重組人hSERCA2a基因腺病毒載體構(gòu)建和包裝

王紅麗， 李志強， 周賢慧， 許國軍， 湯寶鵬

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院1臨床醫(yī)學研究院， 2心臟起搏電生理科, 烏魯木齊 830054)

肌漿網(wǎng)鈣ATP酶(sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPase,SERCA2a)是心肌細胞胞內(nèi)鈣代謝的主要調(diào)節(jié)蛋白，在心肌收縮和舒張中起著關(guān)鍵作用。將攜帶SERCA2a基因的病毒感染衰竭的心肌細胞使心肌組織中SERCA2a基因表達上調(diào)，改善心肌舒縮功能，因此通過轉(zhuǎn)導(dǎo)SERCA2a基因治療心衰已成為當今的一個熱點[1]。腺病毒是一種安全可靠的載體，其具有病毒滴度高、包裝容量大、細胞感染范圍廣等顯著的特點，通過病毒注射可以直接增加細胞內(nèi)目的基因表達。本研究借助腺病毒作為載體，構(gòu)建重組人SERCA2a(human SERCA2a,hSERCA2a)腺病毒載體，為SERCA2a基因治療心力衰竭的動物實驗及臨床試驗研究提供方法學基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1主要材料與試劑人胚腎293(human embryo kidney cell culture，HEK293)細胞、大腸桿菌DH5α、腺病毒穿梭質(zhì)粒pshuttle-CMV、骨架質(zhì)粒pAdEasy(深圳市百恩維生物科技有限公司)。攜帶hSERCA2a基因的載體(Stratagene)，限制性內(nèi)切酶、T4連接酶(NEB)、質(zhì)粒提取試劑盒、大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，脂質(zhì)體Polyfectine(深圳百恩維生物科技有限公司)，其余試劑均為進口或國產(chǎn)分析純試劑。

1.2病毒載體構(gòu)建設(shè)計hSERCA2a引物，擴增出基因hSERCA2a。由Invitrogen 公司合成引物rAd-hSERCA2-SacII-F:5′-TCCCCGCGGCACCAT-GGAGAACGCGCACACCAAGACGGTGGAGG-3′；rAd-hSERCA2-SalI-R:5′-CGCGTCGACCTCCAGTATTGCAGGTTCCAGGTAGTTGCGGGCCAC-AA-3′。擴增條件：95 ℃變性4 min，95℃變性20 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)，72 ℃延伸7 min。腺病毒穿梭質(zhì)粒pshuttle-CMV分別用SalⅠ+SacⅡ雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。2次回收產(chǎn)物用T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞，獲得pshuttle-CMV-EGFP-hSERCA2a重組載體。搖菌，提取質(zhì)粒進行 DNA測序鑒定。將重組載體用PacⅠ單酶切線性化，回收酶切產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化已含有pAdEasy的BJ5183 感受態(tài)細胞進行同源重組獲得重組質(zhì)粒pAdEasy-EGFP-hSERCA2a，挑取陽性克隆進行DNA測序鑒定，再進行病毒包裝。

1.3腺病毒的包裝將質(zhì)粒pAdEasy-EGFP-hSERCA2a轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞，挑取單克隆菌液、搖菌，大提質(zhì)粒。取20 μg質(zhì)粒DNA用PacⅠ線性化，37℃酶切過夜，采用酚氯仿抽提，無水乙醇沉淀方法純化DNA ，紫外分光光度計測定純化質(zhì)粒濃度。線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞，細胞的密度達到80%～90%時進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后第2天，觀察熒光比例并確定轉(zhuǎn)染效率。細胞長滿培養(yǎng)皿時，將細胞進行傳代于細胞培養(yǎng)瓶中，用含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察細胞出毒跡象。待細胞90%病變時收集細胞和培養(yǎng)基，用反復(fù)凍融方法使病毒從細胞中釋放出來，收集含有病毒的上清液。

1.4重組腺病毒的滴度測定在滴度測定前1 天取48孔板，加入攜帶目的基因重組腺病毒載體的HEK293細胞。用DMEM完全培養(yǎng)基10倍梯度稀釋病毒。取96孔板，每孔含有90 μL培養(yǎng)基，第1橫排孔每孔加入10 μL待測病毒原液，混勻后吸取10 μL混合液至第2橫排孔，如此稀釋至第8橫排孔(表1)。吸取10 μL病毒混合液加入到相對應(yīng)的48孔板中，重組腺病毒rAd-SERCA2a含有綠色熒光蛋白，經(jīng)48 h感染后，可以在熒光顯微鏡下檢測到綠色熒光蛋白的表達，用熒光顯微鏡計數(shù)。在最高稀釋梯度m孔中數(shù)出n(n<10)個帶熒光的細胞，則病毒滴度為n×10m/mL(m為稀釋梯度)，若n>10，則需繼續(xù)稀釋。

表1 pAdEasy-EGFP-SERCA2a滴度測定(TU/mL)

1.5重組腺病毒的擴增與純化取原代重組腺病毒上清液，反復(fù)感染HEK293細胞，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，鏡下觀察到95%～100%細胞出現(xiàn)病毒感染時，收集細胞，用-70℃和37℃反復(fù)凍融3次，收集上清液。重組腺病毒病毒加入到純化柱，進行純化，洗滌后收集到無菌的EP管中，-80℃保存。

2 結(jié)果

2.1hSERCA2a基因PCR鑒定得到與預(yù)期大小一致的目的條帶，條帶大小為2 998 bp，證明重組腺病毒載體上含有hSERCA2a特異性目的片段(圖1)。

