維生素D受體基因多態(tài)性與新疆南疆地區(qū)維吾爾族小兒上尿路含鈣結(jié)石易感性的關(guān)系研究

宋光魯， 郭小麗， 孫 浩， 凱撒兒·阿吉， 安尼瓦爾·牙生， 王玉杰

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿中心， 烏魯木齊 830054)

尿路結(jié)石是由基因、環(huán)境和激素等相互作用而引起的多因素疾病。伴隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展及人們對(duì)尿路結(jié)石研究的深入，遺傳基因?qū)δ蚵方Y(jié)石形成的影響越來(lái)越引起眾多研究者的關(guān)注。目前的研究顯示，與尿路結(jié)石有關(guān)的維生素D受體(VDR)基因多態(tài)性位點(diǎn)較多，主要是限制性?xún)?nèi)切酶BsmI、ApaI、TaqI、FokI的酶切位點(diǎn)[1]。從人種學(xué)來(lái)說(shuō)，漢族、蒙古族等屬于蒙古人種，而維吾爾族、哈薩克族等屬于高加索人種，不同的人種，VDR基因多態(tài)性的分布頻率存在差異[2-3]。本研究采用PCR-RFLP及DNA測(cè)序技術(shù)，對(duì)新疆南疆地區(qū)的維吾爾族小兒上尿路含鈣結(jié)石患兒的VDR基因多態(tài)性進(jìn)行研究，探討維吾爾族小兒患者VDR基因型頻率分布特點(diǎn)及規(guī)律，試圖揭示其與維吾爾族小兒上尿路結(jié)石發(fā)病的關(guān)系和遺傳機(jī)制。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象選擇2011年3月-2013年6月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科住院治療的南疆地區(qū)維吾爾族上尿路結(jié)石患兒為病例組(n=89)，年齡6個(gè)月～7歲，男性57例，女性32例。所有患兒經(jīng)CT、靜脈尿路造影(IVP)和B超檢查明確診斷為“上尿路結(jié)石”，常規(guī)行血尿液樣本檢查、血肝腎功能檢查、血電解質(zhì)檢查。所有患兒結(jié)石樣本進(jìn)行紅外光譜結(jié)石成分分析證明含有鈣鹽的成分。選擇同期同一地區(qū)健康維吾爾族兒童作為對(duì)照組(n=121)，生活習(xí)慣和飲食習(xí)慣均相近，男性67例，女性54例，所有兒童無(wú)家族性結(jié)石病史，經(jīng)泌尿系超聲檢查無(wú)尿路結(jié)石、腎鈣化等異常病變，常規(guī)行血尿樣本檢查、血肝腎功能檢查、血電解質(zhì)檢查。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)尿路結(jié)石的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考第9版《坎貝爾泌尿外科學(xué)》及第7版人民衛(wèi)生出版社出版的《外科學(xué)》教科書(shū)，且均行CT、IVP和B超確診為“上尿路結(jié)石”即“腎及輸尿管結(jié)石”；(2)維吾爾族患兒及父母均出生于新疆南疆地區(qū)；(3)所有患兒的結(jié)石樣本經(jīng)分析為含鈣成分的結(jié)石類(lèi)型如草酸鈣、磷酸鈣、碳酸鈣等。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患有鈣磷代謝有關(guān)其他疾病者如佝僂病、甲狀腺功能障礙、甲狀旁腺功能障礙者；(2)有臨床表現(xiàn)的尿路感染并正接受治療的患兒。(3)患尿路結(jié)石的患兒伴隨有腎盂輸尿管狹窄、腎功能不全、腎小管酸中毒癥、腫瘤疾病、骨質(zhì)疏松等。(4)補(bǔ)充維生素D及服用含鈣成分的藥品、補(bǔ)品等兒童。本研究通過(guò)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)同意批準(zhǔn)。抽血前均告知所有研究對(duì)象的合法家長(zhǎng)并簽署標(biāo)本收取知情同意書(shū)。

1.2主要試劑紅細(xì)胞裂解液、細(xì)胞核裂解液、蛋白沉淀液、DNA溶解液、1×TAE緩沖液、5×TBE緩沖液(北京百泰克生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))，外周血基因組DNA提取試劑盒(美國(guó)Gentra公司)，Agarose(美國(guó)sigma 公司)，EDTA(北京化學(xué)試劑公司生產(chǎn))，內(nèi)切酶(MBI Fermentas公司)，引物(上海生工生物公司)。

