫酸鎂1.5 g，水1 000 mL，pH自然；配方10：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂1.5 g、蛋白胨5 g、瓊脂20 g，水1 000 mL，pH自然；配方11：葡萄糖20 g、黃豆粉20 g、馬鈴薯(削皮)200 g、瓊脂15 g、磷酸二氫鉀2 g、水1 000 mL，pH自然；PDA培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、馬鈴薯200 g、瓊脂18 g，水1 000 mL，pH自然。

1.3 蜜環(huán)菌菌索分離

嚴(yán)格無(wú)菌條件下，用無(wú)菌水清洗蜜環(huán)菌5次，用接種剪從尖端開始剪成相同長(zhǎng)度，不同部位的0.5 cm(0 cm～0.5 cm，0.5 cm～1.0 cm，1.0 cm～1.5 cm，1.5 cm～2.0 cm)，放入0.1%L汞溶液中浸泡約2 min，取出后再用無(wú)菌水沖洗5次，用無(wú)菌濾紙吸凈表面水后，置于PDA培養(yǎng)皿上，每皿放置4段，每個(gè)取樣部位處理3個(gè)重復(fù)。25°C暗培養(yǎng)，每天對(duì)菌索不同菌索部位接種后菌索顏色、密度、分枝數(shù)和粗細(xì)等生長(zhǎng)狀況進(jìn)行觀察記錄。

1.4 蜜環(huán)菌化學(xué)試劑誘變選育

將蜜環(huán)菌母種擴(kuò)繁備用，用氨水、亞硝酸鈉和硫酸二乙酯誘變蜜環(huán)菌菌索，將菌索幼嫩尖端切成2 mm小段，0.1% L汞溶液消毒1 min，置于培養(yǎng)皿中，去掉菌索皮層留下菌髓， 0.1%、0.5%和1%的氨水分別處理0.5 min、1 min和2 min，0.2%、0.4%和0.8%的硫酸二乙酯分別誘變1 min、3 min和5 min，0.02 mol·L-1、0.04 mol·L-1和0.08 mol·L-1的亞硝酸鈉分別誘變1 min、2 min和3 min，硫酸二乙酯誘變后用20%硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)，將誘變后的蜜環(huán)菌菌索、菌髓用無(wú)菌水沖洗5次，無(wú)菌濾紙吸干表面水分，接種到PDA平板。每種誘變劑分別選取未加誘變劑但其他處理一樣的菌索菌髓作對(duì)照組，所有處理均設(shè)3個(gè)重復(fù)，25℃避光培養(yǎng)。

每3天測(cè)量每組菌索的生長(zhǎng)速率，直至菌索停止生長(zhǎng)，最后計(jì)算菌索平均生長(zhǎng)速率；觀察記錄菌索顏色、密度、粗細(xì)、分枝數(shù)等指標(biāo)。

1.5 蜜環(huán)菌優(yōu)良突變株篩選及遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)

從蜜環(huán)菌菌索平均生長(zhǎng)速率和生長(zhǎng)特征2個(gè)方向進(jìn)行綜合考察篩選，選出菌索平均生長(zhǎng)速率大、密度大、粗壯、所需萌發(fā)時(shí)間短和分枝多的菌株作為優(yōu)良突變株，將其接種到PDA培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)3次，觀察其生長(zhǎng)速率、分枝數(shù)、顏色、粗細(xì)等性狀能否穩(wěn)定遺傳，若穩(wěn)定，則作為培養(yǎng)基篩選的起始菌株。

1.6 蜜環(huán)菌優(yōu)良突變株培養(yǎng)基篩選

將誘變所得的穩(wěn)定遺傳優(yōu)良突變株在嚴(yán)格無(wú)菌條件下截取幼嫩菌索按照1.4的消毒接種方法進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)得到的大量菌索供培養(yǎng)基篩選用。

截取幼嫩菌索尖端接種到1.2的12種不同組成的培養(yǎng)基上，每種配方處理3個(gè)重復(fù)。25°C避光培養(yǎng)，觀察記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜜環(huán)菌菌索取樣部位篩選

