水稻滲透脅迫抑制表達(dá)基因的克隆與表達(dá)分析

葉子誠(chéng)

摘要通過(guò)基因芯片技術(shù)，鑒定了一個(gè)PEG6000脅迫抑制表達(dá)基因。該基因編碼MYB轉(zhuǎn)錄因子，命名為OsSRMYB1。熒光定量PCR研究結(jié)果表明，該基因的表達(dá)顯著受PEG6000抑制，受氧化脅迫誘導(dǎo)，而低溫和ABA處理下該基因的表達(dá)未發(fā)生顯著變化。組織表達(dá)分析結(jié)果表明，OsSRMYB1基因在水稻不同組織中均有表達(dá)，在葉中表達(dá)量較高。在不同生長(zhǎng)階段的穗中，OsSRMYB1基因在發(fā)育中的穗中表達(dá)較高，在成熟穗和幼穗中表達(dá)量較低。本研究為進(jìn)一步深入分析OsSRMYB1的生物學(xué)功能提供參考。

關(guān)鍵詞MYB；水稻；滲透脅迫；穗發(fā)育；轉(zhuǎn)錄因子

中圖分類號(hào)S511文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào) 1007-5739（2014）11-0009-03

Cloning and Expression Analysis of a Osmotic Stress Repressive Gene in Rice

YE Zi-cheng

（College of Agriculture，Nanjing Agricultural University，Nanjing Jiangsu 210095）

AbstractA gene encoding MYB transcription factor was identified as a PEG6000-repressive gene by microarray，designated OsSRMYB1.Real-time RT-PCR assay suggested that expression of OsSRMYB1 was significantly repressed by PEG6000，while not markedly changed upon ABA or cold stress. OsSRMYB1 expression existed in the different tissues of rice and the expression was the highest in leaves. The tissue-specific expression of OsSRMYB1 indicated that it was highly expressed in the developing panicles. This study provide reference for the depth analysis of the biological functional of OsSRMYB1.

Key wordsMYB；rice；osmotic stress；panicle development；transcription factor

植物對(duì)非生物脅迫的適應(yīng)依賴于一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活，包括脅迫信號(hào)的感知、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、脅迫相關(guān)基因的表達(dá)及脅迫相關(guān)代謝物的積累，從而對(duì)損傷進(jìn)行修復(fù)，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)進(jìn)行重建。對(duì)脅迫相關(guān)基因編碼產(chǎn)物的類型和作用進(jìn)行分類，主要有以下2種：一類是直接保護(hù)細(xì)胞免受逆境脅迫的功能蛋白，如LEA蛋白、抗凍蛋白、離子信道蛋白以及滲透調(diào)節(jié)因子；另外一類是一種調(diào)控蛋白，其可參與到脅迫信號(hào)的傳導(dǎo)和基因表達(dá)調(diào)節(jié)的過(guò)程中，包括轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶等。已有研究表明，bZIP類、AP2/EREBP類、鋅指蛋白、MYB/MYC類等多種類型的轉(zhuǎn)錄因子參與到植物的非生物脅迫應(yīng)答中。MYB類轉(zhuǎn)錄因子包含MYB結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域最早是在脊椎動(dòng)物原癌基因v-Myb編碼產(chǎn)物的DNA結(jié)合域中被發(fā)現(xiàn)[1]。YB轉(zhuǎn)錄因子一般定位于細(xì)胞核中，緊密地與核基質(zhì)和染色質(zhì)相連[2]。