1.3方法

1.3.1 提取基因組DNA 抽取外周靜脈血2 mL，用外周血基因組DNA提取試劑盒提取分離。DNA產(chǎn)物-80℃保存。

1.3.2 PCR 擴(kuò)增 查Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)確定基因型及序列[rs:2228570,rs7975232rs731236]，VDR基因FokI酶切位點(diǎn)引物序列為：上游引物：5’-AGC TGG CCC TGG CAC TGA CTC TGC TCT-3’，下游引物：5’-ATG GAA ACA CCT TGC TTC TTC TCC CTC-3’；ApaI酶切位點(diǎn)引物序列為：上游引物：5’-CAG AGC ATG GAC AGG GAG CAA-3’，下游引物：5’-GCA ACT CCT CAT GGC TGA GGT CTC-3’；TaqI酶切位點(diǎn)引物序列為：上游引物：5’-CTC AGT GAT CAC GAT ACT GTG-3’，下游引物：5’-ATT CAG TGG AAC CAG CGT TGG-3’。采用聚合酶鏈反應(yīng)方法，擴(kuò)增回收所需的DNA片段產(chǎn)物。

1.3.3 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析 采集10 μL PCR產(chǎn)物分別加入2單位ApaI、TaqI、FokI內(nèi)切酶，在37℃過(guò)夜進(jìn)行內(nèi)切后，經(jīng)3%瓊脂糖凝膠跑電泳，因酶切后的條帶片段較小，且2個(gè)條帶的距離較近，需低電壓長(zhǎng)時(shí)間跑電泳，保證條帶充分分開(kāi)。電泳初始進(jìn)膠電壓為100 V，持續(xù)電壓為60 V，跑60 min,之后在紫外燈下觀察及拍照記錄。

1.3.4 結(jié)果鑒定 VDR基因的目的片段經(jīng)相應(yīng)內(nèi)切酶內(nèi)切以后電泳條帶會(huì)出現(xiàn)3種情況：有內(nèi)切位點(diǎn)的純合子出現(xiàn)2個(gè)條帶，以ff/tt/aa表示；沒(méi)有內(nèi)切位點(diǎn)的純合子出現(xiàn)1個(gè)條帶，以FF/TT/AA表示；雜合子出現(xiàn)3個(gè)條帶，用Ff/Tt/Aa表示。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用Microsoft Excel建立數(shù)據(jù)庫(kù)，使用SPSS11.5軟件分析數(shù)據(jù)。采用χ2檢驗(yàn)分析等位基因頻率、基因型頻率和病例組與對(duì)照組之間基因型分布差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由Hardy-Weinberg定律可知，等位基因A1和等位基因A2的頻率分別為p和q，(p+q)2=p2+2pq+q2=1，p2、2pq、q2分別為野生型、雜合型和變異型3種基因型的理論頻率，并由此推算出其理論頻數(shù)，并將理論數(shù)與觀察數(shù)進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。當(dāng)P>0.05時(shí)，認(rèn)為觀察所得的基因頻率符合Hardy-Weinberg定律，該基因多態(tài)性在人群中已達(dá)到遺傳平衡，具有群體代表性。對(duì)病例組和對(duì)照組研究對(duì)象的性別和年齡進(jìn)行χ2檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)，當(dāng)P>0.05時(shí)，該基因多態(tài)性在人群中已達(dá)到遺傳平衡，具有群體代表性。

2 結(jié)果

2.1酶切后VDR基因的電泳結(jié)果VDR基因的FokI位點(diǎn)酶切后產(chǎn)生3種情況：265 bp 1個(gè)條帶，以FF表示；196 、69 bp 2個(gè)條帶，以ff表示；265、196和69 bp 3個(gè)條帶，以Ff表示，見(jiàn)圖1。

VDR基因的ApaI位點(diǎn)酶切后產(chǎn)生3種情況：1 700 、300 bp的2個(gè)條帶，以AA表示；2 000、1 700和300 bp 3個(gè)條帶，以Aa表示；2 000 bp 1個(gè)條帶，以aa表示，見(jiàn)圖2。

VDR基因的TaqI位點(diǎn)酶切后產(chǎn)生3種情況：495、245 bp的2個(gè)條帶，以TT表示；495、290、245和205 bp的4個(gè)條帶，以Tt表示；290、245和205 bp的3個(gè)條帶，以tt表示，見(jiàn)圖3。

