2種方法制備靶向超聲微泡對(duì)卵巢腫瘤新生血管評(píng)價(jià)的意義

楊欽涵， 羅 慧， 向 紅

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)超聲診斷科， 烏魯木齊 830054)

靶向超聲造影技術(shù)是目前世界范圍內(nèi)的前沿性課題，隨著超聲造影技術(shù)的不斷革新，臨床診療與超聲影像學(xué)逐漸接軌并取得了跨越式發(fā)展。靶向微泡構(gòu)建的核心技術(shù)是如何配體連接到微泡表面，其連接效果會(huì)直接影響靶向微泡的穩(wěn)定性。常用的微泡連接方法有直接(共價(jià))連接法或間接連接法中的生物素-親和素橋連接法[1]。隨著第三代靶向超聲造影劑的興起，婦科超聲用其診斷卵巢惡性腫瘤亦步入實(shí)驗(yàn)探索階段。卵巢癌起病隱匿，其發(fā)生、發(fā)展依賴瘤體內(nèi)新生血管的形成。在腫瘤新生血管內(nèi)皮表面,血管內(nèi)皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor2, VEGFR2)大量表達(dá)。因靶向超聲微泡(MBt)表面可與配體特異性地結(jié)合并聚集于感興趣區(qū)，提高病變檢出率且增強(qiáng)組織顯影，所以本研究將VEGFR2作為靶向超聲特異性分子，采用直接連接法和生物素-親和素橋連接法分別制備攜VEGFR2單抗的MBt，通過對(duì)比裸鼠卵巢癌移植瘤的造影成像特點(diǎn)，評(píng)價(jià)2種制備MBt 方法的優(yōu)缺點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物裸小鼠(SPF級(jí))18只，雌性，品系：BALB/c-Nude，6～8周齡，體質(zhì)量18～20 g，由北京維通利華生物科技有限公司提供。

1.2主要實(shí)驗(yàn)材料與儀器SonoVue(意大利博萊科公司)，磷酸緩沖液PBS(美國Gibco公司)，生物素化大鼠抗小鼠VEGFR2單克隆抗體(美國ebioscience公司)，鏈霉親和素(美國Sigma公司)，生物素化脂質(zhì) DSPE-PEG(2000)Biotin(美國Invitrogen公司)，人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3(購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院)，1640完全培養(yǎng)液、胎牛血清(美國Gibco公司)，兔抗多克隆抗體(美國Invitrogen公司)，F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗大鼠IgG(北京中杉金橋)，山羊抗兔IgG(北京中杉金橋),DAB顯色液(北京中衫金橋)，二氧化碳培養(yǎng)箱，百勝M(fèi)yLab90彩色超聲儀(探頭型號(hào)LA522、3～9MHz)，低溫離心機(jī)，恒溫水平搖床，光學(xué)顯微鏡，熒光顯微鏡。

1.3人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3細(xì)胞，生長方式為貼壁生長。采用含10%胎牛血清、100 μg/mL的青霉素和鏈霉素的1640完全培養(yǎng)液，在37℃的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.4建立裸小鼠皮下移植瘤模型[2]將卵巢癌SKOV3細(xì)胞株傳代培養(yǎng)至7～8代時(shí)提取細(xì)胞，將細(xì)胞經(jīng)0.125%胰蛋白酶消化后，用胎牛血清1640培養(yǎng)液漂浮洗滌，使活細(xì)胞濃度調(diào)至5×107個(gè)/mL，充分混勻，在每只裸鼠背部皮下接種0.2 mL，次日接種記為為第1天，每只接種1點(diǎn)，待所有荷瘤鼠腫瘤長徑>1 cm時(shí)行超聲造影檢查。

