新疆地區(qū)哈薩克族和漢族人群中GGCX基因多態(tài)性分析

夏依扎·卡瑪力， 木胡牙提， 盧武紅， 劉志強(qiáng)， 何鵬義， 楊玉春

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院綜合心臟內(nèi)科， 烏魯木齊 830054)

γ-谷氨酰基羧化酶(γ-glutamyl carboxylase,GGCX)是維生素K循環(huán)中的關(guān)鍵酶, 其功能是催化凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ 的γ- 羧基化作用, 其作用的發(fā)揮依賴(lài)于維生素K和O2。當(dāng)還原型維生素K和O2存在時(shí), GGCX將CO2摻入特異的谷氨酸殘基中, 反應(yīng)產(chǎn)生γ- 羧基化的谷氨酸; 同時(shí)產(chǎn)生維生素K 2, 3- 環(huán)氧化物[1]。近期的國(guó)內(nèi)外研究表明,GGCX是影響口服抗凝藥華法林用量個(gè)體差異的遺傳因素之一,其中研究較多的有GGCX(rs12714145)、GGCX(1181T→G)及GGCX 3261G>A位點(diǎn)的多態(tài)性與華法林用量個(gè)體差異的相關(guān)性[2-4]。為了解GGCX的2個(gè)單核苷酸位點(diǎn)(rs11676382和rs6751560)基因多態(tài)性在新疆地區(qū)哈薩克族、漢族人群中的分布情況,本研究應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)-限制性?xún)?nèi)切酶長(zhǎng)度片段多態(tài)性 (PCR-RFL P)技術(shù)對(duì)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院305例哈薩克族和305例漢族健康體檢者GGCX的2個(gè)單核苷酸位點(diǎn)基因型進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算基因分布頻率，并進(jìn)行分析和比較。

1 資料與方法

1.1一般資料隨機(jī)選取2011年1月-2012年12月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院進(jìn)行健康體檢的哈薩克族和漢族人群各305例,其中哈薩克族男性147例,女性158例；漢族男性150例，女性155例,年齡18～80歲。

1.2方法

1.2.1 樣本采集與DNA提取 抽取受檢者外周靜脈血5 mL,EDTA-Na2抗凝。標(biāo)準(zhǔn)酚-氯仿法提取基因組DNA,核酸蛋白分析儀(Eppendorf Biopho-tometer)檢測(cè)樣本DNA純度和濃度后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增 設(shè)計(jì)一對(duì)引物擴(kuò)增包含GGCX rs11676382、rs6751560位點(diǎn)的片段(表1)。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。PCR擴(kuò)增在C1000TMThermal CyclerPCR儀上進(jìn)行,20 μL PCR反應(yīng)體系含: PCR Master mix(2X)10 μL,上、下游引物各0.5 pmol,ddH2O 7.5 μL,基因組DNA 2 μL。循環(huán)參數(shù):95℃預(yù)變性3 min,95℃變性30 s,60.8℃(rs11676382)、59.0℃(rs6751560)退火30 s,72℃延伸 1 min,共35個(gè)循環(huán);最后72℃總延伸5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后,取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在2.0%瓊脂糖凝膠上電泳,觀察PCR產(chǎn)物的特異性和片斷大小。

表1 擴(kuò)增目的基因及位點(diǎn)、引物序列、退火溫度及產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.2.3 酶切分型 采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)的方法。(1)HindⅢ內(nèi)切酶用于消化rs11676382位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物：取10 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 ，10×buffer R 2 μL，HindⅢ 1 μL，ddH2O 7.5 μL,37℃ 下水浴過(guò)夜。 (2)BsrI內(nèi)切酶用于消化rs6751560的擴(kuò)增產(chǎn)物： 取10 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，10×buffer B 2 μL，ddH2O 7.5 μL，BsrI 1 μL，65℃下水浴過(guò)夜。 (3)2%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切產(chǎn)物：取 10 μL酶切產(chǎn)物加入 2%瓊脂糖凝膠負(fù)極端的加樣孔，以6×DNA Loading Buffer(Bromophenol Blue)為染色劑，在120 V 電壓下電泳25 min，100 V 電壓下電泳10 min，80 V 電壓下電泳15 min，在紫外線燈下觀察帶型。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算 GGCX rs11676382、rs6751560基因型及等位基因頻率。采用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。不同民族人群基因分布情況的比較用χ2檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)用χ2檢驗(yàn)判斷GGCX的等位基因頻率和基因型頻分布是否符合Hardy-Weinberg平衡。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1基因型檢測(cè)經(jīng)PCR擴(kuò)增后GGCX rs11676382位點(diǎn)基因目的片段大小為283 bp,rs6751560位點(diǎn)基因目的片段大小為304 bp。根據(jù)酶切情況，rs11676382位點(diǎn)基因型有3種：野生型CC有167 bp和116 bp 2個(gè)條帶，雜合型CG有167 bp、116 bp和283 bp 3個(gè)條帶，突變型GG有283 bp 1個(gè)條帶(圖1及圖3)；rs6751560位點(diǎn)基因型有3種：野生型AA有304 bp 1個(gè)條帶，雜合型AG有61 bp、103 bp、140 bp和304 bp 4個(gè)條帶，突變型GG有61 bp、103 bp和140 bp 3條帶(圖2及圖4)。