蜜環(huán)菌菌索不同取樣部位的生長(zhǎng)特征見表1。

表1 蜜環(huán)菌菌索不同取樣部位的生長(zhǎng)特征

注：分枝數(shù)(個(gè))：+表示0～10個(gè)； ++表示11個(gè)～20個(gè)； +++表示21個(gè)～30個(gè)。

不同菌索段接種后的生長(zhǎng)特征差異比較大，根據(jù)表1可以分析出，接種尖端1.0 cm以內(nèi)的菌索才能保證蜜環(huán)菌菌索的正常生長(zhǎng)和后續(xù)試驗(yàn)的可重復(fù)性。

2.2 蜜環(huán)菌化學(xué)誘變選育

2.2.1 菌索萌發(fā)率測(cè)定

菌株經(jīng)化學(xué)試劑誘變后有11組菌索未萌發(fā)，共處理27組，因此萌發(fā)率為59.26%。

2.2.2 不同誘變劑處理后的生長(zhǎng)特征

經(jīng)3種誘變劑誘變后，根據(jù)粗細(xì)、密度、分枝數(shù)、顏色和平均生長(zhǎng)速率等生長(zhǎng)特征見表2和表3。

由表2、表3可以初步分析出氨水誘變效果最好，其次是亞硝酸鈉，硫酸二乙酯誘變效果最差。比較表2生長(zhǎng)特征，其中0.1%氨水0.5 min、0.1%氨水1 min、0.1%氨水2 min、1%氨水2 min、0.04 mol·L-1亞硝酸鈉2 min、0.08 mol·L-1亞硝酸鈉1 min和0.08 mol·L-1亞硝酸鈉2 min菌索粗細(xì)和密度優(yōu)于其他處理組。

2.2.3 不同誘變劑處理后的平均生長(zhǎng)速率

方差分析顯示，菌索經(jīng)不同誘變劑處理后平均生長(zhǎng)速率的差異顯著(p<0.05)，除了0.1%氨水0.5 min和0.08 mol·L-1亞硝酸鈉3 min，其他處理組與各自對(duì)照組的差異均顯著(p<0.05)。

如表3所示，0.08 mol·L-1亞硝酸鈉誘變1 min后菌索生長(zhǎng)速率最大，其次是1%氨水2 min、0.1%氨水1 min、0.5%氨水0.5 min、0.5%氨水2 min、0.04 mol·L-1亞硝酸鈉2 min。

從天麻栽培中所需蜜環(huán)菌生長(zhǎng)特性角度出發(fā)，首先需要篩選出菌索平均生長(zhǎng)速率大的突變株，結(jié)合菌索粗細(xì)、密度、分枝數(shù)、萌發(fā)時(shí)間和色澤幾個(gè)指標(biāo)，最終篩選出0.08 mol·L-1亞硝酸鈉1 min、0.1%氨水1 min和1%氨水2 min 3種最佳誘變條件，得到3株優(yōu)良突變株。

2.3 優(yōu)良突變株的遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

對(duì)蜜環(huán)菌誘變后篩得的3株優(yōu)良突變株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)，繼代培養(yǎng)3次，發(fā)現(xiàn)3個(gè)突變株的生長(zhǎng)特性均能穩(wěn)定地遺傳，1%氨水2 min的遺傳穩(wěn)定性最高，3次繼代培養(yǎng)中各生長(zhǎng)特征無(wú)變化。

表2 蜜環(huán)菌菌索經(jīng)不同誘變處理后的生長(zhǎng)特征

注：分枝數(shù)(個(gè))： +表示0～10個(gè)； ++表示11個(gè)～20個(gè)； +++表示21個(gè)～30個(gè)； ++++表示30個(gè)～40個(gè)。下同。

表3 蜜環(huán)菌菌索經(jīng)不同誘變處理后的平均生長(zhǎng)速率

注：與對(duì)照組比較，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns差異不顯著。下同。

2.4 蜜環(huán)菌優(yōu)良突變株母種培養(yǎng)基篩選

遺傳最為穩(wěn)定的優(yōu)良突變株(1%氨水誘變2 min)，在不同配方上菌株生長(zhǎng)特性差異顯著。蜜環(huán)菌生長(zhǎng)特征見表4。

由表4可見，配方1、配方2、配方7、配方9和配方11的菌索密度、菌索粗細(xì)和菌索分枝數(shù)均大于其他配方，菌索萌發(fā)時(shí)間均小于其他培養(yǎng)基配方。方差分析顯示見表5。