1.5制備攜VEGFR2單抗靶向超聲微泡普通造影劑選用SonoVue，為磷脂穩(wěn)定的六氟化硫微泡造影劑。(1)直接連接法制備MBt: 取1支SonoVue，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)2 mL,30 s勻速震蕩混勻。按照1∶100加入生物素化大鼠抗小鼠VEGFR2單克隆抗體，充分混勻(室溫環(huán)境)，調(diào)其混懸液的pH值至4.5，4℃下靜置2 h，自然分層后取上浮液，PBS反復(fù)漂浮洗滌3次，即得到攜VEGFR2單抗的靶向微泡，于4℃環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?(2)生物素-親和素橋連接法制備MBt: 取1支SonoVue，加入磷酸鹽緩沖液1 mL,30 s勻速震蕩混勻。生物素化脂質(zhì)按照150 μg/mL 的濃度加入，4℃恒溫輕搖反應(yīng)1 h，4℃下離心1 min(500 r/min)后靜置15 min，使離心管內(nèi)的乳白色微泡混懸液分層，下層澄清液體用注射器緩慢抽去，保留乳白色微泡層，漂浮洗滌2次，即得到生物素化修飾的微泡。與特異性抗體的連接[3]:向每1×107個(gè)微泡加人鏈霉親和素3 μg，充分混勻后，在4℃下避光靜置30 min，棄下清液，微泡漂浮洗滌2次。按照1∶100的濃度加入生物素標(biāo)記的特異性抗體，充分混勻后，在4℃下靜置30 min，棄下清液，漂浮洗滌微泡2次，即得到攜VEGFR2單抗的靶向微泡，于4℃環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6免疫熒光法檢測(cè)MBt分別取2種方法制備的MBt1 mL，按照1∶100濃度，在避光環(huán)境下，加入FITC標(biāo)記山羊抗大鼠IgG，充分混勻后，靜置30 min，4℃下離心1 min(500 r/min)，棄下清液。漂浮洗滌微泡2次。棄下清液以除去游離二抗，將微泡涂片，于熒光顯微鏡下觀察熒光情況。

1.7超聲造影檢查無菌條件下，麻醉動(dòng)物，使用百勝M(fèi)y Lab90彩色超聲儀。裸鼠取俯臥位，涂抹適量耦合劑于裸鼠背部皮膚腫瘤突起處。超聲造影前先行二維及彩色多普勒模式，記錄腫瘤大小、形態(tài)、內(nèi)部回聲，保存靜態(tài)圖像。選擇最大切面轉(zhuǎn)入對(duì)比脈沖序列(contrast pulse sequence，CPS)造影模式。保持探頭機(jī)械指數(shù)0.08，發(fā)射頻率為4 MHz，記錄幀頻8 Hz。將18只裸鼠隨機(jī)分為兩組，先分別隨機(jī)注射2種方法制備的MBt，對(duì)2種方法制備的MBt進(jìn)行比較。間隔60 min之后，再將18只裸鼠注射MBc，對(duì)各組內(nèi)MBt與MBc進(jìn)行比較。分別觀察2種制備方法的MBt及各組內(nèi)MBt與MBc的裸鼠卵巢癌移植瘤新生血管的造影特征。每只裸鼠分別經(jīng)尾靜脈注射 0.2 mL的微泡混懸液，微泡數(shù)為5×106個(gè)。詳細(xì)做好實(shí)驗(yàn)記錄，保存全程動(dòng)態(tài)影像。通過Qontrast超聲造影軟件分析造影檢查時(shí)間強(qiáng)度曲線的相關(guān)參數(shù)：即持續(xù)時(shí)間、峰值強(qiáng)度(peak intensity,PI)。

1.8病理學(xué)檢查造影結(jié)束即刻處死裸鼠，取出瘤體經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定，免疫組化法檢測(cè)腫瘤組織內(nèi)VEGFR2表達(dá)，結(jié)果判定則以腫瘤組織血管內(nèi)皮有大量條索狀棕黃色為陽性。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，因計(jì)量資料不符合正態(tài)分布，故以中位數(shù)M(P25，P75)表示，TIC參數(shù)間比較采用兩組計(jì)量資料的秩和檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1SKOV3腫瘤細(xì)胞裸鼠模型情況SKOV3細(xì)胞株接種3 w，18只裸鼠背臀部均長出直徑>1 cm的實(shí)性腫塊，表面光滑，均無破潰出血(圖1)，兩組裸鼠移植瘤體積分別為(0.35±0.04)、(0.38±0.04) cm3。

2.2免疫熒光法檢測(cè)2種方法制備的MBt在熒光顯微鏡下，2種方法制備攜VEGFR2單抗的MBt分別與FITC標(biāo)記山羊抗大鼠IgG孵育后，微泡表面發(fā)出綠色熒光，說明FITC標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG與靶向微泡表面連接的抗體特異性結(jié)合(圖2、3)。

圖1裸鼠接種SKOV3細(xì)胞株3w，背臀部長出實(shí)性腫塊圖2直接連接法熒光顯微鏡下的MBt(×200)圖3生物素-親和素橋連接法熒光顯微鏡下的MBt(×200)

