大鼠慢性牙周炎與IgA腎病復(fù)合模型腸系膜淋巴結(jié)中漿細(xì)胞的表達(dá)及其意義

李 靜， 地里木拉提·阿不都拉， 李團(tuán)結(jié)， 劉 健， 桑曉紅

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎病科， 烏魯木齊 830054)

IgA腎病是IgA或以IgA為主的免疫球蛋白彌漫沉積于腎小球系膜區(qū)毛細(xì)血管袢為主要特點(diǎn)的原發(fā)性腎小球腎炎。研究表明慢性牙周炎(chronic periodontitis，CP)促進(jìn)IgAN的病情進(jìn)展[1]，但其具體影響機(jī)制目前尚缺乏研究。腸系膜淋巴結(jié)是免疫應(yīng)答的重要部位，其漿細(xì)胞在慢性牙周炎癥狀態(tài)下是否表達(dá)增加，并促進(jìn)腎功能及免疫病理?yè)p傷是需要探討的問題。本研究通過(guò)建立大鼠IgAN合并CP模型，觀察評(píng)價(jià)組間的血肌酐、尿素氮、蛋白尿及腸系膜淋巴結(jié)的病理改變，以探討腸系膜淋巴結(jié)中漿細(xì)胞的表達(dá)變化及其在IgAN病情進(jìn)展中的意義。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組健康清潔級(jí)雄性SD大鼠40只[由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SOXK(新)2011-0001]，體質(zhì)量(200±20)g，飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物研究中心(AAALAC)，20℃恒溫、恒濕環(huán)境，自由攝食1 w。SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、CP組、IgAN組及復(fù)合組(IgAN+ CP)4組，每組10只。

1.2主要試劑與儀器脂多糖(LPS，美國(guó)Sigma公司)，牛血清白蛋白(BSA，美國(guó)MPBIO公司)，四氯化碳(CCl4，蘇州百與化工有限公司)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的兔抗鼠IgA抗體(美國(guó)Dako公司)。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromanus gingivalis, Pg)、伴放線放線桿菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans,Aa)由四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院口腔微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3造模方法IgAN組：參考張靜等[2]的IgAN造模方法，將BSA以蒸餾水配制成100 g/L濃度，劑量600 mg/kg體質(zhì)量，隔天灌胃，持續(xù)12 w；CCl4注射方式：皮下注射蓖麻油0.3 mL+CCl40.1 mL，每周1次，持續(xù)12 w，聯(lián)合LPS(第8 周LPS 0.05 mg尾靜脈注射)。 CP組：腹腔麻醉大鼠，充分暴露雙側(cè)上頜磨牙，牙根部用接種有Pg、Aa的混合菌株結(jié)扎線結(jié)扎，絲線盡量放入齦溝內(nèi)； 1 w涂1次，連續(xù)8次，絲線脫落，隨時(shí)結(jié)扎，重新涂抹細(xì)菌[3]。復(fù)合組建立IgAN+CP動(dòng)物模型：在建立IgAN大鼠模型的基礎(chǔ)上，于第4周開始建立CP動(dòng)物模型的操作。對(duì)照組：生理鹽水4 mL/kg體質(zhì)量灌胃，皮下注射生理鹽水0.4 mL，頻率同其他各組。

1.4檢測(cè)指標(biāo)觀察大鼠一般情況，每周稱體質(zhì)量，檢查絲線情況，若脫落重新結(jié)扎。每日觀察大鼠飲食、精神活動(dòng)狀態(tài)。處死前動(dòng)物禁食12 h，放代謝籠收集24 h尿液，檢測(cè)24 h尿蛋白定量；腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心10 min,分離上清液，檢測(cè)血肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)。余血液離心取上清液,分裝離心管中,密封遮光, -70℃保存待用。腸系膜淋巴結(jié)組織10%中性甲醛固定24 h后常規(guī)脫水透明，石蠟包埋，常規(guī)HE染色。部分腎組織于10%中性甲醛固定24 h后常規(guī)脫水透明，石蠟包埋，切片片厚2 μm，常規(guī)PAS染色。其余腎組織標(biāo)本加少許OCT包埋劑，切片片厚4～5 μm，室溫干燥，冷丙酮固定，洗片，直接免疫熒光法測(cè)腎小球IgA沉積強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠的一般情況對(duì)照組大鼠精神活躍，皮毛光潔。其他各組大鼠在尾靜脈注射LPS后，大鼠精神狀態(tài)萎靡，毛色變黃、蓬松散亂，體質(zhì)量不增或減輕，5 d左右癥狀緩解。

2.2各組大鼠24h尿蛋白定量、Scr、BUN水平比較CP組與對(duì)照組比較，24 h尿蛋白定量、Scr、BUN差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。IgAN組、復(fù)合組各項(xiàng)指標(biāo)均高于對(duì)照組、CP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。復(fù)合組24 h尿蛋白定量、Scr 、BUN均高于IgAN組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 各組大鼠24 h尿蛋白定量及腎功能水平

