GC-MS法測(cè)定豬肉樣品中鹽酸克倫特羅殘留

李鶯，王毅紅，王亮，李嬋君

（鄭州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)流通中心，鄭州 450006）

GC-MS法測(cè)定豬肉樣品中鹽酸克倫特羅殘留

李鶯，王毅紅，王亮，李嬋君

（鄭州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)流通中心，鄭州 450006）

建立了乙酸乙酯提取、SCX小柱凈化、GC-MS分析、外標(biāo)法定量的豬肉樣品中鹽酸克倫特羅殘留的檢測(cè)方法。鹽酸克倫特羅在10.24～512.0 ng／mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r=0.999 7。在1.92，5.12，12.80 μg／kg添加水平下的回收率為73.0%～84.8%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.3%～8.2%（n=6）。2日間3濃度點(diǎn)的日間平均回收率在77.1%～81.2%之間，相對(duì)偏差在1.3%～5.3%之間。該方法簡(jiǎn)便、快速，精密度和準(zhǔn)確度較好，能滿足日常大批量豬肉樣品中鹽酸克倫特羅殘留的檢測(cè)要求。

氣相色譜-質(zhì)譜法；鹽酸克倫特羅；豬肉樣品；方法比較

瘦肉精不是飼料，也不屬于飼料添加劑，而是一類叫做β-興奮劑的藥物。在豬的養(yǎng)殖中大劑量使用瘦肉精能顯著提高豬肉瘦肉率。瘦肉精經(jīng)食物鏈被人食用后人體會(huì)受到損害，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引發(fā)中毒。這種藥物的濫用問題至今依然是全社會(huì)普遍關(guān)注的食品安全熱點(diǎn)之一。

近年β-興奮劑藥物鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺的檢測(cè)均有報(bào)道［1-3］。萊克多巴胺屬于苯酚型結(jié)構(gòu)，在豬體內(nèi)與葡萄糖甘酸結(jié)合，檢測(cè)中需在提取前后用酶水解約12～16 h［4～5］。而克倫特羅屬于苯胺型結(jié)構(gòu)，在豬體內(nèi)以游離態(tài)存在，水解前后結(jié)構(gòu)無明顯區(qū)別［6］。若要實(shí)現(xiàn)克倫特羅與萊克多巴胺的同時(shí)檢測(cè)，需用較長時(shí)間進(jìn)行水解，會(huì)增加前處理的時(shí)間。另外萊克多巴胺毒性低，在體內(nèi)代謝快速，不易產(chǎn)生嚴(yán)重的累積殘留［3］，且現(xiàn)今為止發(fā)生的瘦肉精事件都是由克倫特羅藥物引起中毒的。因此通常情況下，對(duì)鹽酸克倫特羅的單獨(dú)、快速檢測(cè)依然是基層檢測(cè)工作者必備的技能。

目前對(duì)于動(dòng)物組織樣品中單獨(dú)針對(duì)鹽酸克倫特羅的定量檢測(cè)，現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)有GB／T 5009.192-2003和NY／T 468-2006，兩標(biāo)準(zhǔn)推薦的樣品前處理步驟及上機(jī)采集離子都不相同，這就給檢測(cè)方法的選擇和建立造成了困惑。筆者分別依照兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)展開實(shí)驗(yàn)，對(duì)兩標(biāo)準(zhǔn)各自推薦的樣品提取方法和凈化方法進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)比較、討論和檢測(cè)結(jié)果比對(duì)，并且對(duì)兩標(biāo)準(zhǔn)中各自推薦的采集離子進(jìn)行了監(jiān)測(cè)選擇，對(duì)兩標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行優(yōu)化、整合，建立了快速、可靠、適合日常檢測(cè)工作的GC-MS分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：GCMS-QP2010型,日本島津公司；

電子天平：JM-B3002型（余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司），XP-204型（梅特勒-托利多公司）；

SCX強(qiáng)陽離子交換小柱、WCX弱陽離子交換小柱：500 mg／3 mL，美國色譜科公司；

針筒式微孔過濾膜：0.45μm，水相，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

甲醇、乙酸乙酯、異丙醇：色譜純，美國J. T. Baker公司；

甲苯：色譜純，天津化學(xué)試劑研究所；

碳酸鈉、鹽酸、氫氧化鈉、氨水、磷酸二氫鈉、氯化鈉、高氯酸：分析純；

雙（三甲基硅基）三氟乙酰胺（BSTFA）：美國色譜科公司；

鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品：純度為98.5%，德國Dr. Ehrenstorfer公司；