根據(jù)MYB類轉(zhuǎn)錄因子所含有的MYB結(jié)構(gòu)域的數(shù)目，可被簡(jiǎn)單地分成3個(gè)亞類[3]：一是只含1個(gè)MYB結(jié)構(gòu)的MYB蛋白亞類成員，二是含有2個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域的R2R3亞類成員，三是含有3個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域的R1R2R3亞類成員。以前有相關(guān)的研究表明，MYB類轉(zhuǎn)錄因子廣泛地在植物的各種反應(yīng)中發(fā)生作用，包括細(xì)胞形態(tài)發(fā)生、次生代謝等。蔡新忠等[4]的研究結(jié)果證明MYB基因在番茄的抗旱中發(fā)揮一定的作用。Urao等[5]從擬南芥中分離出1個(gè)MYB基因Atmyb2，該基因的表達(dá)受到干旱、高鹽以及ABA等的誘導(dǎo)，體外EMSA表明Atmyb2蛋白能夠與MYB識(shí)別位點(diǎn)TAACTG進(jìn)行特異性的結(jié)合。Abe等在分析一個(gè)足以響應(yīng)干旱和ABA誘導(dǎo)的來(lái)源于rd22基因啟動(dòng)子的67 bp DNA序列時(shí)，鑒定了2個(gè)順式作用元件，即MYC和MYB識(shí)別位點(diǎn)。瞬時(shí)表達(dá)分析表明Atmyb2能夠促進(jìn)rd22啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因的表達(dá)。Dene Kamp等[6]對(duì)擬南芥中MYB類轉(zhuǎn)錄因子AtMyb102的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)NaCl和ABA處理后，與對(duì)照相比，AtMyb102的表達(dá)明顯要高，在受到ABA處理后，其在擬南芥的根、莖、葉、小花中的表達(dá)量會(huì)得到顯著的提高。通過(guò)基因芯片技術(shù)，筆者所在試驗(yàn)室實(shí)定了1個(gè)PEG6000脅迫抑制表達(dá)的基因。該基因編碼MYB類轉(zhuǎn)錄因子，命名為OsSRMYB1。本研究將通過(guò)序列比對(duì)、結(jié)構(gòu)域分析、表達(dá)特性研究等手段分析明確OsSRMYB1在非生物脅迫中可能的功能，為進(jìn)一步深入分析OsSRMYB1的生物學(xué)功能提供基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1植物材料及處理

水稻粳稻（Oryza sativa L.sub Japonica）品種韭菜青由筆者所在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)保存提供。水稻種子置于30 ℃環(huán)境中催芽2 d，將種子均勻地點(diǎn)播于96孔板中，于28 ℃培養(yǎng)箱中水培生長(zhǎng)，條件為：光照16 h、黑暗8 h。營(yíng)養(yǎng)液采用國(guó)際水稻所用的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)液配方[7]，待幼苗生長(zhǎng)至3~4葉時(shí)，對(duì)幼苗按以下步驟處理：一是冷處理，將幼苗置于4 ℃環(huán)境中；二是模擬干旱處理，水稻幼苗營(yíng)養(yǎng)液中加入20%的PEG6000；三是H2O2處理，水稻幼苗營(yíng)養(yǎng)液中加入100 mmol/L H2O2；四是ABA處理，水稻幼苗營(yíng)養(yǎng)液中加入0.05 mmol/L ABA。分時(shí)段（0、1、3、6、12、24、48 h）收集水稻幼苗地上部樣品，液氮速凍后于-80 ℃保存，用于RNA的提取。

1.2總RNA的提取

提取總RNA時(shí)，參照Invitrogen公司的Trizol試劑完成。在1%普通瓊脂糖凝膠電泳上將總RNA分離出來(lái)，經(jīng)過(guò)一定的分析，對(duì)總RNA的質(zhì)量以及濃度進(jìn)行判斷。將符合要求的總RNA置于-80 ℃的環(huán)境條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3cDNA第一鏈的合成

參照MBI公司的反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的操作手冊(cè)進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。取總RNA 2 μg置于DEPC-H2O中進(jìn)行稀釋，總體積調(diào)至12 μL，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下于PCR擴(kuò)增儀上保溫1 h，溫度控制在 42 ℃下即可；再在70 ℃下保溫10 min，最后置于-20 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4Quantitative Real-time PCR分析