圖1 VDR基因FokI位點(diǎn)酶切后條帶分布

圖2 VDR基因ApaI位點(diǎn)酶切后條帶分布

圖3 VDR基因TaqI位點(diǎn)酶切后條帶分布

2.2VDR基因的基因型和等位基因的頻數(shù)分布

2.2.1 VDR基因型的Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn) 由Hardy-Weinberg定律可知，對(duì)VDR基因多態(tài)性中3個(gè)基因型觀察所得的基因頻率符合Hardy-Weinberg定律，該基因多態(tài)性在人群已達(dá)到遺傳平衡，具有群體代表性，見(jiàn)表1。

2.2.2 病例組與對(duì)照組VDR等位基因的分布 在病例組和對(duì)照組的VDR基因多態(tài)性中，F(xiàn)okI的等位基因差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.040；P<0.001)，攜帶f等位基因的人群患上尿路含鈣結(jié)石的危險(xiǎn)性是攜帶F等位基因的人群的2.208倍(OR：2.208，95%CI：1.480～3.295)。病例組和對(duì)照組ApaI的等位基因A/a和TaqI的等位基因T/t差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.350，P=0.552；χ2=2.930，P=0.093)，見(jiàn)表2。

2.2.3 病例組與對(duì)照組VDR基因型的分布 在病例組和對(duì)照組的VDR基因多態(tài)性中，F(xiàn)okI的基因型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.621，P<0.001)，攜帶Ff基因型和攜帶ff基因型的人群患上尿路含鈣結(jié)石的風(fēng)險(xiǎn)有明顯的增加(OR：1.084，95%CI：0.501～2.345；OR：4.259，95%CI：1.851～9.797)；病例組和對(duì)照組ApaI的基因型Aa、aa差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.287，P=0.592)，攜帶Aa基因型和攜帶aa基因型的人群無(wú)明顯差異(OR：0.966，95%CI：0.497～1.878；OR：0.826，95%CI：0.410～1.664)；病例組和對(duì)照組TaqI的基因型Tt、tt差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.483，P=0.115)，攜帶Tt基因型和攜帶tt基因型的人群患上尿路含鈣結(jié)石的風(fēng)險(xiǎn)無(wú)明顯增加(OR：0.568，95%CI：0.293～1.101；OR：0.547，95%CI：0.258～1.158)，見(jiàn)表3。

2.2.4 病例組與對(duì)照組不同性別VDR基因型的分布FokI的基因型在男性患上尿路含鈣結(jié)石患者中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.497，P=0.004)，F(xiàn)okI的基因型Ff和ff的男性患上尿路含鈣結(jié)石的風(fēng)險(xiǎn)較高(OR：0.984，95%CI：0.370～2.618；OR：4.846，95%CI：1.677～14.006)，F(xiàn)okI的基因型在女性患上尿路含鈣結(jié)石患者中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.230，P=0.072)；ApaI的基因型在男性和女性患上尿路含鈣結(jié)石患兒中差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.938，P=0.164；χ2=0.828，P=0.363)；TaqI的基因型在男性和女性患上尿路含鈣結(jié)石患兒中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.667，P=0.197；χ2=0.937，P=0.333)，見(jiàn)表4。

表1 VDR基因型的Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)

表2 病例組與對(duì)照組VDR等位基因的分布/例(%)

表3 病例組與對(duì)照組VDR基因型的分布/例(%)

表4 病例組與對(duì)照組不同性別VDR基因型的分布/例(%)

3 討論

尿路結(jié)石是泌尿外科常見(jiàn)的一種疾病，也是世界上發(fā)病率較高的疾病，其人群患病率為1%～5%。通過(guò)各種結(jié)石分析方法的應(yīng)用，人們發(fā)現(xiàn)在尿路結(jié)石中約有90%以上含有鈣的成分，病因?qū)W的研究充分證實(shí)了尿路結(jié)石形成過(guò)程中體內(nèi)鈣的代謝異常是含鈣結(jié)石的重要因素，因此影響體內(nèi)鈣的新陳代謝改變的因素都可能導(dǎo)致機(jī)體患結(jié)石病[4]。尋找正確的基因標(biāo)記物對(duì)于監(jiān)測(cè)和預(yù)防尿路結(jié)石有深遠(yuǎn)的影響。單核苷酸多態(tài)性(SNPs)作為繪制復(fù)雜疾病的工具的出現(xiàn)，使尋找引起結(jié)石疾病中鈣離子新陳代謝異常原因的候選基因成為可能。其中含鈣尿路結(jié)石的可能候選基因之一被認(rèn)為是維生素D受體(VDR)基因、降鈣素受體基因(CTR)和CaSR等，其中VDR基因?qū)}尿路結(jié)石形成的影響越來(lái)越引起學(xué)者們的關(guān)注[5]。

