龍膽苦苷生物合成途徑研究進(jìn)展

王彩云等

摘要：龍膽苦苷屬裂環(huán)烯醚萜類化合物，是傳統(tǒng)中藥龍膽的主要有效成分，具有抗炎、保肝、利膽、健胃、抗腫瘤等藥理活性，其生物合成途徑可分為異戊烯基焦磷酸合成、裂環(huán)番木鱉酸生物合成和龍膽苦苷生物合成3個階段，受脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶、脫氧木酮糖磷酸鹽還原異構(gòu)酶、細(xì)胞色素P450等多種酶的調(diào)控。本文綜述了近年龍膽苦苷生物合成及其調(diào)控機(jī)制的研究現(xiàn)狀，旨在為龍膽苦苷生物合成及其調(diào)控機(jī)制的進(jìn)一步研究提供參考。

關(guān)鍵詞：龍膽苦苷；生物合成；MVA；MEP；轉(zhuǎn)錄因子

中圖分類號：R284.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1002-1302（2014）03-0004-06

龍膽苦苷（gentiopicroside）廣泛存在于龍膽科植物中，是滇龍膽（Gentiana rigescens）等藥用植物中一類重要的次生代謝產(chǎn)物[1]，也是龍膽瀉肝丸等180多種中藥產(chǎn)品的主要藥效成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，龍膽苦苷具有保肝、利膽、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、健胃、抗腫瘤以及誘發(fā)神經(jīng)軸突生長等作用[2-5]。目前，龍膽苦苷主要從滇龍膽、秦艽（Gentiana macrophylla）等野生植物中提取，但隨著龍膽苦苷需求量的劇增，野生藥用植物不能完全滿足市場需求[6]。因此，對龍膽苦苷生物合成途徑進(jìn)行研究，利用基因工程、代謝工程等手段生產(chǎn)龍膽苦苷勢在必行，明確龍膽苦苷的生物合成途徑及其調(diào)控機(jī)制是利用生物技術(shù)手段生產(chǎn)龍膽苦苷的前提。

近年來，龍膽苦苷因其獨(dú)特的藥用價(jià)值以及在臨床上的廣泛應(yīng)用[7]，受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，并在龍膽苦苷的提取、含量測定、含量影響因素、藥代動力學(xué)[8]、生物轉(zhuǎn)化[9]和結(jié)構(gòu)修飾等方面取得了大量科研成果。本文從目前已知的單萜生物合成途徑出發(fā)，以近年的研究成果為依據(jù)，歸納出龍膽苦苷的基本合成途徑，綜述了龍膽苦苷的理化性質(zhì)、生物合成途徑以及該途徑中關(guān)鍵酶的研究現(xiàn)狀，以期為龍膽苦苷的開發(fā)和利用提供參考。

1 龍膽苦苷的理化性質(zhì)

龍膽苦苷分子式為C16H20O9，分子量為356.3246，化學(xué)名為5-ethenyl-6-（β-D-glucopyranosyloxy）-5，6-dihydro-1H，3H-pyrano[3，4-O]pyran-1-one。龍膽苦苷純品為白色粉末或淡黃（紅）色針狀結(jié)晶，有內(nèi)酯苷類化合物的顏色反應(yīng)，其表觀油水分配系數(shù)理論值為-1.41，23 ℃下的表觀油水分配系數(shù)為lgP=-1.21[10]，表明龍膽苦苷的親水性較強(qiáng)，脂溶性較差，易溶解于水、甲醇及乙醇等溶劑。龍膽苦苷在龍膽科植物中普遍存在，于1854年首次從龍膽科植物黃龍膽（Gentiana lutea）中分離得到[11]；1961年，Canonica等初步獲得龍膽苦苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)[12]；1968年，Inouye等最終確定了龍膽苦苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)（圖1）[13]。