實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：DB-5MS 5%苯基-甲基聚硅氧烷石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣：高純氦（純度為99.999%），流速為1 mL／min；進(jìn)樣口溫度：240℃；柱溫：初溫70℃，保持1 min，以18℃／min升至200℃，再以5℃／min升至245℃，以25℃／min升至280℃，保持2 min；進(jìn)樣體積：1 μL；不分流進(jìn)樣。

1.2.2 質(zhì)譜條件

EI源；電子能量：70 eV；源溫：200℃；接口溫度：260℃；容積延遲：3.5 min；測(cè)定方式：離子監(jiān)測(cè)（SIM）；監(jiān)測(cè)范圍：11.75～12.75 min；監(jiān)測(cè)離子：m／z 86，187，243，262。

1.3 樣品前處理

1.3.1 提取凈化

依照NY／T 468-2006，稱?。?±0.05）g豬肉樣品于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入3 mL 10%碳酸鈉溶液，勻漿提取后離心，收集上層有機(jī)相，再向樣品中加入10 mL乙酸乙酯渦旋混合后離心，收集并合并提取液。在收集的提取液中加入5 mL 0.1 mol／L的鹽酸溶液，渦旋混合后離心。吸取下層水相，重復(fù)萃取一次，合并萃取液，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為4.5。

以上樣品液經(jīng)SCX小柱凈化，依次用5 mL甲醇、5 mL水和5 mL 30 mmol／L鹽酸活化，萃取液上柱，以5 mL水和5 mL甲醇淋洗，抽干小柱，再用5 mL 4%的氨化甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，完成對(duì)樣品的提取和凈化過程。

1.3.2 衍生化

將1.3.1得到的樣品液，置于60℃水浴中氮?dú)獯蹈桑尤?00 μL甲苯和100 μL BSTFA，迅速加蓋，渦旋30 s后，置于80℃的烘箱中衍生1 h，待冷卻后加入200 μL甲苯，渦旋混勻。進(jìn)行GC-MS分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法的選擇

鹽酸克倫特羅含苯胺取代基，在酸性條件下，以離子態(tài)存在，易溶于水溶液；在堿性條件下，以游離態(tài)存在，易溶于有機(jī)溶劑［9］。GB／T 5009.192-2003與NY／T 468-2006兩標(biāo)準(zhǔn)中的提取方法正是代表了這兩種不同的情況。

NY／T 468-2006樣品預(yù)處理方法即前述1.3.1步驟，即先在堿性條件下用有機(jī)試劑提取，再利用稀酸萃取，同時(shí)完成除脂、除蛋白。而GB／T 5009.192-2003是先用酸溶液提取，同時(shí)完成去脂、去蛋白，再在堿性環(huán)境下利用有機(jī)相振蕩萃取后濃縮。具體過程：將樣品在0.1 mol／L的高氯酸溶液中勻漿，并經(jīng)80℃水浴超聲提取，提取樣液用NaOH溶液調(diào)pH值到9.5后，加鹽并用異丙醇-乙酸乙酯（4∶6）進(jìn)行振蕩萃取，濃縮有機(jī)相后，用磷酸二氫鈉緩沖溶液溶解殘留物，經(jīng)針筒濾膜過濾待凈化，完成對(duì)樣品的提取過程。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GB／T 5009.192-2003的提取方法在有機(jī)試劑振蕩萃取過程中易出現(xiàn)乳化，之所以出現(xiàn)這種情況，應(yīng)該是有些樣品中蛋白含量較高，經(jīng)高氯酸溶解，輔以超聲、加熱處理后仍有部分蛋白殘留于提取液中，而后在強(qiáng)堿條件下沉淀析出，從而在振蕩萃取過程中發(fā)生了乳化現(xiàn)象。此外，該方法使用的實(shí)驗(yàn)器皿多、試劑品種多且用量大，步驟繁瑣、耗時(shí)長，完成10個(gè)樣品的提取過程用時(shí)約14 h。而前述1.3.1部分的提取方法在萃取過程中不會(huì)出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，且使用的實(shí)驗(yàn)器皿少，試劑相對(duì)簡(jiǎn)單，用量也少，完成10個(gè)樣品的提取過程用時(shí)約3 h，大大提高了檢測(cè)效率。