以水稻18s rRNA作為內(nèi)參，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)。20 μL PCR反應(yīng)體系包括：10 μL 2× SYBR Green supermix reagent（包括反應(yīng)緩沖液，dNTPs，SYBR Green染料），1.0 μL cDNA模板，20 nmol/L 基因特異引物，8 μL dd H2O。其中，用于該Real-time PCR分析的引物序列見表1。

1.5OsSRMYB1基因的生物信息學(xué)分析

參考Gramene數(shù)據(jù)庫(kù)中的OsSRMYB1基因序列信息（LOC_Os12g03150.1）[8]，根據(jù)Primer Premier 5對(duì)引物OsSR MYB1-F（5′-GAACTATAGCTAGCCAAGTAGCCATG-3′）及OsSRMYB1-R（5′-GTTCTTGATGTCGTTGTCGGTG-3′）進(jìn)行設(shè)計(jì)，模板選擇水稻耐旱品種韭菜青cDNA，通過(guò)PCR對(duì) OsSRMYB1基因的全長(zhǎng)進(jìn)行擴(kuò)增，將其與pMD18-T載體進(jìn)行連接并進(jìn)行序列的測(cè)定。利用SMART網(wǎng)站（http：//smart.embl-heidelberg.de/）對(duì)獲得的序列進(jìn)行蛋白序列結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。利用Rice oligonucleotide array database分析其在水稻不同組織中的表達(dá)。此外，利用genevestigator數(shù)據(jù)庫(kù)分析其在不同脅迫下的表達(dá)情況以及其共表達(dá)基因。運(yùn)用ClustalX與MEGA 4軟件對(duì)OsSRMYB1進(jìn)行多重序列比對(duì)與進(jìn)化樹構(gòu)建。

2結(jié)果與分析

2.1OsSRMYB1的克隆及蛋白特性分析

以韭菜青cDNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得OsSRMYB1基因全長(zhǎng)并進(jìn)行測(cè)序及序列分析，結(jié)果表明OsSRMYB1的ORF長(zhǎng)度為1 599 bp，蛋白產(chǎn)物由311個(gè)氨基酸構(gòu)成，分子量為34.06 KDa，等電點(diǎn)為-3.0。利用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析該蛋白的結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明該蛋白包含SANT結(jié)構(gòu)域（圖1），為MYB家族蛋白。

2.2OsSRMYB1與其他非生物脅迫相關(guān)MYB類鋅指蛋白的序列比對(duì)與進(jìn)化樹構(gòu)建

選取非生物脅迫相關(guān)MYB類鋅指蛋白Atmyb102、Atmyb2、GmMYB92、GmMYB76和OsSRMYB1，利用ClustalX與MEGA4軟件進(jìn)行序列比對(duì)及進(jìn)化分析。由圖2、圖3可知，OsSRMYB1與其他4種MYB類鋅指蛋白的氨基酸序列顯著相似，特別是在其保守結(jié)構(gòu)域內(nèi)氨基酸序列高度保守。

2.3OsSRMYB1在不同組織及各種處理?xiàng)l件下的表達(dá)

利用Rice oligonucleotide array database，分析OsSRMYB1在水稻不同組織中的表達(dá)，結(jié)果分析表明OsSRMYB1基因在根、莖、葉片、葉鞘、穗等不同組織中均有表達(dá)（圖4），其在葉中表達(dá)水平較高。

利用Gene vestigator數(shù)據(jù)庫(kù)分析OsSRMYB1在不同脅迫下的表達(dá)情況，結(jié)果表明OsSRMYB1的表達(dá)受非生物脅迫影響，說(shuō)明OsSRMYB1可能參與非生物脅迫響應(yīng)。為了進(jìn)一步分析OsSRMYB1在非生物脅迫中的功能，利用Real-time PCR分析了OsSRMYB11在H2O2、20% PEG、低溫（4 ℃）及ABA處理下的表達(dá)（圖5）。由表5可知，OsSRMYB1表達(dá)受H2O2誘導(dǎo)，而在20% PEG處理下其表達(dá)受抑制，表明OsSRMYB1可能參與了干旱、氧化脅迫等非生物脅迫的響應(yīng)。