2 龍膽苦苷生物合成途徑

龍膽苦苷屬于單萜類化合物，其生物合成途徑主要分為3個階段：（1）通過甲羥戊酸（mevalonic acid，MVA）途徑和2-甲基-赤蘚醇-4-磷酸（2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate，MEP）途徑合成異戊烯基焦磷酸（isopentenyl diphosphate，IPP）；（2） IPP經(jīng)過不同的酶促反應(yīng)合成裂環(huán)番木鱉酸；（3） 裂環(huán)番木鱉酸依次經(jīng)過獐牙菜苷、獐牙菜苦苷，最終形成龍膽苦苷。

Coscia等于1967年用14C標(biāo)記Swertia caroliniensis的甲羥戊酸，發(fā)現(xiàn)龍膽苦苷中出現(xiàn)14C，表明龍膽苦苷起始于甲羥戊酸途徑[14]。據(jù)筆者所在課題組前期對滇龍膽三年生根、莖轉(zhuǎn)錄組測序研究發(fā)現(xiàn)，龍膽苦苷生物合成調(diào)控基因在MEP途徑中上調(diào)，表明龍膽苦苷生物合成主要來源于MEP途徑，部分來源于MVA途徑。龍膽苦苷生物合成的第一階段與一般的單萜類化合物在萜類基本骨架合成階段完全相同，即首先在細(xì)胞質(zhì)中通過MVA途徑或者在質(zhì)體中通過MEP途徑合成萜類前體物質(zhì)IPP，然后轉(zhuǎn)化為GPP[15]。MVA途徑自被人類發(fā)現(xiàn)至今已有半個世紀(jì)，其生物合成途徑比較清楚，該途徑首先由3分子的乙酰-CoA在乙酰乙酰輔酶A硫解酶和乙酰乙酰輔酶A合酶作用下縮合形成3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA（HMG-CoA），縮合產(chǎn)物在其還原酶（HMGA）的催化作用下被還原成MVA，再經(jīng)過脫羧和磷酸化反應(yīng)生成GPP[16]。MEP途徑是在脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶（DXS）的縮合作用下，由1分子3-磷酸甘油醛和1分子丙酮酸生成1分子的1-脫氧木酮糖-5-磷酸（DXP），并在其還原異構(gòu)酶的催化作用下轉(zhuǎn)化為2-甲基-赤蘚醇-4-磷酸（MEP），MEP再依次經(jīng)過2-甲基赤蘚醇-4-磷酸胞苷轉(zhuǎn)移酶、4-二磷酸胞苷-2-甲基赤蘚糖激酶、2-甲基-赤蘚醇-2，4-環(huán)二磷酸合酶、1-羥基-2-甲基-2-丁烯基-4-焦磷酸合酶催化生成1-羥基-2-甲基-2-丁烯基-4-焦磷酸（HMBPP），接著由異戊烯基焦磷酸激酶催化 HMBPP 生成IPP，IPP和二甲基丙烯基焦磷酸（DMAPP）之間的轉(zhuǎn)換由IPP異構(gòu)酶（IDI）來完成[17]。