2.2 凈化小柱的比較

GB／T 5009.192-2003和NY／T 468-2006兩標(biāo)準(zhǔn)分別用WCX和SCX做凈化小柱。WCX與SCX都是陽離子交換柱，采用乙醇／甲醇活化，水、上樣液溶劑平衡，上樣，再以水、乙醇／甲醇淋洗，最后用氨化乙醇／氨化甲醇洗脫的通用凈化方法對(duì)兩種SPE小柱的保留效果進(jìn)行了比較。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，樣品液經(jīng)WCX小柱上樣后用水、乙醇淋洗，分別收集淋洗液，處理并吹干、進(jìn)行衍生化，上機(jī)進(jìn)樣，有目標(biāo)物鹽酸克倫特羅檢出，且水淋洗的檢出量大于乙醇淋洗的結(jié)果，說明WCX小柱對(duì)鹽酸克倫特羅的保留效果不好，這一點(diǎn)在文獻(xiàn)［10］中也被提到。同時(shí)對(duì)SCX小柱進(jìn)行考察，未發(fā)現(xiàn)在上樣、淋洗過程有目標(biāo)物損失的情況，實(shí)驗(yàn)效果良好，可獲得較為滿意的結(jié)果。

2.3 采集離子的選擇

采用SIM方式對(duì)GB／T 5009.192-2003和NY／T 468-2006提供的6個(gè)監(jiān)測(cè)離子m／z 86，187，243，262，212，277進(jìn)行掃描，得到鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品衍生物的選擇性離子質(zhì)譜圖，如圖1所示。選用離子豐度最大的碎片m／z 86作為定量離子，豐度較大的m／z 262，243，187作為定性離子。

圖1 鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品（256 ng／mL）衍生物的選擇離子質(zhì)譜圖

圖2為步驟1.2的儀器條件下，空白豬肉樣品中添加鹽酸克倫特羅的總離子流圖和碎片離子流圖，目標(biāo)物出峰時(shí)間為12.137 min，總離子流圖和各監(jiān)測(cè)離子流圖均未見干擾峰。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

圖2 添加濃度6.40 μg／kg鹽酸克倫特羅的總離子流圖（a）及各監(jiān)測(cè)離子流圖（b）

取一定量的鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解，配制成質(zhì)量濃度為400 mg／L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再稀釋成一定濃度的中間標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取一定體積到10 mL離心管后，按步驟1.3.2進(jìn)行衍生，得到濃度分別為10.24，19.20，32.00，51.20，128.0，256.0，384.0，512.0 ng／mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液系列，依次進(jìn)行GC-MS采集，每點(diǎn)各進(jìn)樣3針。

以定量離子（m／z 86）峰面積（A）對(duì)相應(yīng)質(zhì)量濃度（ρ，ng／mL）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A=687.5526ρ-663.754 9，相關(guān)系數(shù)r=0.999 7，表明線性關(guān)系良好。

2.5 方法回收率及檢出限

利用在空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法，按步驟1.3的樣品前處理方法對(duì)豬肉組織中鹽酸克倫特羅分別進(jìn)行1.92，5.12，12.8 μg／kg 3水平的添加回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度點(diǎn)進(jìn)行6個(gè)平行樣的同批次重復(fù)性檢驗(yàn)及2個(gè)隨機(jī)日的日間重復(fù)性來考察檢測(cè)方法的穩(wěn)定性，結(jié)果如表1所示。

表1 豬肉樣品中不同添加水平下鹽酸克倫特羅的回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n1=6）及2日間重復(fù)性（n2=2）

由表1可知，分2日檢測(cè)的豬肉組織樣品中鹽酸克倫特羅3濃度點(diǎn)添加回收率在73.0%～84.8%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在4.3%～8.2%之間。2日間3濃度點(diǎn)日間平均回收率分別為77.1%，81.2%，78.9%，相對(duì)應(yīng)的日間相對(duì)偏差分別為5.3%，4.5%，1.3%。

在本實(shí)驗(yàn)條件下，空白豬肉樣品中添加量為1.00 μg／kg時(shí)信噪比S／N＞3；添加量＜1.00 μg／kg時(shí)，背景干擾影響較大，定量離子的準(zhǔn)確積分較困難。因此本方法的檢出限為1.00 μg／kg。