由表5可見，除配方2，其他配方與對(duì)照組的差異均顯著(p<0.05)，配方7的菌索平均生長(zhǎng)速率最大，其次是配方9、配方11和配方6。以菌索平均生長(zhǎng)速率為主要篩選指標(biāo)，結(jié)合菌索密度、粗細(xì)、分枝數(shù)和色澤，最終得出配方7、配方9和配方11 3種培養(yǎng)基配方均適合蜜環(huán)菌優(yōu)良突變株生長(zhǎng)，其中配方7最佳。

從配方成分上分析，葡糖糖和馬鈴薯是較為理想的碳源和氮源，再添加玉米粉、芝麻粉、黃豆粉能使菌索更為粗壯，添加適量的無(wú)機(jī)鹽可以加快菌索生長(zhǎng)。

表4 蜜環(huán)菌優(yōu)良突變株在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特征

表5 蜜環(huán)菌優(yōu)良突變株在不同培養(yǎng)基上的菌索平均生長(zhǎng)速率

3 討論

目前蜜環(huán)菌的相關(guān)研究主要集中在蜜環(huán)菌多糖等成分研究[10-12]和分離純化方面[13，14]，而在選育方面研究極少，蜜環(huán)菌進(jìn)行多代天麻栽培后出現(xiàn)明顯的菌種退化與變異，如用已發(fā)生退化的菌種拌栽天麻則導(dǎo)致天麻產(chǎn)量與品質(zhì)急劇下降[15]。同時(shí)，趙俊[16]等研究表明，由于全國(guó)各個(gè)地區(qū)天麻種類不同，跨區(qū)域引進(jìn)菌種或推廣是極不科學(xué)的。本研究加大了對(duì)黔西北本地天麻共生蜜環(huán)菌的研究力度，從優(yōu)良菌種選育到培養(yǎng)基篩選等方面進(jìn)行全面探討。

化學(xué)誘變更多的是引起分子水平上的變化，對(duì)生物分子的影響通常是個(gè)別、局部的，不易引起染色體畸變或損傷， 因此，產(chǎn)生點(diǎn)突變的比例高，突變譜的穩(wěn)定性好[17，18]，化學(xué)誘變還有突變頻率高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)[19]。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)氨水對(duì)蜜環(huán)菌誘變效果較好。亞硝酸鈉有一定的誘變效果，但不如氨水明顯，可能是由于誘變劑濃度和時(shí)間不合適。硫酸二乙酯的誘變效果差，致死率接近100%。

本研究對(duì)黔西北天麻栽培所用的蜜環(huán)菌進(jìn)行了分離純化、誘變選育和母種培養(yǎng)基篩選，得到了菌索平均生長(zhǎng)速率大、密度大、萌發(fā)時(shí)間短、菌索粗壯、分枝數(shù)多、菌索色澤好和遺傳性狀穩(wěn)定的優(yōu)良突變株及其合適的母種培養(yǎng)基配方，關(guān)于黔西北蜜環(huán)菌的抗旱、抗雜菌污染能力等尚需進(jìn)一步開展研究。

[1]王秋穎，郭順星，樊錦艷. 不同蜜環(huán)菌菌株生物學(xué)特性及菌絲體多糖含量的研究[J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志，2001，36 (9)：588-590.

[2]李福后，王偉霞. 5株蜜環(huán)菌產(chǎn)幾種胞外酶活性比較[J]. 淮海工學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，15 (3)：58-61.

[3]Rishbeth J. Species ofArmillariain southern England[J]. Plant Pathology, 1982(31)：9-17.

[4]Rishbeth J.Armillariain an ancient broadleaved woodland[J]. European Journal of Forest Pathology, 1991(21): 239-249.

[5]Coetzee MPA, Wingfield BD, Harrington TC, et al. The root rot fungusArmillariamelleaintroduced into South Africa by early Dutch settlers[J]. Molecular Ecology, 2001(10): 387-396.

[6]Motta JJ, Korhonen K. A note onArmillariamelleaandArmillariabulbosafrom the middle Atlantic states [J]. Mycologia, 1986(78): 471-474.

[7]Rishbeth J. The importance of the honey mushroom(Armillaria) in urban forestry [J]. Arboriculture Journal, 1983(7): 217-225.