龍膽苦苷生物合成第二階段，即裂環(huán)番木鱉酸生物合成階段，以GPP為前體，脫磷酸形成香葉醇。從香葉醇到裂環(huán)番木鱉酸的合成大約需要11個酶促步驟，目前只有5個被鑒定，即P450依賴性香葉醇10-羥化酶（G10H）、無環(huán)單萜伯醇脫氫酶（ADH）、單萜環(huán)化酶（MC）、S-腺苷-L-蛋氨酸：馬錢苷酸甲基轉(zhuǎn)移酶（LAMT）和P450依賴性裂環(huán)番木鱉酸合成酶（SLS）[18]。該階段IPP和DMAPP在GPPS的催化作用下生成GPP，GPP合成后需要進(jìn)行復(fù)雜的開環(huán)、環(huán)化和糖基化步驟，即GPP經(jīng)香葉醇合成酶催化合成香葉醇，香葉醇C-2位置在細(xì)胞色素P450還原酶和香葉醇10-羥化酶的催化作用下生成10-脫氧香葉醇，這是裂環(huán)番木鱉酸生物合成的最重要的步驟。10-脫氧香葉醇被10-羥基香葉醇氧化還原酶（10HGO）氧化，在NAPDH氧化還原酶存在時(shí)，生成10-氧香葉醛，接著在單萜環(huán)化酶的催化下形成琉蟻二醛（iridodial），經(jīng)縮醛反應(yīng)形成iridotial，經(jīng)過不斷反應(yīng)形成7-脫氧番木鱉酸（deoxyloganic acid），在7-脫氧番木鱉酸7-羥化酶作用下生成馬錢苷酸，在S-腺苷-L-蛋氨酸：馬錢苷酸甲基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下生成番木鱉酸，SLS催化番木鱉酸形成裂環(huán)番木鱉酸（secologanin）[18-19]。Coscia等發(fā)現(xiàn)牻牛兒基焦磷酸能并入到Swertia caroliniensis的有效成分番木鱉酸，進(jìn)一步證明了GPP是龍膽苦苷生物合成的中間物[20]。1969年，Coscia等證明番木鱉酸是龍膽苦苷生物合成的前體[21]，這一結(jié)論同時(shí)也由Inouye和Grger這2個課題組分別在三花龍膽和長柄獐牙菜（Swertia petiolata）中得到證實(shí)。

在龍膽苦苷生物合成的最后一個階段，裂環(huán)番木鱉酸經(jīng)過不斷的衍化生成獐牙菜苷（sweroside）、獐牙菜苦苷（swertiamarin），最終脫羥基形成龍膽苦苷[22]。Inouye等于1967年通過前體飼養(yǎng)試驗(yàn)證明在三花龍膽（Gentiana triflora）中甲羥戊酸內(nèi)酯被并入到龍膽苦苷中；同時(shí)也出現(xiàn)在日本獐牙菜（Swertia japonica）的獐牙菜苷和獐牙菜苦苷中，獐牙菜苷中 14C 的含量約是獐牙菜苦苷含量的6倍，表明獐牙菜苷是獐牙菜苦苷的前體[14]。Tan等經(jīng)過試驗(yàn)證明裂環(huán)番木鱉酸是龍膽苦苷等裂環(huán)烯醚萜類化合物的關(guān)鍵中間物[23]。隨后，Inouye 等采用同位素示蹤獐牙菜苷，并證明它是龍膽草（Gentiana scabra）中龍膽苦苷生物合成的一個中間物[24]。Jensen 等研究表明，在龍膽科植物中普遍存在著獐牙菜苷到獐牙菜苦苷再到龍膽苦苷的生物轉(zhuǎn)化[22]。

目前，主要采用同位素示蹤法，通過產(chǎn)物來反推其生物合成途徑，并加以驗(yàn)證，是完善環(huán)烯醚萜類化合物次生代謝合成的一般策略。目前，龍膽苦苷的完整合成途徑并不完全清楚，其基本的反應(yīng)步驟如圖2所示。

3 龍膽苦苷生物合成途徑中的關(guān)鍵酶

隨著龍膽苦苷需求量的劇增，其生物合成途徑中的關(guān)鍵酶也備受關(guān)注。在龍膽苦苷的生物合成途徑中，IPP合成階段的大部分酶基因已被廣泛克隆和研究；第二階段（即裂環(huán)番木鱉酸生物合成階段）只克隆到6個基因，其余5個基因還有待進(jìn)一步研究；第三階段從獐牙菜苷到獐牙菜苦苷再到龍膽苦苷的衍化機(jī)制并不清楚。