2.2pAdEasy-EGFP-SERCA2a酶切鑒定SalⅠ+SacⅡ雙酶切能切出2 998 bp左右片段的陽性克隆，酶切結(jié)果表明目的基因hSERCA2a已成功克隆至載體質(zhì)粒(圖2)。DNA測序鑒定結(jié)果表明hSERCA2a基因序列完全正確(圖3)，證明重組腺相關(guān)病毒pAdEasy-EGFP-hSERCA2a載體構(gòu)建成功。

2.3病毒轉(zhuǎn)染HEK293細胞結(jié)果重組腺病毒質(zhì)粒pAdEasy-EGFP-hSERCA2a轉(zhuǎn)染HEK293細胞24 h后，熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染成功的細胞中明顯有綠色熒光出現(xiàn)(圖4a)；轉(zhuǎn)染 48 h，可見大部分細胞轉(zhuǎn)染成功，明顯的綠色熒光聚集(圖4b)，圖4a、4b對應(yīng)的普通光鏡下的白光圖見圖4c、4d。

M: marker；1：陰性對照；2：腺病毒hSERCA2a PCR擴增；3：陽性對照

M: marker；1：pAdEasy-EGFP-SERCA2a用SalⅠ+ SacⅡ雙酶切。

2.4重組腺病毒的滴度測定重組腺病毒轉(zhuǎn)染HEK293細胞72 h收集病毒，病毒濃縮液滴度測定，病毒滴度測定結(jié)果顯示滴度為1×1012μg/mL。

圖3 SERCA2a基因序列測序鑒定

3 討論

SERCA2a是參與鈣離子調(diào)節(jié)的主要蛋白，主要存在于心肌和骨骼肌中，其功能是ATP依賴性地逆濃度梯度將鈣離子由胞漿排入肌漿網(wǎng)內(nèi)，促進心肌舒張。Ca2+在調(diào)節(jié)心臟的收縮和舒張過程中具有重要的作用。

近年國內(nèi)外轉(zhuǎn)導(dǎo)SERCA2a基因治療心力衰竭的作用得到了一致肯定[2]。SERCA2a基因能穩(wěn)定肌質(zhì)網(wǎng) Ca2+濃度和降低肌質(zhì)網(wǎng) Ca2+丟失，減少心力衰竭心肌細胞的觸發(fā)活動[3]。隨著心血管疾病發(fā)生機制的分子生物學深入研究，認識到基質(zhì)網(wǎng)鈣(SR)濃度的降低是心力衰竭時的顯著特征，基質(zhì)網(wǎng)鈣離子濃度的降低將導(dǎo)致在電機械收縮過程的鈣離子釋放減少和心肌收縮力的降低，鈣離子調(diào)控失常主要基于2個原因：(1)SERCA2a的表達降低是因為肌漿網(wǎng)鈣ATP酶協(xié)助SR對鈣離子的攝入；(2)SR鈣離子釋放通道或心臟ryanodine受體的滲漏[4]。心衰基因治療的一項基本策略是將SERCA基因轉(zhuǎn)入心衰的心肌細胞，使心肌組織中肌質(zhì)網(wǎng)SERCA表達量提高，改善心肌舒縮功能[5]。

a、b分別為rAd-SERCA2a-EGFP轉(zhuǎn)染后24、48 h綠色熒光圖；c、d分別為相對應(yīng)視野下的白光圖

大量研究表明，在衰竭的心肌細胞中，SERCA2a mRNA的表達量及SERCA2a的活性與正常心肌相比降低30%[6]?；A(chǔ)研究表明，腺病毒載體將兔肌質(zhì)網(wǎng)SERCA2a基因轉(zhuǎn)入大鼠心肌細胞，SERCA2a轉(zhuǎn)染的大鼠心肌細胞內(nèi)SERCA表達水平明顯提高， 且活性增強[7]。Li等[8]的實驗研究通過腺病毒將SERCA 2a基因同時導(dǎo)入大鼠和兔心肌細胞，發(fā)現(xiàn)兔和大鼠的心功能發(fā)生明顯改善尤其是收縮功能，阻止了心衰的進一步發(fā)展。SERCA2a的轉(zhuǎn)基因治療可調(diào)節(jié)晚期心力衰竭患者心肌細胞內(nèi)鈣循環(huán)，伴隨著SERCA2a的活性和表達量的增加及心肌細胞的SERCA2a水平的恢復(fù)，心肌細胞的收縮和松弛功能得到明顯的改善，進而恢復(fù)和拯救心衰心肌。

本研究成功地構(gòu)建攜帶hSERCA2a基因的重組腺病毒載體，建立了穩(wěn)定可靠的借助HEK-293細胞培養(yǎng)并純化高效價的rAd-hSERCA2a-EGFP重

組體的方法，對重組腺病毒攜帶其他基因的擴增與提純方法具有一定的參考價值。本研究通過攜帶SERCA2a基因的腺病毒載體感染心肌細胞可使心肌細胞內(nèi)的SERCA2a基因的表達上調(diào)。rAd-hSERCA2a-EGFP重組體可直接用于心血管疾病的動物實驗研究，因腺病毒表達周期短，所以腺病毒載體介導(dǎo)的SERCA2a基因過度表達能夠短期有效地增強心臟功能，改善心肌舒縮功能，為心力衰竭的動物實驗及臨床試驗基因治療研究提供新方法。

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