M:DNA Marker; 1～6: 加PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

M:DNA Marker; 1～6: 加PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

M:DNA Marker; 6,8,13: CC基因型； 1～5,7,9～12,14: CG基因型； 15: GG基因型

M:DNA Marker; 9:AA基因型；AA: AG基因型； 1～8,10,12: GG基因型

2.2GGCXrs11676382、rs6751560位點(diǎn)等位基因和基因型分布rs11676382基因型CC、CG和GG在哈薩克族人群中分別有66例(21.64%)、233例(76.39%)和6例(1.97%),C和G等位基因的頻率分別為59.84%和83.50%；在漢族人群中分別有209例(68.30%)、93例(30.39%)和4例(1.31%),C和G等位基因的頻率分別為40.16% 和16.50%。rs6751560基因型AA、AG和GG在哈薩克族人群中分別有2例(0.66%)、11例(3.61%)和292例(95.74%), A和G等位基因的頻率分別為2.46%和97.54%；在漢族人群中AA、AG和GG分別有4例(1.31%)、3例(0.98%)和298例(97.70%), A和G等位基因的頻率分別為1.80%和98.20% (表2)。

2.3不同民族GGCXrs11676382、rs6751560位點(diǎn)基因多態(tài)性分布情況的比較新疆地區(qū)哈薩克族與漢族人群rs11676382位點(diǎn)基因型比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(總χ2=134.9，P<0.01)，顯性模型CC與CG+GG、隱性模型GG與CC+CG、附加模型CG與CC+GG之間比較顯示，顯性模型和附加模型比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=134.4和129.9，P<0.01)，等位基因C與G比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=84.3，P<0.01)。rs11676382位點(diǎn)隱性模型比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。新疆地區(qū)哈薩克族與漢族rs6751560位點(diǎn)基因型比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.30，P>0.05)，等位基因A與G比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.63，P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 GGCX基因rs11676382、6751560位點(diǎn)基因頻率和等位基因頻率比較/例(%)

3 討論

基因有遺傳效應(yīng)的DNA片段是控制生物性狀的基本遺傳單位?；蛴?個(gè)特點(diǎn):(1)能忠實(shí)地復(fù)制自己，以保持生物的基本特征；(2)基因能夠“突變”，突變絕大多數(shù)會(huì)導(dǎo)致疾病，另外的一小部分是非致病突變。基因型又稱(chēng)遺傳型，某一生物個(gè)體全部基因組合的總稱(chēng)。等位基因(allele又稱(chēng)作allelomorph)一般指位于一對(duì)同源染色體的相同位置上控制著相對(duì)性狀的一對(duì)基因。等位基因頻率是群體遺傳學(xué)的術(shù)語(yǔ)，用來(lái)顯示一個(gè)種群中基因的多樣性，或者說(shuō)是基因庫(kù)的豐富程度[5-8]。

目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)基因多態(tài)性與某種疾病相關(guān)性、基因型對(duì)臨床上某種藥物需求量的影響等研究較多，其結(jié)果對(duì)臨床醫(yī)師在臨床上對(duì)疾病的治療及個(gè)體化用藥起到了不可忽視的作用，如華法林(Warfarin)是目前在臨床上常用的抗凝藥,用于瓣膜病、瓣膜置換、非瓣膜病性房顫、電復(fù)律、冠心病、肺栓塞和深靜脈血栓形成等的抗凝治療[9]。但華法林用量存在個(gè)體差異,若劑量大，有嚴(yán)重出血的危險(xiǎn)[10-11]。諸多國(guó)內(nèi)外研究顯示除了遺傳、環(huán)境、藥物、疾病等因素外，基因多態(tài)性在華法林個(gè)體用藥方面起一定的作用[12-13,14-24]。

研究某個(gè)群或多個(gè)群基因多態(tài)性，且進(jìn)一步行基因多態(tài)性與臨床藥物劑量需求的相關(guān)性研究，對(duì)臨床醫(yī)師在臨床上個(gè)體化用藥有很大的幫助。

本研究結(jié)果顯示，新疆地區(qū)哈薩克族與漢族人群rs11676382位點(diǎn)多態(tài)性均以CC和CG基因型比較常見(jiàn)，C等位基因出現(xiàn)的頻率比G等位基因出現(xiàn)的頻率高；CC基因型是保護(hù)因素，而CG基因型是危險(xiǎn)因素，GG基因型既不是保護(hù)因素，又不是危險(xiǎn)因素。rs6751560位點(diǎn)顯示：2個(gè)民族人群中GG基因型常見(jiàn)，A和G等位基因出現(xiàn)的頻率相等。

本研究利用PCR-RFLP技術(shù)，對(duì)新疆哈薩克族和漢族人群γ-谷氨?；然傅膔s11676382和rs6751560SNP位點(diǎn)初步進(jìn)行了檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)其不同的基因型及基因型分布頻率有差異，將來(lái)需要進(jìn)行更多的相關(guān)性研究，使其為臨床及患者服務(wù)。

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