3.1 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶

3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMG-CoA reductase，HMGR）催化3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）轉(zhuǎn)化為MVA，這是一個不可逆過程，故HMGR被認(rèn)為是MVA途徑中的第一個限速步驟；HMGR在類異戊二烯的生物合成中起重要作用，也是細(xì)胞質(zhì)萜類代謝中的重要調(diào)控位點(diǎn)[26]。植物中HMGR組成一個多基因家族，擬南芥（Arabidopsis thaliana）中HMGR酶由HMG1和HMG2基因編碼[27]；馬鈴薯（Solanum tuberosum）中含有3個HMGR基因；番茄（Solanum lycopersicum）中含有4個HMGR基因；而在動物中僅發(fā)現(xiàn)1個HMGR基因。目前該基因已在杜仲橡膠（Eucommia ulmoides）[28]等植物和李斯特菌（Listeria monocytogenes）[29]等細(xì)菌中被克隆和研究。

3.2 脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶

脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶（l-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase，DXS），催化MEP途徑第一步反應(yīng)，是MEP途徑的第1個關(guān)鍵酶，它能與焦磷酸硫胺素（thiamine pyrophosphate，TPP）共同作用，使丙酮酸脫羧后與3-磷酸甘油醛合成1-脫氧木酮糖-5-磷酸（l-deoxy-D-xylulose-5-phosphate，DXP）[30]。DXS是MEP途徑中植物萜類物質(zhì)合成的第一個限速酶，該基因過量表達(dá)可促進(jìn)下游相關(guān)萜類化合物的積累。Peebles等在長春花（Catharanthus roseus）萜類吲哚生物堿生物合成的研究中發(fā)現(xiàn)，DXS的超表達(dá)導(dǎo)致阿嗎堿、洛柯定堿、水甘草堿等產(chǎn)物的大量增加，表明DXS在萜類生物合成中起重要作用[31]。Estévez等對擬南芥突變體clal-1進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，DXS對植物葉綠體及白色體的發(fā)育具有重要作用，主要表現(xiàn)在當(dāng)突變體缺失DXS基因時(shí)呈現(xiàn)“白化”特征，添加脫氧木酮糖后有新的色素生成[32]。目前，已從玉米（Zea mays）[33]、番茄[34]、銀杏（Ginkgo biloba）[35]等植物中獲得DXS基因。近年來，大量研究表明DXS在類異戊二烯的MEP生物合成途徑中起重要作用[36-37]。

3.3 脫氧木酮糖磷酸鹽還原異構(gòu)酶

脫氧木酮糖磷酸鹽還原異構(gòu)酶（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase，DXR）存在于質(zhì)體中的MEP途徑中，DXP通過DXR催化，以NADPH為還原劑，依賴二價(jià)陽離子，經(jīng)原子重排和還原生成MEP，從而把DXP引入MEP途徑[38]。DXR是MEP途徑中的第2個限速酶，也是細(xì)胞質(zhì)體中類異戊二烯化合物代謝的重要調(diào)控位點(diǎn)。Carretero等研究

發(fā)現(xiàn)，擬南芥中DXR基因的超表達(dá)能夠增加MEP衍生質(zhì)體類異戊二烯（如葉綠素和類胡蘿卜素）的積累，表明DXR在MEP途徑的調(diào)控中起重要作用[39]。Xing等對擬南芥dxr突變體進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，DXR基因的破壞會導(dǎo)致擬南芥突變體植株白化、矮小以及毛狀體起始缺陷和氣孔關(guān)閉，表明DXR基因在植物生長發(fā)育過程中起重要作用[40]。近年來，DXR在植物生長和發(fā)育過程以及MEP途徑中的重要作用引起人們的廣泛關(guān)注。目前，DXR基因已在細(xì)菌、藻類、植物、原生動物中發(fā)現(xiàn)，但在人體中并未發(fā)現(xiàn)。