2.4OsSRMYB1的共表達(dá)與共調(diào)節(jié)基因分析

利用Genevestigator軟件對(duì)OsSRMYB1可能的共表達(dá)及共調(diào)節(jié)基因進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6、圖7所示。OsSRMYB1的共表達(dá)基因?yàn)長(zhǎng)OC_Os09g37050，編碼RING-H2鋅指蛋白，根據(jù)genevestigator分析該基因受NAA、GA3誘導(dǎo)。OsSRMYB1的共調(diào)節(jié)基因?yàn)長(zhǎng)OC_Os02g44320，編碼蛋白酶抑制劑蛋白，根據(jù)genevestigator分析該基因受冷害、H2O2誘導(dǎo)。

3結(jié)論與討論

現(xiàn)有的研究表明，水稻中有多個(gè)基因家族參與非生物脅迫的應(yīng)答，如GT轉(zhuǎn)錄因子家族[9]、TIFY基因家族[10]、BURP基因家族[11]、類BRX基因家族[12]等。OsSRMYB1為MYB類鋅指蛋白，已有研究結(jié)果表明MYB類鋅指蛋白亦可能參與非生物脅迫響應(yīng)，如大豆GmMYB92、GmMYB76 及擬南芥Atmyb102、Atmyb2蛋白。研究表明 OsSRMYB1是一種在細(xì)胞內(nèi)普遍存在且大量表達(dá)的多聚體核糖體蛋白質(zhì)，在基因表達(dá)、抗逆響應(yīng)中起重要作用。在組織表達(dá)分析中OsSRMYB1在新葉與幼穗中含量較高，表明OsSRMYB1可能在主要在分生組織中表達(dá)。

本研究克隆了OsSRMYB1基因，并通過(guò)氨基酸序列比對(duì)、蛋白結(jié)構(gòu)域分析、基因表達(dá)特性等分析表明OsSRMYB1可能參與非生物脅迫響應(yīng)，為進(jìn)一步深入分析OsSRMYB1的生物學(xué)功能提供基礎(chǔ)。與大多數(shù)已經(jīng)報(bào)道的植物MYB類轉(zhuǎn)錄因子不同，本研究發(fā)現(xiàn)的OsSRMYB1受滲透脅迫的負(fù)調(diào)節(jié)，表明該基因可能在植物響應(yīng)非生物脅迫過(guò)程中發(fā)揮了負(fù)向調(diào)控的作用。進(jìn)一步將通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得過(guò)量和RNA干涉抑制表達(dá)OsSRMYB1基因的水稻轉(zhuǎn)基因植物，深入研究其參與的非生物脅迫應(yīng)答機(jī)制。

4參考文獻(xiàn)

[1] 吳春霞.植物MYB基因研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（20）：（下轉(zhuǎn)第13頁(yè)）

（上接第11頁(yè)）

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1.5OsSRMYB1基因的生物信息學(xué)分析

參考Gramene數(shù)據(jù)庫(kù)中的OsSRMYB1基因序列信息（LOC_Os12g03150.1）[8]，根據(jù)Primer Premier 5對(duì)引物OsSR MYB1-F（5′-GAACTATAGCTAGCCAAGTAGCCATG-3′）及OsSRMYB1-R（5′-GTTCTTGATGTCGTTGTCGGTG-3′）進(jìn)行設(shè)計(jì)，模板選擇水稻耐旱品種韭菜青cDNA，通過(guò)PCR對(duì) OsSRMYB1基因的全長(zhǎng)進(jìn)行擴(kuò)增，將其與pMD18-T載體進(jìn)行連接并進(jìn)行序列的測(cè)定。利用SMART網(wǎng)站（http：//smart.embl-heidelberg.de/）對(duì)獲得的序列進(jìn)行蛋白序列結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。利用Rice oligonucleotide array database分析其在水稻不同組織中的表達(dá)。此外，利用genevestigator數(shù)據(jù)庫(kù)分析其在不同脅迫下的表達(dá)情況以及其共表達(dá)基因。運(yùn)用ClustalX與MEGA 4軟件對(duì)OsSRMYB1進(jìn)行多重序列比對(duì)與進(jìn)化樹構(gòu)建。