VDR是一組類(lèi)固醇受體家族，基因位于第12染色體上，大約全長(zhǎng)5.6 kb。其為介導(dǎo)活性1,25-二羥維生素-D3發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的核受體，而許多不同的細(xì)胞內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控著1,25-二羥維生素-D3的活性代謝產(chǎn)物?；钚?,25-二羥維生素-D3激素信號(hào)分子與靶細(xì)胞核內(nèi)的VDR結(jié)合形成激素受體復(fù)合物，后者再與靶基因特定的DNA序列結(jié)合，從而對(duì)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。維生素D在目標(biāo)細(xì)胞的效果被維生素D的活性代謝產(chǎn)物和它的細(xì)胞內(nèi)受體(VDR)的相互作用所調(diào)節(jié)。VDR在維持機(jī)體鈣磷代謝等方面起著重要作用。在VDR基因中有幾個(gè)基因多態(tài)性已被分離，它們?cè)诠δ苌厦黠@的或潛在的在疾病易感性的效果也已經(jīng)被查明[1]。

1999年Scott等[6]運(yùn)用特殊的微衛(wèi)星、核苷內(nèi)切酶FokI和Tru91等技術(shù)發(fā)現(xiàn)位于維生素-D受體(VDR)基因的12q12-14位點(diǎn)與結(jié)石的形成有明顯的關(guān)聯(lián)性，認(rèn)為VDR基因參與尿路結(jié)石的形成。有關(guān)研究通過(guò)對(duì)有遺傳性高尿鈣癥的大鼠分析發(fā)現(xiàn)大鼠體內(nèi)具有較高的VDR濃度水平與其結(jié)石的形成有密切關(guān)系[7]。2001年Chen等[8]報(bào)道在臺(tái)灣人群中VDRFokI基因多態(tài)性與草酸鈣尿路結(jié)石的形成有明顯的關(guān)聯(lián)性。Bid等[9]發(fā)現(xiàn)VDR中FokI基因多態(tài)性與草酸鈣腎結(jié)石有明顯聯(lián)系。Bid等[10]和Mittal等[11]對(duì)健康和患尿路結(jié)石的印度兒童進(jìn)行的研究結(jié)果顯示，病例組與對(duì)照組維生素D受體基因FokI位點(diǎn)多態(tài)性分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，認(rèn)為FokI基因多態(tài)性與印度兒童腎結(jié)石的形成有相關(guān)。但是Wang等[12]對(duì)464例漢族尿路結(jié)石患者及450例正常人群進(jìn)行維生素D受體基因多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)FokI基因多態(tài)性與含鈣尿路結(jié)石的形成不存在相關(guān)性。Relan等[13]也報(bào)道維生素D受體BsmI和FokI基因多態(tài)性與尿路結(jié)石沒(méi)有聯(lián)系。王勤章等[14]對(duì)新疆南部地區(qū)90例維吾爾族尿路結(jié)石患者基因多態(tài)性研究的結(jié)果顯示：對(duì)照組與病例組FokI酶切位點(diǎn)FF、Ff、ff 3種基因型頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，其中維生素D受體基因FokI位點(diǎn)多態(tài)性將來(lái)可能成為尿路結(jié)石檢測(cè)和篩選的一項(xiàng)指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)病例組與對(duì)照組FokI的等位基因差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，攜帶f等位基因的人群患上尿路含鈣結(jié)石的危險(xiǎn)性是攜帶F等位基因的人群的2.208倍(OR：2.208，95%CI：1.480～3.295)。說(shuō)明FokI的等位基因F是避免人群患上尿路含鈣結(jié)石的保護(hù)基因，而等位基因f是人群患上尿路含鈣結(jié)石的易感基因。還發(fā)現(xiàn)病例組與對(duì)照組FokI的基因型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，攜帶Ff基因型和攜帶ff基因型的人群患上尿路含鈣結(jié)石的風(fēng)險(xiǎn)有明顯的增加(OR：1.084，95%CI：0.501～2.345；OR：4.259，95%CI：1.851～9.797)。FokI的基因型在男性患上尿路含鈣結(jié)石患者中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004)，F(xiàn)okI的基因型Ff和ff的男性患上尿路含鈣結(jié)石的風(fēng)險(xiǎn)較高(OR：0.984，95%CI：0.370～2.618；OR：4.846，95%CI：1.677～14.006)，F(xiàn)okI的基因型在女性患上尿路含鈣結(jié)石患者中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.072)。說(shuō)明VDR的FokI基因多態(tài)性和維吾爾族小兒上尿路含鈣結(jié)石的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)可能存在相關(guān)性，F(xiàn)okI基因多態(tài)性在不同種族的含鈣尿路結(jié)石的形成中起著不同的作用，VDR的FokI基因可能作為篩選新疆維吾爾族小兒上尿路含鈣結(jié)石的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)候選基因。