3.4 2-甲基赤蘚醇-4-磷酸胞苷轉(zhuǎn)移酶

2-甲基赤蘚醇-4-磷酸胞苷轉(zhuǎn)移酶（2-C-methylerythritol-4-phosphate cytidyltransferase，MECT）屬于胞嘧啶轉(zhuǎn)移酶家族的一個成員，參與MEP途徑的第三步酶促反應(yīng)，將二磷酸胞苷（CDP）和MEP連接生成4-二磷酸胞苷-2-甲基-赤蘚醇（CDP-ME），該反應(yīng)依賴于胞苷三磷酸（CTP）[30]。目前，已從擬南芥、銀杏等植物中發(fā)現(xiàn)該基因，但對其編碼酶的相關(guān)功能研究并未見報(bào)道。為了驗(yàn)證MECT在萜類生物合成中的作用，Rohdich等用14C標(biāo)記MECT，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生成帶有14C標(biāo)記的CDP-ME；將大腸埃希菌（Escherichia coli）MECT基因轉(zhuǎn)入辣椒，發(fā)現(xiàn)CDP-ME在質(zhì)體中參與類胡蘿卜素的生物合成，表明MECT與次生代謝產(chǎn)物合成有關(guān)[41]。

3.5 2-甲基-赤蘚醇-2，4-環(huán)二磷酸合酶

2-甲基-赤蘚醇-2，4-環(huán)二磷酸合酶（2-C-methylerythritol-2，4-cyclodiphosphate synthase，MECPS）是MEP途徑上的第5個酶，催化CDP-MEP生成2-甲基-赤蘚醇-2，4-環(huán)二磷酸（ME-cPP）。目前，Buetow等已在結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）中證實(shí)MECPS具有潛在的藥物功能測定作用，可作為治療靶點(diǎn)[42]。Burlat等經(jīng)Northern雜交和原位雜交發(fā)現(xiàn)MECPS與MEP途徑中DXS、DXR基因以及下游途徑中的香葉醇10-羥化酶（G10H）基因類似，顯示出相同的細(xì)胞特異表達(dá)模式，表明MECPS在次生代謝產(chǎn)物的生物合成中起重要作用[43]。

3.6 異戊烯基轉(zhuǎn)移酶

異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（prenyltransferase，PTs）催化IPP縮合成非環(huán)式的GPP，這是萜類合成中的重要過程。該基因已在紫草（Lithospermum erythrorhizon）[44]、苦參（Sophora flavescens）[45]、白羽扇豆（Lupinus albus）[46]等植物中被廣泛研究。近年來，Nickerson等研究發(fā)現(xiàn)PTs與膽固醇的代謝有關(guān)[47]；Akhtar等經(jīng)研究證實(shí)了番茄中順式異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（cis-prenyltransferase，CPTs）與長鏈多聚類異戊二烯的合成有關(guān)，含有至少5個異戊二烯單位[48]。

3.7 牻牛兒基焦磷酸合成酶

牻牛兒基焦磷酸合成酶（geranyl pyrophosphate synthase，GPPS）是異戊二烯途徑中一個很重要的酶，目前對GPPS的研究主要集中在其對單萜和倍半萜的影響[49]。GPPS催化IPP形成GPP，是植物單萜生物合成中的一個關(guān)鍵酶，在吸引傳粉者和次生代謝產(chǎn)物的防御中起重要作用[50]。GPPS在多種植物中被分離，但有關(guān)其調(diào)控機(jī)制的研究很少。Martin等對葡萄（Vitis vinifera）中VvGPPS的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行分析，表明VvGPPS基因在單萜生物合成中起重要作用[51]。Chang等研究發(fā)現(xiàn)歐薄荷（Mentha piperita）中的MpGPPS包含2個具有催化功能的大亞基和2個非催化的具有調(diào)控功能的小亞基，并且證實(shí)與薄荷醇的生物合成有關(guān)[52]。