2結(jié)果與分析

2.1OsSRMYB1的克隆及蛋白特性分析

以韭菜青cDNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得OsSRMYB1基因全長(zhǎng)并進(jìn)行測(cè)序及序列分析，結(jié)果表明OsSRMYB1的ORF長(zhǎng)度為1 599 bp，蛋白產(chǎn)物由311個(gè)氨基酸構(gòu)成，分子量為34.06 KDa，等電點(diǎn)為-3.0。利用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析該蛋白的結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明該蛋白包含SANT結(jié)構(gòu)域（圖1），為MYB家族蛋白。

2.2OsSRMYB1與其他非生物脅迫相關(guān)MYB類鋅指蛋白的序列比對(duì)與進(jìn)化樹構(gòu)建

選取非生物脅迫相關(guān)MYB類鋅指蛋白Atmyb102、Atmyb2、GmMYB92、GmMYB76和OsSRMYB1，利用ClustalX與MEGA4軟件進(jìn)行序列比對(duì)及進(jìn)化分析。由圖2、圖3可知，OsSRMYB1與其他4種MYB類鋅指蛋白的氨基酸序列顯著相似，特別是在其保守結(jié)構(gòu)域內(nèi)氨基酸序列高度保守。

2.3OsSRMYB1在不同組織及各種處理?xiàng)l件下的表達(dá)

利用Rice oligonucleotide array database，分析OsSRMYB1在水稻不同組織中的表達(dá)，結(jié)果分析表明OsSRMYB1基因在根、莖、葉片、葉鞘、穗等不同組織中均有表達(dá)（圖4），其在葉中表達(dá)水平較高。

利用Gene vestigator數(shù)據(jù)庫(kù)分析OsSRMYB1在不同脅迫下的表達(dá)情況，結(jié)果表明OsSRMYB1的表達(dá)受非生物脅迫影響，說(shuō)明OsSRMYB1可能參與非生物脅迫響應(yīng)。為了進(jìn)一步分析OsSRMYB1在非生物脅迫中的功能，利用Real-time PCR分析了OsSRMYB11在H2O2、20% PEG、低溫（4 ℃）及ABA處理下的表達(dá)（圖5）。由表5可知，OsSRMYB1表達(dá)受H2O2誘導(dǎo)，而在20% PEG處理下其表達(dá)受抑制，表明OsSRMYB1可能參與了干旱、氧化脅迫等非生物脅迫的響應(yīng)。

2.4OsSRMYB1的共表達(dá)與共調(diào)節(jié)基因分析

利用Genevestigator軟件對(duì)OsSRMYB1可能的共表達(dá)及共調(diào)節(jié)基因進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6、圖7所示。OsSRMYB1的共表達(dá)基因?yàn)長(zhǎng)OC_Os09g37050，編碼RING-H2鋅指蛋白，根據(jù)genevestigator分析該基因受NAA、GA3誘導(dǎo)。OsSRMYB1的共調(diào)節(jié)基因?yàn)長(zhǎng)OC_Os02g44320，編碼蛋白酶抑制劑蛋白，根據(jù)genevestigator分析該基因受冷害、H2O2誘導(dǎo)。