在目前的研究中，對(duì)VDR基因中ApaⅠ基因多態(tài)性與含鈣尿路結(jié)石的形成是有爭(zhēng)議的。Wang等[12]研究結(jié)果顯示VDR基因中的ApaⅠ基因多態(tài)性與漢族含鈣尿路結(jié)石的形成有密切關(guān)系，攜帶ApaⅠ的A等位基因的人群患尿路結(jié)石的風(fēng)險(xiǎn)是對(duì)照組的1.4倍。但是Nishijima等[15]報(bào)道在日本人人群中病例組和對(duì)照組VDR基因的ApaⅠ基因型無(wú)明顯差異；病例組TaqⅠ的Tt和tt基因型的發(fā)生頻率明顯增高，并且TaqⅠ的t等位基因患含鈣尿路結(jié)石的風(fēng)險(xiǎn)是對(duì)照組的5.2倍。Jackman等[16]的研究提出對(duì)于家族性含鈣尿路結(jié)石的患者中有35% 表現(xiàn)為VDR基因中的TaqⅠTT基因型，并且攜帶TaqⅠTT基因型的患者在尿路結(jié)石發(fā)病和疾病進(jìn)展等方面具有遺傳性和結(jié)石復(fù)發(fā)高的特點(diǎn)。但是Gunes等[17]分別對(duì)110例結(jié)石患者和150例對(duì)照者通過(guò)PCR對(duì)基因多態(tài)區(qū)運(yùn)用電鏡放大分析了VDR基因中TaqⅠ、BsmⅠ和ApaⅠ基因多態(tài)性區(qū)域，計(jì)算基因型和等位基因與尿路結(jié)石、家族病史以及結(jié)石復(fù)發(fā)等的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)相鄰的限制性?xún)?nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性的單倍體結(jié)構(gòu)在尿路結(jié)石患者中過(guò)度表達(dá)。但是，雜合子和純合子攜帶者差異卻無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，僅發(fā)現(xiàn)基因多態(tài)性和家族性尿路結(jié)石病史有聯(lián)系。因此，他們認(rèn)為VDR基因中TaqⅠ、BsmⅠ和ApaⅠ基因多態(tài)性對(duì)尿路結(jié)石疾病的發(fā)生的危險(xiǎn)性無(wú)意義。本研究結(jié)果顯示，病例組和對(duì)照組ApaI的等位基因A/a和TaqI的等位基因T/t差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.552；P=0.093)，兩組ApaI的基因型Aa、aa差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.592)；兩組TaqI的基因型Tt、tt差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.115)，攜帶Tt基因型和攜帶tt基因型的人群患上尿路含鈣結(jié)石的風(fēng)險(xiǎn)沒(méi)有明顯增加(OR：0.568，95%CI：0.293～1.101；OR：0.547，95%CI：0.258～1.158)。ApaI的基因型在男性和女性患上尿路含鈣結(jié)石患者中均沒(méi)有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.164；P=0.363)；TaqI的基因型在男性和女性患上尿路含鈣結(jié)石患者中沒(méi)有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.197；P=0.333)。說(shuō)明維生素D受體(VDR)的TaqⅠ和ApaⅠ基因多態(tài)性和新疆維吾爾族小兒含鈣上尿路結(jié)石之間可能不存在相關(guān)性，不能作為新疆維吾爾族小兒含鈣尿路結(jié)石的篩選基因。這種維生素D受體(VDR)基因中等位基因多態(tài)性的表現(xiàn)頻率的不平衡可能與種族不同有關(guān)。

總之，通過(guò)對(duì)新疆南部地區(qū)維吾爾族小兒尿路結(jié)石與維生素D受體基因多態(tài)性的研究顯示：維生素D受體的FokI基因多態(tài)性與維吾爾族上尿路含鈣結(jié)石有相關(guān)性，F(xiàn)等位基因是尿路結(jié)石的保護(hù)基因，f基因型則是尿路結(jié)石的易感基因，而VDR的ApaI和TaqI基因多態(tài)性與含鈣尿路結(jié)石的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)可能不存在相關(guān)性。因此，維生素D受體的FokI基因多態(tài)性將來(lái)可能成為維吾爾族小兒上尿路含鈣結(jié)石檢測(cè)和篩選的指標(biāo)。

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