產(chǎn)不同色素古尼擬青霉菌株功效成分分析*

賈學(xué)淵，郭 瑞，虞 泓，陳自宏，曾文波，楊俊媛

(云南大學(xué)中草藥生物資源研究所云百草實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650091)

產(chǎn)不同色素古尼擬青霉菌株功效成分分析*

賈學(xué)淵，郭 瑞，虞 泓**，陳自宏，曾文波，楊俊媛

(云南大學(xué)中草藥生物資源研究所云百草實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650091)

為比較產(chǎn)不同色素古尼擬青霉菌株菌絲體功效成分的差異，本研究對產(chǎn)不同色素古尼擬青霉菌株及對應(yīng)古尼蟲草樣品進(jìn)行試驗(yàn)分析。觀察其菌落形態(tài)和菌落顏色；用紫外分光光度法測定多糖和D-甘露醇含量；用HPLC法測定蟲草素、腺苷、肌苷、胸苷、鳥苷、尿苷6種核苷類成分含量。結(jié)果顯示，菌落背面綠色的菌株pgjt03，腺苷含量是古尼蟲草樣品YHCGGB0145的6倍，且蟲草素、胸苷、鳥苷、尿苷含量也均達(dá)到最高，與它對應(yīng)的古尼蟲草樣品YHCGJT0148蟲草素、腺苷、鳥苷、尿苷含量均高于其它古尼蟲草；而菌落背面淺灰色的菌株pgjt01，核苷類成分含量均低于其他菌株。說明古尼擬青霉產(chǎn)色素與功效成分之間有一定的相關(guān)性，古尼擬青霉所產(chǎn)色素顏色越深，功效成分的含量相對越高。通過該研究指出，菌落顏色可作為篩選古尼擬青霉菌株高產(chǎn)功效成分的標(biāo)志之一，且菌落背面綠色的菌株pgjt03，性狀優(yōu)良，生長較快，可作為潛在的生產(chǎn)菌株。

古尼蟲草；古尼擬青霉；色素；功效成分

古尼蟲草Cordycepsgunni(Berk.) Berk.，是1種蟲草真菌寄生在蝙蝠蛾科幼蟲中形成的復(fù)合體，主產(chǎn)澳大利亞、新西蘭和我國的貴州、江西、湖南、安徽和廣東等地。梁宗琦對中國的古尼蟲草進(jìn)行首次報(bào)道[1]，并通過組織分離和子囊孢子分離的方法鑒定出其無性型——古尼擬青霉PaecilomycesgunniiZ.Q. Liang[2]。研究發(fā)現(xiàn)，古尼蟲草及其無性型古尼擬青霉含有多種生物活性物質(zhì)，如多糖、甘露醇、核苷類物質(zhì)、甾醇等[3]，具有提高免疫力[4]、促進(jìn)睡眠[5]、鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜[6]、抗腫瘤[7]、抗衰老及心率失常[8]、提高記憶力[9]等多種藥理活性。但由于古尼蟲草目前還不能進(jìn)行大規(guī)模人工栽培，只能依靠挖掘野生蟲草，因此可以采用與其藥理作用相近的菌絲體代替野生蟲草入藥。

本實(shí)驗(yàn)室從貴州和江西等地獲得若干古尼蟲草新鮮材料，通過菌種分離，發(fā)現(xiàn)分離出的4株古尼擬青霉菌株菌落形態(tài)差異較大，且菌落顏色明顯不同。為探討古尼擬青霉菌株產(chǎn)色素與功效成分的關(guān)系，本研究對所試菌株的菌落形態(tài)和菌落顏色進(jìn)行觀察，并測定和比較不同菌株菌絲體及對應(yīng)古尼蟲草多糖、D-甘露醇、腺苷、鳥苷、肌苷、尿苷、胸苷、蟲草素的含量。試圖探討古尼擬青霉菌株產(chǎn)色素與功效成分之間的關(guān)系，為篩選高產(chǎn)功效成分古尼擬青霉菌株提供1種快速簡便的方法。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 材料來源