3結(jié)論與討論

現(xiàn)有的研究表明，水稻中有多個(gè)基因家族參與非生物脅迫的應(yīng)答，如GT轉(zhuǎn)錄因子家族[9]、TIFY基因家族[10]、BURP基因家族[11]、類BRX基因家族[12]等。OsSRMYB1為MYB類鋅指蛋白，已有研究結(jié)果表明MYB類鋅指蛋白亦可能參與非生物脅迫響應(yīng)，如大豆GmMYB92、GmMYB76 及擬南芥Atmyb102、Atmyb2蛋白。研究表明 OsSRMYB1是一種在細(xì)胞內(nèi)普遍存在且大量表達(dá)的多聚體核糖體蛋白質(zhì)，在基因表達(dá)、抗逆響應(yīng)中起重要作用。在組織表達(dá)分析中OsSRMYB1在新葉與幼穗中含量較高，表明OsSRMYB1可能在主要在分生組織中表達(dá)。

本研究克隆了OsSRMYB1基因，并通過(guò)氨基酸序列比對(duì)、蛋白結(jié)構(gòu)域分析、基因表達(dá)特性等分析表明OsSRMYB1可能參與非生物脅迫響應(yīng)，為進(jìn)一步深入分析OsSRMYB1的生物學(xué)功能提供基礎(chǔ)。與大多數(shù)已經(jīng)報(bào)道的植物MYB類轉(zhuǎn)錄因子不同，本研究發(fā)現(xiàn)的OsSRMYB1受滲透脅迫的負(fù)調(diào)節(jié)，表明該基因可能在植物響應(yīng)非生物脅迫過(guò)程中發(fā)揮了負(fù)向調(diào)控的作用。進(jìn)一步將通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得過(guò)量和RNA干涉抑制表達(dá)OsSRMYB1基因的水稻轉(zhuǎn)基因植物，深入研究其參與的非生物脅迫應(yīng)答機(jī)制。

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1.5OsSRMYB1基因的生物信息學(xué)分析

參考Gramene數(shù)據(jù)庫(kù)中的OsSRMYB1基因序列信息（LOC_Os12g03150.1）[8]，根據(jù)Primer Premier 5對(duì)引物OsSR MYB1-F（5′-GAACTATAGCTAGCCAAGTAGCCATG-3′）及OsSRMYB1-R（5′-GTTCTTGATGTCGTTGTCGGTG-3′）進(jìn)行設(shè)計(jì)，模板選擇水稻耐旱品種韭菜青cDNA，通過(guò)PCR對(duì) OsSRMYB1基因的全長(zhǎng)進(jìn)行擴(kuò)增，將其與pMD18-T載體進(jìn)行連接并進(jìn)行序列的測(cè)定。利用SMART網(wǎng)站（http：//smart.embl-heidelberg.de/）對(duì)獲得的序列進(jìn)行蛋白序列結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。利用Rice oligonucleotide array database分析其在水稻不同組織中的表達(dá)。此外，利用genevestigator數(shù)據(jù)庫(kù)分析其在不同脅迫下的表達(dá)情況以及其共表達(dá)基因。運(yùn)用ClustalX與MEGA 4軟件對(duì)OsSRMYB1進(jìn)行多重序列比對(duì)與進(jìn)化樹構(gòu)建。

2結(jié)果與分析

2.1OsSRMYB1的克隆及蛋白特性分析

以韭菜青cDNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得OsSRMYB1基因全長(zhǎng)并進(jìn)行測(cè)序及序列分析，結(jié)果表明OsSRMYB1的ORF長(zhǎng)度為1 599 bp，蛋白產(chǎn)物由311個(gè)氨基酸構(gòu)成，分子量為34.06 KDa，等電點(diǎn)為-3.0。利用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析該蛋白的結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明該蛋白包含SANT結(jié)構(gòu)域（圖1），為MYB家族蛋白。

2.2OsSRMYB1與其他非生物脅迫相關(guān)MYB類鋅指蛋白的序列比對(duì)與進(jìn)化樹構(gòu)建

選取非生物脅迫相關(guān)MYB類鋅指蛋白Atmyb102、Atmyb2、GmMYB92、GmMYB76和OsSRMYB1，利用ClustalX與MEGA4軟件進(jìn)行序列比對(duì)及進(jìn)化分析。由圖2、圖3可知，OsSRMYB1與其他4種MYB類鋅指蛋白的氨基酸序列顯著相似，特別是在其保守結(jié)構(gòu)域內(nèi)氨基酸序列高度保守。