3 結(jié)語

對(duì) 標(biāo) 準(zhǔn)GB／T 5009.192-2003，NY／T 468-2006中提出的酸提取和乙酸乙酯提取方案、WCX和SCX小柱凈化方案進(jìn)行了系統(tǒng)的比對(duì)研究，并對(duì)兩標(biāo)準(zhǔn)在實(shí)際檢測(cè)工作中的資源利用、工作時(shí)效、檢測(cè)可靠性進(jìn)行了分析，確定了堿性乙酸乙酯提取-稀鹽酸反萃取-SCX小柱凈化-BSTFA衍生-SIM掃描（M／Z 86，262，243，187）-外標(biāo)法定量相結(jié)合的檢測(cè)方案。該方法簡(jiǎn)便、快速、可靠性較好，適用于日常對(duì)豬肉樣品中鹽酸克倫特羅檢測(cè)的定性、定量工作。

［1］ 陳海玲，郝春麗，黃華斌，等．高效液相色譜-質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定豬尿中克倫特羅和萊克多巴胺［J］．理化檢驗(yàn)：化學(xué)分冊(cè)，2011，47(8): 859-860.

［2］ 吳銀良，李曉微，劉素英，等．氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定肝臟組織中鹽酸克倫特羅和鹽酸萊克多巴胺［J］．分析化學(xué)，2006，34(8): 1 083-1 086.

［3］ 謝勁心，林斯星．氣質(zhì)聯(lián)用法同時(shí)檢測(cè)尿液中的克倫特羅和萊克多巴胺殘留［J］．中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2010，20(8): 1 864-1 865.

［4］ 苗虹，鄒建宏，范塞，等．高效液相色譜-離子阱質(zhì)譜法測(cè)定尿液中β2-受體激動(dòng)劑及β-受體阻斷劑［J］．色譜，2010，28(6): 572-578.

［5］ SN／T 1924-2007 進(jìn)出口動(dòng)物源食品中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林殘留量的檢測(cè)方法液相色譜-質(zhì)譜／質(zhì)譜法［S］.

［6］ 管健，王立媛，吳平谷，等．同位素作內(nèi)標(biāo)氣質(zhì)聯(lián)機(jī)測(cè)定動(dòng)物源食品中4種β2-興奮劑的含量［J］．中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2007，17(12): 2 194-2 196.

［7］ GB／T 5009.192-2003 動(dòng)物性食品中克倫特羅殘留量的測(cè)定［S］.

［8］ NY／T 468-2006 動(dòng)物組織中鹽酸克倫特羅的測(cè)定氣相色譜-質(zhì)譜法［S］.

［9］ 趙善貞，陳舜勝，鄧小軍，等．高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物源性食品的4種β-興奮劑殘留量［J］．理化檢驗(yàn)：化學(xué)分冊(cè)，2009，45(8): 968-971.

［10］ 康莉，陳春曉，劉紅河，等．LC／MS／MS法測(cè)定豬肝中四環(huán)素類抗生素及鹽酸克倫特羅藥物殘留［J］．中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2007，17(12): 2 144-2 146.

Determination of Clenbuterol Residue in Pork by GC-MS

Li Ying, Wang Yihong, Wang Liang, Li Chanjun
（Testing Center for Quality of Agricultural Products, Zhengzhou 450006, China）

Extracted with ethyl acetate, purified with SCX cartridge, quantified by external standard, a method was established for the determination of clenbuterol in pork by GC-MS. The good linearity was showed in the range of 10.24-512.0 ng／mL with the correlation coeff i cients r=0.999 7. The recovery rates were ranged from 73.0% to 84.8% at the spiked levels of 1.92, 5.12, 12.80 μg／kg, with the relative standard deviations of 4.3%-8.2%（n=6）. The average recovery rates of the 3 concentrations in the two different day were ranged of 77.1%-81.2% and the relative deviations were 1.3%-5.3%. The results indicated that the method was precise, accurate, easy, fast and suitable to complete the determination of clenbuterol residue in pork on daily work.

gas chromatography-mass spectrometry; clenbuterol; pork sample; comparison of method

O658

A

1008-6145（2014）02-0043-04

10.3969／j.issn.1008-6145.2014.02.012

聯(lián)系人：李鶯；E-mail: zixuan100@163.com

2013-12-26