本試驗(yàn)材料古尼蟲草采自貴州省銅仁市和江西省宜春地區(qū)，根據(jù)形態(tài)、ITS及多基因分子系統(tǒng)分析[10，11]，鑒定為Cordycepsgunni(Berk.) Berk。本研究菌株分離自對應(yīng)古尼蟲草，根據(jù)形態(tài)、ITS及多基因分子系統(tǒng)分析，鑒定為PaecilomycesgunniiZ.Q.Liang，為古尼蟲草無性型。詳見表1。

表1 本研究實(shí)驗(yàn)材料來源

1.2 培養(yǎng)基成分

菌種分離采用加1%蛋白胨PDA(PPDA)的固體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基為馬鈴薯浸出汁20%、蛋白胨1%、蔗糖2%、KH2PO40.05%、MgSO40.1%。

1.3 儀器與試劑

戴安ULTIMATE 3000高效液相色譜儀；紫外分光光度計(jì)型號T6新世紀(jì)，購買自北京普析通用儀器有限公司；恒溫震蕩培養(yǎng)箱型號SCS-24，購買自上海市離心機(jī)械研究所；電熱鼓風(fēng)干燥箱型號DHG-9203A，購買自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。甘露醇、腺苷等標(biāo)準(zhǔn)品購于美國 Sigma公司，其余試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 菌種分離

組織分離：將新鮮標(biāo)本菌核部分仔細(xì)剝離出，用清水洗去塵土雜質(zhì)，用75%酒精表面消毒。在無菌條件下，用刀切去蟲體表皮，挑取蟲體內(nèi)部組織塊于加1%蛋白胨PDA(PPDA)平板上，每皿放3塊～5塊組織塊，25℃恒溫培養(yǎng)。

2.2 菌落形態(tài)觀察

將純化的4株供試菌株用直徑5 mm的自制打孔器打孔，然后將菌塊接于PPDA固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察其菌落顏色、形態(tài)。

2.3 蟲草多糖——苯酚-硫酸法

樣品多糖含量測定：稱取樣品 0.2500 g，加蒸餾水30 mL，熱回流2 h后趁熱抽濾，用蒸餾水洗殘?jiān)瑢V液、洗液合并，定容至50 mL。量取定容好的溶液20 mL，置于揮發(fā)皿中揮干。將揮發(fā)后剩余物用1 mL蒸餾水溶解，置于10 mL離心管中，加入5 mL無水乙醇，混勻，置于離心機(jī)中 4 000 r·min-1離心15 min，棄上清液。沉淀物加蒸餾水、無水乙醇及離心，過程再重復(fù)2次，然后取沉淀物用蒸餾水溶解定容至50 mL作為樣品液待用。吸取2 mL樣品液至20 mL試管中，加入1 mL 5%苯酚溶液，混勻，快速加入7 mL濃硫酸，混勻，置于40℃水浴中30 min，再置于冰水浴中5 min，之后快速升至室溫，用分光光度計(jì)測定490 nm波長吸光度。以蒸餾水代替待測樣品溶液，用同樣方法操作作為空白對照[12]。

2.4 D-甘露醇測定方法

樣品中蟲草酸(D-甘露醇)總含量測定[13]：稱取樣品 0.2500 g，加蒸餾水30 mL，熱回流2 h后，趁熱抽濾，用蒸餾水洗殘?jiān)?，將濾液、洗液合并定容至50 mL。量取定容好的溶液1 mL，加入20 mL試管中，并加1 mL高碘酸鉀(0.350 g高碘酸鉀用0.12 mol·L-1鹽酸定容至100 mL)溶液，混勻，室溫放置10 min，加2 mL 0.1%的L-鼠李糖溶液以除去過多的高碘酸鹽，混勻，加入4 mL新鮮配制的NaSh(7.500 g醋酸銨、100 μL冰醋酸、100 μL乙酰丙酮，定容至50 mL)試劑，53℃水浴加熱15 min，之后快速冷卻至室溫，用分光光度計(jì)測定412 nm波長處吸光度。以蒸餾水代替待測樣品溶液，用同樣方法操作作為空白對照。