3.8 香葉醇合成酶

香葉醇合成酶（geraniol synthase，GES）是單萜芳香化合物香葉醇產(chǎn)生過程中的關(guān)鍵酶。Yoko等的18O同位素示蹤試驗(yàn)研究結(jié)果表明GES催化牻牛兒基焦磷酸生成香葉醇，幾乎專一性地在羅勒腺體中產(chǎn)生，在同型二聚體蛋白中存在活性，且需要Mn2+作為二價(jià)金屬輔因子來激活[53]。Marc等研究結(jié)果表明酵母菌株erg20K197G中GES在YNB（酵母氮源基質(zhì)）中的表達(dá)導(dǎo)致大量單萜化合物（香葉醇、沉香醇、香茅醇、橙花醇）的生物合成，且GES的表達(dá)導(dǎo)致香葉醇產(chǎn)量高出16倍；推斷出GPP的不穩(wěn)定導(dǎo)致GES特異性損失，不會導(dǎo)致香葉醇單萜合成酶功能的損失，但會使其失活[54]。目前，已在羅勒、紫蘇、長春花中克隆到相關(guān)基因。羅勒GES可以用于評估單萜在不同植物中的異源表達(dá)譜。Marc等用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化葡萄，用浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥，農(nóng)桿菌滲透瞬時(shí)表達(dá)煙草葉片均獲得羅勒GES轉(zhuǎn)基因植株，并在葉片中檢測到高含量的香葉醇；另外，在大腸桿菌轉(zhuǎn)化株培養(yǎng)基中檢測到香葉醇[55]。

3.9 細(xì)胞色素P450還原酶

細(xì)胞色素P450還原酶（cytochrome P450 reductase，CPR）是真核生物的一個膜結(jié)合黃素蛋白，是細(xì)胞色素P450單加氧酶的催化反應(yīng)所必須的，因?yàn)樗陔娮觽鬟f中的功能是從NADPH到細(xì)胞色素P450蛋白。許多P450蛋白與香葉醇到裂環(huán)番木鱉酸的生物合成有關(guān)，包括香葉醇10-羥化酶、7-脫氧番木鱉酸7-羥化酶和裂環(huán)番木鱉酸合成酶[56]。Shen等通過RT-qPCR研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞色素P450單加氧酶（cyp71av1）在轉(zhuǎn)基因黃花蒿植株轉(zhuǎn)錄水平上具有較高的表達(dá)量；HPLC分析顯示在cyp71av1和細(xì)胞色素P450還原酶（cpr）的過表達(dá)植株中，青蒿素的含量明顯增加，表明cyp71av1、cpr基因的過表達(dá)增加了黃花蒿（Artemisia annua）中青蒿素的含量[57]。細(xì)胞色素P450單加氧酶與內(nèi)源性化合物的生物合成和外源性物質(zhì)的分解代謝有關(guān)，他們的活性依賴于細(xì)胞色素P450還原酶。

3.10 細(xì)胞色素P450

細(xì)胞色素P450形成植物蛋白的最大家族，參與生物堿、萜類、類苯基丙烷等代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。P450蛋白基因在植物基因組中的數(shù)量占總注釋基因的1%，表明植物中的大量反應(yīng)依賴于各種P450[58]。在植物次生代謝過程中，P450催化羥基化反應(yīng)和單加氧反應(yīng)，另外還涉及到一些非常規(guī)反應(yīng)，如甲二氧基-橋形成和石碳酸偶聯(lián)反應(yīng)等[59]。Chang等研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素P450參與龍膽苦苷的分解代謝[7]；在龍膽苦苷生物合成途徑中，許多反應(yīng)都是通過細(xì)胞色素P450蛋白進(jìn)行催化的；單萜和倍半萜的基本碳?xì)涔羌苄纬珊?，?jīng)P450加氧酶催化而發(fā)生羥化反應(yīng)[60]。Sung等研究發(fā)現(xiàn)在龍膽苦苷生物合成中，香葉醇-10-羥化酶（Geraniol 10-hydroxylase，G10H）是一個極其重要的酶，它是CYP76B6家族中的一個細(xì)胞色素P450單加氧酶，在C-10位置羥化單萜香葉醇產(chǎn)生10-羥化香葉醇，是單萜和吲哚生物堿生物合成過程中裂環(huán)番木鱉酸產(chǎn)生的重要調(diào)控酶，也是不同植物中環(huán)烯醚萜類形成的第一個關(guān)鍵酶[61]。Wang等從川西獐牙菜（Swertia mussotii）中克隆到香葉醇10-羥化酶基因，并證實(shí)它具有香葉醇羥化的催化活性[62]。

