鼠疫耶爾森氏菌YopD抗原基因在大腸桿菌中的克隆表達(dá)

郭 榮， 申小娜， 李 博， 陳 艷， 張渝疆

(1新疆醫(yī)科大學(xué)， 烏魯木齊 830011； 2新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心， 烏魯木齊 830002； 3中國(guó)疾病預(yù)防控制中心， 北京 102206)

鼠疫(Plague)是一種由鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis,簡(jiǎn)稱鼠疫菌)引起的一種自然疫源性疾病,是一種古老但至今為止仍嚴(yán)重威脅人類健康的烈性傳染病。20世紀(jì)80年代之后，在全球范圍內(nèi)鼠疫疫情呈明顯上升趨勢(shì)[1]。鼠疫免疫學(xué)診斷是鼠疫防治工作中的重要環(huán)節(jié),是快速、敏感診斷鼠疫的方法之一。近年來(lái)，由于DNA疫苗能夠誘導(dǎo)出較好的體液免疫和細(xì)胞免疫而日益受到重視[2]。YopD是耶爾森氏菌屬特異蛋白，是由70 kb的毒力質(zhì)粒-pCD1編碼的，該編碼質(zhì)粒保守且對(duì)耶爾森氏菌毒力的發(fā)揮起到重要作用。YopD具有調(diào)節(jié)或轉(zhuǎn)運(yùn) Yops定位攻擊靶細(xì)胞的功能[3-4]。正是由于上述外膜蛋白的作用，使巨噬細(xì)胞不能有效吞噬病原體從而造成耶爾森氏菌僅在感染早期維持細(xì)胞內(nèi)寄生，而在以后階段主要是在細(xì)胞外存活和繁殖的現(xiàn)象。另有研究發(fā)現(xiàn)，重組的 YopD 抗原免疫小鼠能抵抗鼠疫耶爾森氏菌 C12 株(無(wú)莢膜) 的攻擊(但不能抵抗同等劑量的有莢膜鼠疫耶爾森氏菌的攻擊)[5]。有關(guān)研究認(rèn)為，YopD可作為潛在的診斷靶點(diǎn)[6]。本研究選取鼠疫菌重要功能蛋白YopD進(jìn)行克隆表達(dá)，為鼠疫潛在診斷靶點(diǎn)及新型疫苗的選擇奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1菌株與載體質(zhì)粒以云南玉龍鼠疫菌株(D106004)DNA為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-PCR的模板(由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所鼠疫室提供)，表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)和感受態(tài)菌株E.coliBL21(DE3)分別購(gòu)自Novagen和TaKaRa公司。

1.2主要試劑及儀器Taq DNA聚合酶購(gòu)自上海生工生物工程公司，dNTP 購(gòu)自TaKaRa BIOTECH公司，蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自BIO-RAD公司，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自TransGen公司，質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根生工生物工程公司，PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司，Easy PAGE Kit 購(gòu)自Genstar公司，限制性內(nèi)切酶(BamHI、XhoI)均購(gòu)自Biolabs公司，T4 DNA Ligase 購(gòu)自Promega公司，IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)購(gòu)自Bio Basic INC。PCR 基因擴(kuò)增儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、核酸蛋白測(cè)定儀及垂直電泳儀均為Bio-Rad 公司產(chǎn)品，空氣震蕩培養(yǎng)箱為Forma Scientific 公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1 鼠疫相關(guān)蛋白的選取 通過(guò)查閱文獻(xiàn)及基因比對(duì)的方法，選取鼠疫重要功能蛋白進(jìn)行克隆表達(dá)，蛋白YopD長(zhǎng)度921 bp,分子量52.8 ku，是耶爾森氏菌屬特異蛋白。

1.3.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

1.3.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI公布的鼠疫菌D106004菌株的相應(yīng)基因序列進(jìn)行設(shè)計(jì)(表1)，利用Primer5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 擴(kuò)增所選蛋白編碼基因序列的引物

1.3.2.2 PCR擴(kuò)增 以鼠疫菌D106004菌株DNA為模板及相應(yīng)引物擴(kuò)增目的基因，PCR擴(kuò)增體系25 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃ 預(yù)變性5 min；94℃ 變性40 s，60℃ 退火40 s，72℃ 延伸1 min(35個(gè)循環(huán))；72℃ 延伸5 min。產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)或置4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.3 PCR產(chǎn)物電泳鑒定及純化 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),電泳條件為120 V，30 min，凝膠成像儀檢測(cè)拍照。將上述產(chǎn)物用 DNA 純化回收試劑盒純化回收，按操作手冊(cè)進(jìn)行，用 Nano Drop ND-1000 Spectrophotometer 檢測(cè)濃度。

1.3.2.4 質(zhì)粒的提取 將購(gòu)買的PET-32a(+)用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)中，挑取菌落于20 mL含氨芐抗生素(100 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，置搖床37℃培養(yǎng)至OD值約為2.0后，用小量質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒備用，操作方法按說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察提取產(chǎn)物。