2.3腫瘤超聲圖像分析及造影結(jié)果將MBt與MBc經(jīng)尾靜脈注入裸鼠體內(nèi)均可見瘤體中的新生血管，從瘤體較深面向表面形成分支，造影劑均從瘤體周邊向中央快速充盈，至瘤體全面強(qiáng)化(圖4)。生物素-親和素橋連接法制備的MBt較直接連接法制備的MBt持續(xù)顯像時(shí)間更長(P<0.05)，峰值強(qiáng)度更高(P<0.05)；各組內(nèi)MBt與MBc之間TIC曲線分析比較，兩組組內(nèi)MBt均較MBc造影劑持續(xù)顯像時(shí)間更長(P<0.05)，峰值強(qiáng)度更高(P<0.05)(表1)。

2.5病理結(jié)果腫瘤組織經(jīng)HE染色證實(shí)為卵巢癌，免疫組織化學(xué)顯示：腫瘤新生血管內(nèi)皮見大量棕黃色VEGFR2陽性表達(dá)(圖5)。

表1 2種方法MBt與MBc組內(nèi)造影TIC定量參數(shù)的比較 [M(P25，P75)]

注：與直接連接法組比較，*P<0.05。

圖4 造影劑充盈瘤體并全面強(qiáng)化

圖5 免疫組織化學(xué)：腫瘤血管內(nèi)皮VEGFR2(棕黃色顆粒)陽性表達(dá)(×400)

3 討論

本研究以第二代超聲造影劑聲諾維(SonoVue)作為微泡的構(gòu)建基礎(chǔ)并采用直接連接法和生物素-親和素橋連接法制備MBt。本研究發(fā)現(xiàn)，生物素-親和素橋連接法制備的MBt較直接連接法制備的MBt峰值強(qiáng)度高，造影檢查持續(xù)顯像時(shí)間更長，這一點(diǎn)證實(shí)了生物素-親和素橋連接法令靶向微泡的超聲造影顯像效果更好。直接連接法因不添加任何化學(xué)成分，通過自身的靜電吸附作用直接將靶向配體連接于微泡上，故此法微泡與配體結(jié)合程度低，電荷吸附不牢固，且在體內(nèi)隨血液循環(huán)易于脫落。而生物素-親和素橋連接法制備MBt的成膜材料即生物素化脂質(zhì)DSPE-PEG(2000)Biotin，它不但將生物素化基團(tuán)引入到微泡表面，且本身的聚乙二醇長臂使生物素基團(tuán)與微泡表面錨點(diǎn)的距離增大，使配體靈活運(yùn)動(dòng)，靶向基團(tuán)可有效地連接在微泡表面[4]。另一重要成分是鏈親和素，它與生物素結(jié)合力極強(qiáng)，能夠?qū)⑷魏畏N類的生物素化配體連接到微泡表面，且酸、堿、變性劑均不影響其結(jié)合，尤其適合生物醫(yī)學(xué)各方向的研究[5]。MBt制備中發(fā)現(xiàn)，其穩(wěn)定性極其易受離心力、溫度及試劑劑量比例等因素的影響，所以要嚴(yán)格控制好每一步操作，并且靶向微泡制備完成應(yīng)盡快使用，避免長久擱置。近幾年，隨著靶向超聲微泡進(jìn)一步研究，新型靶向微泡也制備成功，Warram等[6]制備出多配體MBt，且發(fā)現(xiàn)多配體微泡與細(xì)胞黏附數(shù)量明顯多于單配體、雙配體，在腫瘤顯像效果方面明顯優(yōu)于單配體和雙配體。