2.3OsSRMYB1在不同組織及各種處理?xiàng)l件下的表達(dá)

利用Rice oligonucleotide array database，分析OsSRMYB1在水稻不同組織中的表達(dá)，結(jié)果分析表明OsSRMYB1基因在根、莖、葉片、葉鞘、穗等不同組織中均有表達(dá)（圖4），其在葉中表達(dá)水平較高。

利用Gene vestigator數(shù)據(jù)庫(kù)分析OsSRMYB1在不同脅迫下的表達(dá)情況，結(jié)果表明OsSRMYB1的表達(dá)受非生物脅迫影響，說(shuō)明OsSRMYB1可能參與非生物脅迫響應(yīng)。為了進(jìn)一步分析OsSRMYB1在非生物脅迫中的功能，利用Real-time PCR分析了OsSRMYB11在H2O2、20% PEG、低溫（4 ℃）及ABA處理下的表達(dá)（圖5）。由表5可知，OsSRMYB1表達(dá)受H2O2誘導(dǎo)，而在20% PEG處理下其表達(dá)受抑制，表明OsSRMYB1可能參與了干旱、氧化脅迫等非生物脅迫的響應(yīng)。

2.4OsSRMYB1的共表達(dá)與共調(diào)節(jié)基因分析

利用Genevestigator軟件對(duì)OsSRMYB1可能的共表達(dá)及共調(diào)節(jié)基因進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6、圖7所示。OsSRMYB1的共表達(dá)基因?yàn)長(zhǎng)OC_Os09g37050，編碼RING-H2鋅指蛋白，根據(jù)genevestigator分析該基因受NAA、GA3誘導(dǎo)。OsSRMYB1的共調(diào)節(jié)基因?yàn)長(zhǎng)OC_Os02g44320，編碼蛋白酶抑制劑蛋白，根據(jù)genevestigator分析該基因受冷害、H2O2誘導(dǎo)。

3結(jié)論與討論

現(xiàn)有的研究表明，水稻中有多個(gè)基因家族參與非生物脅迫的應(yīng)答，如GT轉(zhuǎn)錄因子家族[9]、TIFY基因家族[10]、BURP基因家族[11]、類BRX基因家族[12]等。OsSRMYB1為MYB類鋅指蛋白，已有研究結(jié)果表明MYB類鋅指蛋白亦可能參與非生物脅迫響應(yīng)，如大豆GmMYB92、GmMYB76 及擬南芥Atmyb102、Atmyb2蛋白。研究表明 OsSRMYB1是一種在細(xì)胞內(nèi)普遍存在且大量表達(dá)的多聚體核糖體蛋白質(zhì)，在基因表達(dá)、抗逆響應(yīng)中起重要作用。在組織表達(dá)分析中OsSRMYB1在新葉與幼穗中含量較高，表明OsSRMYB1可能在主要在分生組織中表達(dá)。

本研究克隆了OsSRMYB1基因，并通過(guò)氨基酸序列比對(duì)、蛋白結(jié)構(gòu)域分析、基因表達(dá)特性等分析表明OsSRMYB1可能參與非生物脅迫響應(yīng)，為進(jìn)一步深入分析OsSRMYB1的生物學(xué)功能提供基礎(chǔ)。與大多數(shù)已經(jīng)報(bào)道的植物MYB類轉(zhuǎn)錄因子不同，本研究發(fā)現(xiàn)的OsSRMYB1受滲透脅迫的負(fù)調(diào)節(jié)，表明該基因可能在植物響應(yīng)非生物脅迫過(guò)程中發(fā)揮了負(fù)向調(diào)控的作用。進(jìn)一步將通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得過(guò)量和RNA干涉抑制表達(dá)OsSRMYB1基因的水稻轉(zhuǎn)基因植物，深入研究其參與的非生物脅迫應(yīng)答機(jī)制。

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