注：與正常對(duì)照組比較，★P<0.05；與CP組比較，▲P<0.05；與IgAN組比較，△P<0.05。

2.3各組大鼠腎組織病理學(xué)改變對(duì)照組腎小球系膜無(wú)增生，無(wú)新月體，腎小管無(wú)萎縮，腎間質(zhì)無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1a)。與對(duì)照組比較，IgAN組均出現(xiàn)不同程度腎小球局灶系膜增殖，偶可見球囊粘連、局灶纖維化和炎細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1b)；復(fù)合組較IgAN組大鼠病變明顯加重，腎小球內(nèi)基底膜增厚、粘連嚴(yán)重，腎小球局灶階段性硬化，偶見新月體形成，腎間質(zhì)纖維化較重，腎小管上皮細(xì)胞萎縮，管腔擴(kuò)張，炎細(xì)胞局灶性或彌散浸潤(rùn)(圖1c)；腎組織免疫熒光病理：對(duì)照組未見IgA沉積(圖1d)，IgAN組腎小球系膜區(qū)可見IgA團(tuán)塊狀沉積，熒光強(qiáng)度為(+++)(圖1e)，復(fù)合組腎小球系膜區(qū)可見IgA團(tuán)塊狀沉積，熒光強(qiáng)度為(++++)(圖1f)。

2.5各組大鼠腸系膜淋巴結(jié)的病理學(xué)改變與對(duì)照組相比，IgAN組光鏡下可見被膜下竇內(nèi)散在漿細(xì)胞，復(fù)合組中可見較多漿細(xì)胞產(chǎn)生，見圖2。

b: IgAN組(PAS×200)

c: 復(fù)合組(PAS×200)

d: 對(duì)照組(×200)

e: IgAN組(×200)

f: 復(fù)合組(×200)

a:對(duì)照組(HE×100)

b: IgAN組(HE×200)

c: 復(fù)合組(HE×200)

3 討論

Itoh等[4]報(bào)道35%～40%的IgAN患者有上呼吸道感染，尤其是常伴有扁桃體炎的患者。IgAN是一種黏膜免疫異常的疾病，CP可以增加全身的炎癥負(fù)荷[5]?；佳乐苎椎膫€(gè)體有慢性、反復(fù)發(fā)作的低水平菌血癥[6-7]，由于牙周致病菌長(zhǎng)期存在并產(chǎn)生致炎物質(zhì)，進(jìn)而損傷口腔黏膜，也與黏膜免疫有關(guān)。王左敏等[8]研究表明，牙周炎患者其血清IgA、IgG較正常人高。腸系膜亦屬于黏膜免疫的范疇，是否是通過(guò)黏膜免疫系統(tǒng)相互影響，目前還缺少研究證據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)建立CP+IgAN復(fù)合模型及對(duì)照模型，在復(fù)合組中可以見到大鼠上頜磨牙牙周炎改變，同時(shí)IgAN組及復(fù)合組均出現(xiàn)蛋白尿、肉眼血尿，腎組織出現(xiàn)系膜增生、腎小球IgA熒光沉積等病理學(xué)改變，結(jié)果說(shuō)明SD大鼠成功建立牙周炎及IgAN模型。

本研究結(jié)果顯示，復(fù)合組大鼠24 h尿蛋白定量、Scr、BUN、腎臟病理改變均較IgAN組嚴(yán)重，提示慢性牙周炎可能加重IgAN的腎臟功能的進(jìn)展。而復(fù)合組中的腸系膜淋巴結(jié)中漿細(xì)胞顯著多于IgAN組和CP組，提示漿細(xì)胞可能是兩者之間相互影響的一個(gè)重要因素。

漿細(xì)胞是抗原應(yīng)答B(yǎng)細(xì)胞的成熟細(xì)胞，免疫球蛋白主要是由脾臟、淋巴結(jié)和淋巴組織內(nèi)的漿細(xì)胞產(chǎn)生的, 腸系膜淋巴結(jié)為黏膜免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)部位[9]。有研究表明血清異常升高的 IgA 并非由黏膜產(chǎn)生，而是由黏膜內(nèi)抗原特定的淋巴細(xì)胞或抗原遞呈細(xì)胞進(jìn)入骨髓腔，引起骨髓 B 細(xì)胞分泌 IgA 增加[10]。最后沉積于腎小球系膜區(qū)，產(chǎn)生一系列腎臟臨床及病理改變。本研究表明復(fù)合組中腸系膜淋巴結(jié)中漿細(xì)胞明顯增加，說(shuō)明牙周炎時(shí)體內(nèi)慢性感染狀態(tài)可能刺激腸系膜淋巴結(jié)內(nèi)漿細(xì)胞增生，并且通過(guò)黏膜免疫應(yīng)答導(dǎo)致IgA分泌增多且沉積于腎臟，從而促進(jìn)IgA腎病的發(fā)生及進(jìn)展，但I(xiàn)gA腎病發(fā)病及進(jìn)展因素比較復(fù)雜，具體機(jī)制及影響途徑可能有多種因素影響，需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究與探討。

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