2.5 腺苷等核苷類成分采用HPLC法

色譜條件：戴安原裝ACCLAIM pgjt018色譜柱，5 μm，4.6×250 mm；流動(dòng)相V(甲醇)∶V(水)=15∶85；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30℃；紫外檢測波長260 nm。

樣品處理：準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的樣品0.1 g置于5 mL離心管中，準(zhǔn)確加20%甲醇2 mL，超聲波振蕩120 min，冷卻至室溫后，離心15 min，將上清液于0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液供HPLC分析，進(jìn)樣量10 μL[14]。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS軟件中的Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 古尼擬青霉菌株菌落顏色及菌落形態(tài)對比

不同菌株菌落形態(tài)及顏色的詳細(xì)比較情況見表2。古尼擬青霉菌落形態(tài)及古尼蟲草形態(tài)見圖1。

表2 不同菌株菌落形態(tài)及菌落顏色對比

由圖1、表2可見，4株古尼擬青霉菌株菌落顏色、菌落形態(tài)及對應(yīng)古尼蟲草形態(tài)明顯不同。

3.2 不同菌株及對應(yīng)古尼蟲草功效成分分析

供試菌株液體發(fā)酵菌絲體及對應(yīng)古尼蟲草多糖、D-甘露醇含量經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后，結(jié)果見表3。

由表3可見，菌落背面淺灰色的菌株pggb01多糖含量最高，達(dá)12.74 mg·g-1，但與其他樣品相比差異不顯著；菌落背面綠色的菌株pgjt03多糖含量最低，與其他樣品相比差異顯著。古尼蟲草樣品D-甘露醇含量相對高于菌絲體，菌落背面黃色的菌株pgjt02，D-甘露醇含量最低。

表3 不同菌株及對應(yīng)古尼蟲草多糖、D-甘露醇含量分析

注：數(shù)字后所附字母為 Duncan’s 多重比較結(jié)果，字母相同表示無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，小寫表示差異達(dá)到0.05顯著水平。下同。

各樣品核苷類成分的含量經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后見表4。

蟲草素是蟲草所特有的功效成分之一，由表4可見，菌落背面綠色的菌株pgjt03蟲草素含量最高，達(dá)到109.55 μg·g-1，且與其他樣品相比差異顯著(p<0.05)，與它對應(yīng)的古尼蟲草樣品YHCGJT0148，蟲草素含量也高于其他古尼蟲草；菌落背面淺灰色的菌株pggb01蟲草素含量最低。菌落背面綠色的菌株pgjt03，腺苷含量最高達(dá)2 459.64 μg·g-1，且與其他樣品相比差異顯著(p<0.05)；菌落背面淺灰色的菌株pggb01腺苷含量最低。另外，菌落背面綠色的菌株pgjt03，胸苷、鳥苷、尿苷均達(dá)到最高，與其他樣品相比差異顯著(p<0.05),且與它對應(yīng)的古尼蟲草樣品YHCGJT0148腺苷、鳥苷、尿苷也均高于其他古尼蟲草。菌落背面淺灰色的菌株pggb01，胸苷、鳥苷、肌苷含量最低。