[8]Kendra B, Ravi B, Phillip F. A rapid infection assay forArmillariaand real-time PCR quantitation of the fungal biomass in planta [J]. Fungal Biology, 2010(114): 107-119.

[9]孫士青，馬耀宏，孟慶軍，等. 野生、退化、復(fù)壯蜜環(huán)菌對(duì)天麻產(chǎn)量及天麻素量的影響[J]. 中草藥，2009，40 (8)：1300-1302.

[10]宋成芝，徐燕. 蜜環(huán)菌的化學(xué)成分及藥理作用研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38 (10)：5119-5120.

[11]許寶奎，操玉平，于敏，等. 蜜環(huán)菌多糖對(duì)大鼠INS-1細(xì)胞凋亡的拮抗作用[J]. 中國(guó)食用菌，2010，29 (1)：45-48.

[12]劉曉杰，焦連慶，楊利民，等. 蜜環(huán)菌多糖的分離純化及PMP衍生化HPLC分析[J]. 中國(guó)藥師，2012，15 (4)：448-451.

[13]肖波，胡開治. 蜜環(huán)菌菌種分離新法-天麻組織分離法[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2006，33 (3)：118-121.

[14]吳尊華，王紹柏. 蜜環(huán)菌菌種的分離純化復(fù)壯研究[J]. 中國(guó)食用菌，2011，30 (4)：17-19.

[15]孫士青，史建國(guó)，李雪梅，等. 連續(xù)無(wú)性繁殖乙型蜜環(huán)菌對(duì)天麻生物產(chǎn)量及天麻素含量的影響[J]. 中國(guó)中藥雜志，2009，34 (3)：359-360.

[16]趙俊，趙杰. 中國(guó)蜜環(huán)菌的種類及其在天麻栽培中的應(yīng)用[J]. 食用菌學(xué)報(bào)，2007，14 (1)：67-72.

[17]徐冠仁. 植物誘變育種學(xué)[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1996：1.

[18]柳學(xué)余. 農(nóng)作物化學(xué)誘變育種[M]. 南京：東南大學(xué)出版社，1992：2.

[19]崔霞，梁燕，李翠，秦蕾，等. 化學(xué)誘變及其在蔬菜育種中的應(yīng)用[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2013，41 (3)：205-212.

Mutation Breeding and Medium Screening ofArmillariamelleain Northwestern Guizhou

YANG Qing-yan1,2, CAI Chuan-tao1, LIU Gui-zhou1, WEN Ping3

(1.Xishuangbanna Tropical Botanical Garden, KunmingYunnan650223; 2.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing100049; 3.Dafang Gastrodia Elata Development Company, LTD, DafangGuizhou551700)

In order to solve the problem ofGastrodiaelataBlume’s yield drawdown caused by degradation ofArmillariamelleain northwestern Guizhou, mutation breeding and medium screening ofArmillariamelleawere studied for the first time. The results suggested thatArmillariamellea’sgrowth was better when the transferring part was 0～1.0 cm from the top end of rhizomorphs. It was proved that NH3·H2O was the most effective mutagen. The best induced mutation conditions were found: 1%NH3·H2O induced 2 min. The optimal culture medium for high-quality mutants was glucose 20 g, soybean meal 20 g, potato 200 g, agar 15 g, KH2PO42 g, H2O 1 000 mL, natural pH.

Armillariamellea; Rhizomorph; Mutation breeding; Medium optimization

*項(xiàng)目來(lái)源：國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題“喀斯特山區(qū)生態(tài)環(huán)境保護(hù)與植物類中藥材開發(fā)關(guān)鍵技術(shù)研究與示范”(2007BAD53B04)；貴州省科技廳畢節(jié)市人民政府中科院昆明分院科技合作項(xiàng)目“天麻栽培中替代菌材與野生萌發(fā)菌研究及其成果示范”(省地院合2011-5)。

楊清艷(1988-)，女，在讀碩士研究生，主要從事藥用植物栽培研究。E-mail：lindy7286@126.com

**通信作者： 蔡傳濤，研究員，研究方向：主要從事藥用植物栽培研究。E-mail：caict@xtbg.ac.cn

2014-03-30

S646.9

A

1003-8310(2014)03-0012-04