本研究發(fā)現(xiàn)各組內(nèi)MBt較MBc微泡持續(xù)顯像時(shí)間更長且峰值強(qiáng)度更高。這是與靶向超聲微泡其表面連接有與腫瘤新生血管表面大量表達(dá)的特異性血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)有關(guān)，它是在腫瘤早期形成的特異性生長因子，能促使腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[7]。Fujimoto等[8]發(fā)現(xiàn)，VEGF在卵巢惡性腫瘤中異常高表達(dá)。Anderson等[9]將攜有VEGFR2單克隆抗體的MBt注入荷瘤小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)腫瘤新生血管區(qū)域圖像分辨力顯著提高。在普通超聲微泡表面未結(jié)合特異性抗體，缺乏對(duì)靶組織特異性親和力，故不能夠在靶組織停留較長時(shí)間。而靶向微泡表面結(jié)合有VEGFR2單克隆抗體，所以能與卵巢腫瘤組織血管內(nèi)皮上高度表達(dá)VEGFR2的特異性靶點(diǎn)相結(jié)合。Linder等[10]經(jīng)活體顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在微血管內(nèi)皮上，靶向超聲微泡緊密黏附其上，不易經(jīng)循環(huán)代謝清除。由于靶向微泡可較長時(shí)間駐留于靶組織，因此在腫瘤內(nèi)部血管觀察、靶向傳送抗癌及抗血栓藥物等方面均有效果。Lin等[11]報(bào)道靶向微泡可以攜帶藥物，將抗癌藥物直接運(yùn)送至腫瘤新生血管內(nèi)的癌細(xì)胞，這樣可以在早期控制腫瘤生長。本實(shí)驗(yàn)免疫組織化學(xué)結(jié)果驗(yàn)證了攜帶VEGFR2單抗的靶向微泡直接與腫瘤組織血管內(nèi)皮特異性結(jié)合。

綜上，本研究通過使用2種方法成功地制備攜VEGFR2單抗的靶向微泡，在卵巢癌移植瘤超聲造影顯像及微泡穩(wěn)定性方面，生物素-親和素橋連接法制備的靶向微泡效果更優(yōu)于直接連接法，也證明MBt較MBc的超聲造影顯像效果更好，為無創(chuàng)性評(píng)價(jià)腫瘤新生血管開創(chuàng)了新的思路。隨著MBt研究不斷發(fā)展，必將會(huì)研制出穩(wěn)定性、靶向性更好造影劑，為臨床診療帶來新希望。

參考文獻(xiàn)：

[1] 肖云彬，賓建國，賓建平. 靶向超聲造影劑的修飾與生物連接技術(shù)[J]. 中華超聲影像學(xué)雜志, 2010, 19(4):359-361.

[2] 李蓉，周琦，王志剛，等. 超聲定位輻照載藥微泡抑制卵巢癌裸鼠皮下移植瘤增殖的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 2(2):220-223.

[3] 王朝清，馬方，劉波. 超聲微泡連接特異性抗體的制備方法及靶向化處理因素對(duì)超聲微泡物理性質(zhì)的影響[J]. 中國醫(yī)學(xué)影像技術(shù), 2012, 28(4):617-620.

[4] Klibanov AL. Preparation of targeted microbubbles:ultrasound contrast agents for molecular imaging[J]. Med Biol Eng Comput, 2009, 47(8):875-882.

[5] 鄭元義，張茂惠，彭劍萍，等. 計(jì)算機(jī)圖像識(shí)別技術(shù)在超聲微泡粒徑分析中的應(yīng)用[J]. 中國超聲醫(yī)學(xué)雜志, 2007, 23(10):727-729.

[6] Warram JM,Sorace AG,Saini R,et al.A triple-targeted ultrasound contrast agent provides improved localization to tumor vasculature[J]. J Ultrasound Med,2011,30(7):921-931.

[7] Rastelli L, Valentino ML, Minderman MC, et al. A KDR-binding peptide (ST100,059) can block angiogenesis, melanoma tumor growth and metastasis in vitro and in vivo[J]. Int J Oncol, 2011, 39(2):401-408.

[8] Fujimoto J, Sakaguchi H, Aoki I, et al. Clinical implications of expression of vascular endothelial growth factor in metastatic lesions of ovarian cancers[J]. Cancer, 2001, 85(3):313-316.

[9] Anderson CR, Hu X, Zhang H, et al. Ultrasound molecular imaging of tumor angiogenesis with an integrin targeted microbubble contrast agent[J]. Invest Radiol, 2011, 46(4):215-224.

[10] Lindner JR, Song J, Christiansen J, et al. Ultrasound assessment of inflammation and renal tissue injury with microbubbles targeted to P-selectin[J]. Circulation, 2001, 104(17):2107-2112.

[11] Lin CY, Tseng HC, Shiu HR, et al. Ultrasound sonication with microbubbles disrupts blood vessels and enhances tumor treatments of anticancer nanodrug[J]. Int J Nanomedicine, 2012, 7:2143-2152.