表4 不同菌株及對應(yīng)古尼蟲草核苷類成分分析

4 討論

古尼擬青霉在鎮(zhèn)痛、提高人體免疫力、抗紫外輻射、抗腫瘤、抗衰老等方面有明顯的作用[15]。其中腺苷(Adenosine)和蟲草素(Cordycepin)是古尼擬青霉重要的活性成分。腺苷具有抗病毒，抑制血小板積聚，防治腦血栓、腦溢血，消除面斑，抗衰防皺的作用[16]，蟲草素具有抗菌、明顯抑制腫瘤生長的作用[17，18]，且腺苷被中國藥典(2005版)[19]規(guī)定為冬蟲夏草的質(zhì)控指標(biāo)，因此研究保健食品中腺苷和蟲草素的含量具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。該研究中，菌落背面綠色的菌株pgjt03，腺苷和蟲草素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他樣品，其腺苷含量是古尼蟲草樣品YHCGGB0145的6倍。這就為實(shí)際應(yīng)用中，篩選高產(chǎn)腺苷古尼擬青霉菌株奠定了一定的基礎(chǔ)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，古尼擬青霉菌株菌落顏色不同，其功效成分含量也不同。Shrestha Bhushan[20]對蛹蟲草中產(chǎn)色素基因進(jìn)行了研究，而本文對蟲草真菌產(chǎn)色素與功效成分的關(guān)系進(jìn)行了報(bào)道。菌落背面綠色的菌株pgjt03，蟲草素、腺苷、胸苷、鳥苷、尿苷均達(dá)到最高，其對應(yīng)古尼蟲草樣品YHCGJT0148，腺苷、鳥苷、尿苷含量也明顯高于其它古尼蟲草；而菌落背面淺灰色的菌株pggb01，核苷類成分含量均低于其他菌株。說明古尼擬青霉菌株產(chǎn)色素與功效成分之間有一定的相關(guān)性，古尼擬青霉菌株產(chǎn)色素顏色越深，功效成分含量相對越高，且菌絲體功效成分含量與古尼蟲草樣品也有一定的對應(yīng)關(guān)系。

通過該研究暗示出，菌落顏色可作為篩選古尼擬青霉菌株高產(chǎn)功效成分的標(biāo)志之一。且菌落背面綠色的菌株pgjt03，蟲草素、腺苷、胸苷、鳥苷、尿苷含量均到達(dá)最高，其生長較快，可作為潛在的生產(chǎn)菌株。

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獲得銀耳菌種的3個(gè)方法

獲得銀耳菌種的方法主要有擔(dān)孢子彈射分離法、組織分離法和耳木分離法。

1 孢子彈射法

這是利用新鮮的、成熟的子實(shí)體自動(dòng)彈射出擔(dān)孢子來獲得純菌種的方法。取朵大、色白、無病蟲害的新鮮銀耳作為種耳。用無菌水漂洗銀耳數(shù)次，再用無菌紗布或吸水紙，把銀耳表面的水分吸干。因?yàn)槎砻嫒粲斜∷畬?，便?huì)影響銀耳擔(dān)孢子的彈射，并容易污染上雜菌。再把種耳切一小塊，以放入三角瓶或放入試管中不會(huì)碰到瓶壁或管壁為度，隨后用不銹鋼小鉤鉤住小耳片，迅速懸掛在三角瓶或試管內(nèi)，同時(shí)注意勿使種耳碰到培養(yǎng)基表面，以防污染雜菌，塞上棉塞，然后放在20℃～25℃條件下，經(jīng)過24 h，從耳片上彈射出來的擔(dān)孢子，落在光滑的培養(yǎng)基表面上形成1個(gè)霧狀的孢子印。此時(shí)，在無菌箱或無菌室中，將懸于瓶內(nèi)的耳片取出，再塞上棉塞，移到20℃～25℃的室中培養(yǎng)，經(jīng)過2 d～3 d，培養(yǎng)基表面就會(huì)出現(xiàn)許多乳白色、糊狀的小菌落，此系銀耳的酵母狀分生孢子。當(dāng)培養(yǎng)基上出現(xiàn)酵母狀分生孢子的菌落時(shí)，為了防止和減少污染，應(yīng)盡快地進(jìn)行提純，即挑取少許沒有雜菌的銀耳酵母狀分生孢子，移入新的試管中進(jìn)行培養(yǎng)。不管銀耳擔(dān)孢子或酵母狀分生孢子都不容易萌發(fā)成菌絲，所以直接用于生產(chǎn)時(shí)有困難，目前已較少采用。不過，為了獲得銀耳有性繁殖的后代，必須采用擔(dān)孢子分離法，并使之萌發(fā)成單核菌絲，然后進(jìn)行配對實(shí)驗(yàn)。