1.3.2.5 目的基因與質(zhì)粒的雙酶切、連接反應(yīng) 將PCR 純化產(chǎn)物與載體質(zhì)粒PET-32a(+)分別進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物置于37℃過(guò)夜。隨后用DNA純化試劑盒純化，將純化后的目的基因和酶切載體質(zhì)粒進(jìn)行連接，酶切和連接參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的方法進(jìn)行。

1.3.2.6 轉(zhuǎn)化 采用化學(xué)轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21(DE3)中，轉(zhuǎn)化的細(xì)菌在Amp100 μg/mL的LB培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選。

1.3.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將陽(yáng)性的克隆子接種在5 mL含Amp 100 μg/mL的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220 r/mim，培養(yǎng)3～4 h至OD值為0.3～0.4時(shí)，取1 mL菌液作為誘導(dǎo)對(duì)照，向剩余菌液中加誘導(dǎo)劑IPTG(終濃度為1 mmol/L),37℃、160 r/min，誘導(dǎo)4 h。

1.3.4 電泳分析 將誘導(dǎo)及未誘導(dǎo)菌液均進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝(SDS-PAGE)電泳(12%分離膠，5%積層膠)。 恒壓電泳，積層膠用80 V，30 min，1%考馬斯亮藍(lán)R250染色，于脫色液中脫色，直至背景無(wú)色，將凝膠放于成像儀下進(jìn)行成像分析。

2 結(jié)果

2.1目的基因的擴(kuò)增產(chǎn)物目的基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖如圖1所示，結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度與理論片段相符。

1: Marker; 2: YopD; 3: Blank圖1 目的基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒的雙酶切切出了2個(gè)片段，其中較大片段為載體片段，較小片段即目的基因片段，通過(guò)分子量比對(duì)，切出的目的片段大小與實(shí)際基因的大小一致，說(shuō)明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖2)。

1: Marker; 2: YopD+pET-32a(+)圖2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定圖

2.3重組質(zhì)粒的序列分析鑒定采用T7通用引物進(jìn)行測(cè)序，由北京生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成，以pET-YopD為例，測(cè)序結(jié)果如圖3所示。

2.4重組鼠疫相關(guān)蛋白誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果顯示，重組鼠疫相關(guān)蛋白有較好的表達(dá)，與rYopD的理論分子量52.8 ku一致(圖4)。

圖3 重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果圖

1: Marker; 2: rYopD圖4 重組鼠疫相關(guān)蛋白誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果

3 討論

鼠疫診斷是鼠疫預(yù)防控制中的重要內(nèi)容和關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是發(fā)現(xiàn)鼠疫、證實(shí)鼠疫的重要手段，是治療鼠疫及防控鼠疫的主要依據(jù)。鼠疫檢測(cè)的準(zhǔn)確性與及時(shí)性關(guān)系到鼠疫防治工作的總體水平與成效。對(duì)于鼠疫而言，任何的誤診與漏診都可能帶來(lái)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生事件。長(zhǎng)期以來(lái)，我國(guó)鼠疫的免疫診斷是以天然F1為基礎(chǔ)的，當(dāng)然這些診斷方法在我國(guó)的鼠疫檢測(cè)中發(fā)揮了重要作用，但由于提取高純度的天然F1抗原比較困難，且在沒(méi)有參比診斷方法的情況下，其可信度將會(huì)受到質(zhì)疑，因此尋找鼠疫新的診斷靶點(diǎn)和發(fā)展新的診斷技術(shù)對(duì)于鼠疫這樣一種甲類傳染病是極為重要的。

現(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)的鼠疫桿菌中主要抗原成分或毒力因子除 F1(莢膜抗原)外，還有 Lcr(低鈣反應(yīng)蛋白,包括LcrG、LcrV、LcrH等)、 Yops(耶爾森氏菌外膜蛋白)、 Pgm(色素沉著) 和Pst 1(鼠疫菌素)等，這些毒力因子的編碼基因主要位于細(xì)菌質(zhì)粒上[7-9]。

本研究通過(guò)查看文獻(xiàn)及基因比對(duì)，選取了鼠疫重要功能蛋白——YopD，采用基因工程的技術(shù)手段進(jìn)行克隆表達(dá)，其是由70 kb的毒力質(zhì)粒(pCD1)編碼的，是耶爾森氏菌屬特異蛋白。本實(shí)驗(yàn)使用原核表達(dá)系統(tǒng)pET-32a(+)作為表達(dá)質(zhì)粒的載體，經(jīng)過(guò)反復(fù)摸索誘導(dǎo)條件，該載體可以使重組蛋白在基因工程菌中得到穩(wěn)定高效的表達(dá),為鼠疫潛在診斷靶點(diǎn)及新型疫苗的選擇奠定了基礎(chǔ),這也將是今后研究工作的重點(diǎn)。

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