3.11 7-脫氧番木鱉酸7-羥化酶

Katano等研究表明7-脫氧番木鱉酸7-羥化酶（7-deoxyloganin 7-hydroxylase，DL7H）能催化7-脫氧番木鱉酸轉(zhuǎn)化為番木鱉酸，具有7-脫氧番木鱉酸的底物特異性，在金銀花（Lonicera japonica）細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物的微粒體中檢測到其活性依賴于NADPH和分子氧，該酶學(xué)反應(yīng)能被一氧化碳和許多細(xì)胞色素P450抑制劑（尤其是酮康唑）抑制，表明該反應(yīng)能被細(xì)胞色素P450介導(dǎo)[63]。

3.12 裂環(huán)番木鱉酸合成酶

裂環(huán)番木鱉酸合成酶（secologanin synthase，SLS）在番木鱉酸形成裂環(huán)番木鱉酸的過程中催化環(huán)戊烷的氧化還原反應(yīng)，屬于細(xì)胞色素P450家族中CYP72A1亞家族成員，在長春花單萜生物合成中被鑒定[64-65]。Yamamoto等首次從金銀花的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)微粒體中檢測到SLS[66]。SLS在反應(yīng)中的作用依賴于NADPH和分子氧，能被一氧化碳和細(xì)胞色素P450抑制劑阻斷，表明該反應(yīng)受細(xì)胞色素P450調(diào)節(jié)。

4 展望

龍膽苦苷的生物合成途徑是一個受多基因調(diào)控的、非常復(fù)雜的動態(tài)變化過程。隨著分子生物學(xué)和代謝組學(xué)的發(fā)展，龍膽苦苷生物合成途徑的基本框架和相關(guān)酶的研究已取得了一定的進(jìn)展，但還有許多細(xì)節(jié)步驟不清楚，其生物合成途徑仍有許多問題亟待解決。（1）香葉醇是裂環(huán)番木鱉酸生物合成的關(guān)鍵中間物，但香葉醇到裂環(huán)番木鱉酸之間的具體酶促反應(yīng)至今還不清楚。在龍膽苦苷生物合成過程中，從裂環(huán)番木鱉酸到獐牙菜苷、獐牙菜苦苷以及龍膽苦苷之間的反應(yīng)機(jī)制也不清楚，需要通過試驗(yàn)進(jìn)一步研究。（2）龍膽苦苷的生物合成中，MVA和MEP途徑中的酶大部分已被系統(tǒng)地研究，環(huán)烯醚萜類化合物生物合成過程中的調(diào)控酶只有細(xì)胞色素P450、G10H、SLS等被廣泛研究，有關(guān)單萜環(huán)化酶、LAMT等的研究很少，而其他反應(yīng)過程，如臭蟻二醛到7-脫氧番木鱉酸、獐牙菜苷與獐牙菜苦苷以及龍膽苦苷之間的酶未見報(bào)道。（3）代謝產(chǎn)物的生物合成途徑都是由結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因共同調(diào)控的，龍膽苦苷生物合成途徑中的部分結(jié)構(gòu)基因和個別調(diào)控基因僅在部分植物中被克隆，如WRKY轉(zhuǎn)錄因子被報(bào)道間接參與龍膽苦苷的生物合成過程，但并未對其具體調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入研究。目前，龍膽科植物的基因組還未被測序，在今后的研究中，需要通過對龍膽科具有代表性的藥材（如龍膽或秦艽等）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，挖掘該途徑中大量的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因，并對其功能進(jìn)行研究，進(jìn)而從分子生物學(xué)水平闡明龍膽苦苷生物合成途徑及其調(diào)控機(jī)制。因而，了解植物中龍膽苦苷的生物合成途徑及其調(diào)控機(jī)理，并采用基因工程手段來生產(chǎn)龍膽苦苷，對野生龍膽資源的保護(hù)和解決市場上龍膽等藥材的供需矛盾都具有重要的理論價(jià)值和實(shí)踐價(jià)值。

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