2 組織分離法

和香菇、平菇不同，銀耳組織分離法比較難操作，實(shí)用意義也不大。因?yàn)槎坏┠z質(zhì)化之后，就不容易再長出菌絲，況且段木種植的或野生的銀耳，暴露在外界的生長時(shí)間很長，耳片上必定會(huì)附著各種雜菌，組織分離時(shí)既不容易把附著的雜菌洗掉，又不容易用藥品進(jìn)行表面的滅菌處理，且容易導(dǎo)致銀耳和條菌同歸于盡。只有位于樹皮和木質(zhì)部之間的肥厚的耳基比較容易進(jìn)行組織分離，可以獲得銀耳的純菌絲。不過用耳基分離來的銀耳純菌絲常是鵝黃色的或橙黃色的，不是純白的，菌絲生長的速度也比較慢，效果也不太理想。

3 耳木分離法

利用長了銀耳子實(shí)體的段木(簡稱耳木)來進(jìn)行分離，是目前獲得有實(shí)用價(jià)值的銀耳菌種最主要的方法。耳木分離法的主要技術(shù)是排除耳木中雜菌的干擾，防止分離時(shí)污染雜菌，必須把銀耳菌絲和香灰菌絲單獨(dú)分離出來。對初學(xué)者來說，耳木分離法是不容易掌握的，必須反復(fù)練習(xí)，直到掌握分離的要領(lǐng)。

中國食用菌商務(wù)網(wǎng)

2014.05.02

Analysis of Effective Components in Different Pigment Strains ofPaecilomycesgunnii

JIA Xue-yuan, GUO Rui, YU Hong, CHEN Zi-hong, ZENG Wen-bo, YANG Jun-yuan

(Yunnan Herbal Laboratory, Institute of Herb Biotic Resources, Yunnan University, KunmingYunnan650091)

In order to compare the effective components with the different pigment strains ofPaecilomycesgunnii, the colonial morphologies and colors of different pigment strains were observed. The contents of cordycepic polysaccharide and D-mannitol were determined by ultraviolet spectroscopy. The cordycepin, adenosine, thymidine, vernine, inosine and uridine were determined by HPLC. The analytical results showed that the strain pgjt03 with colony green back side had the highest contents of cordycepin, thymidine, vernine and uridine in all of strains, it was 6 times than YHCGGB0145 in adenosine, and the counterpart sample YHCGJT0148 ofCordycepsgunniihad the higher contents of cordycepin, cordyceps adenosine, vernine and uridine than ones of the rest samples ofC.gunnii. Reversely, the strain pgjt01 with colony hoary back side had the lower contents of nucleosides than ones of the rest strains. It was illustrated that there were some relativities between the pigment strains ofP.gunniiand the effective components, and darker pigment strains ofP.gunniicontained higher the effective components. Through the study, it was implied that the colonial color of strains might be as a maker to select higher effective components ofP.gunnii, and the strain pgjt03 with colony green back side could be potential production strain, for having superior traits and fast growth.

Cordycepsgunnii;Paecilomycesgunnii; Pigment; Effective components

*項(xiàng)目來源：國家教育部博士點(diǎn)基金項(xiàng)目“冬蟲夏草復(fù)合體種群DNA序列生態(tài)地理變異式樣研究”(20125301110001)；云南省基礎(chǔ)應(yīng)用研究重點(diǎn)項(xiàng)目“云南蟲草遺傳資源及其開發(fā)利用研究”(2008CC019)。

賈學(xué)淵(1988-)，女，在讀碩士研究生，主要從事蟲草真菌系統(tǒng)學(xué)研究。E-mail:beckyjia@foxmail.com

**通信作者： 虞泓，教授。E-mail: hongyu@ynu.edu.cn 或herbfish@163.com

2014-03-15

S646.9

A

1003-8310(2014)03-0041-04