紅芽大戟組織培養(yǎng)條件的優(yōu)化

李林軒等

摘要：優(yōu)化紅芽大戟組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)，為保護(hù)紅芽大戟的野生資源提供技術(shù)支撐。分別以MS和1/2MS為基本培養(yǎng)基，采用正交設(shè)計對影響紅芽大戟組織培養(yǎng)的繼代增殖和誘導(dǎo)生根進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA+0.2 mg/L NAA+0.3 g/L 活性炭有利于叢生芽繼代增殖；1/2MS+0.75 mg/L IBA+0.2 mg/L PP333適于誘導(dǎo)生根獲得再生植株；生根苗移栽于泥炭+珍珠巖（體積比1 ∶1）的混合基質(zhì)上，成活率達(dá)92%。

關(guān)鍵詞：紅芽大戟；組織培養(yǎng)；繼代增殖；正交設(shè)計

中圖分類號： Q943.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）04-0060-03

收稿日期：2013-08-13

基金項目：廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃（編號：桂科重1355001-5-12）；廣西南寧市科學(xué)技術(shù)開發(fā)計劃（編號：201002049C）。

作者簡介：李林軒（1986—），男，廣西桂林人，助理研究員，從事中藥資源保護(hù)與開發(fā)利用研究。E-mail：starry1125@sina.com。

通信作者：韋坤華，博士，助理研究員，從事藥用植物生物技術(shù)研究。E-mail：divinekh@163.com。紅大戟（Knoxia valerianoides Thorel et Pitard）為茜草科多年生草本植物紅芽大戟的干燥塊莖。主產(chǎn)于廣西、廣東，云南、福建、海南亦有少量分布，生長在低山坡草叢中的半陰、半陽處。紅大戟苦、寒、有小毒，歸肺、脾、腎經(jīng)，藥用功能為瀉水逐飲，攻毒消腫散結(jié)，主治胸腹積水、兩便不利、癰腫瘡毒、瘰疬痰核[1]，還具有抗菌作用，為中成藥紫金錠的主藥[2]。由于紅大戟使用量的增加、藥材使用與種植模式的改變，紅芽大戟長期處于野生狀態(tài)，人為亂采濫挖，紅芽大戟野生資源急劇減少，在某些區(qū)域幾乎已經(jīng)絕跡。紅芽大戟自然繁殖主要通過種子，但由于種胚發(fā)育不良，自然散落種子發(fā)芽率不到1%。采用常規(guī)方法貯藏1年以上的種子，基本喪失活力，幾乎不能出苗[3-4]，很難滿足市場需求。為更好開發(fā)利用紅芽大戟資源，擴(kuò)大藥源，本試驗通過正交試驗優(yōu)化紅芽大戟組織培養(yǎng)條件，為紅芽大戟快速繁殖工廠化生產(chǎn)育苗提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1無菌材料

材料采集自廣西藥用植物園科研基地內(nèi)引種栽培生長健壯的、無病蟲害的植株，剪取嫩芽作為試驗材料。將嫩芽置洗潔精水中浸泡10 min，用自來水流水沖洗15 min，在超凈工作臺上置于0.1%HgCl2溶液浸泡消毒8 min，再用無菌水浸洗4次，每次浸洗5 min，然后將帶有嫩芽的外植體接種于添加 6-芐基腺嘌呤（6-BA）2.0 mg/L+萘乙酸（NAA）0.4 mg/L的MS培養(yǎng)基上[5]。在室內(nèi)自然散射光照下培養(yǎng)獲得無菌叢生芽。

1.2叢生芽快繁培養(yǎng)基優(yōu)化

將紅芽大戟試管苗在MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L 培養(yǎng)基中繼代5次后，產(chǎn)生的叢生芽出現(xiàn)枯葉、玻璃化等現(xiàn)象。在對繁殖培養(yǎng)基進(jìn)行初步篩選的基礎(chǔ)上，在 MS+0.3 g/L 活性炭為培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上以6-BA（1.0、1.5、2.0 mg/L）、NAA （0.1、0.2、0.4 mg/L）、IAA（0.1、0.2、0.4 mg/L）3種激素的3個水平進(jìn)行正交試驗，對紅芽大戟的繁殖培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，每個處理10瓶，每瓶3個單芽，30 d后以測試管苗生長情況和芽增殖倍數(shù)[芽增殖倍數(shù)=（30 d后芽數(shù)-接種時芽數(shù)）/接種時芽數(shù)]為主要考察指標(biāo)來優(yōu)化繁殖培養(yǎng)基。

1.3生根培養(yǎng)基篩選

為了篩選最佳的生根培養(yǎng)基，在1/2MS為培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上以IBA（0.5、0.75、1.0 mg/L）、PP333（0.1、0.2、0.4 mg/L）和活性炭（0、0.5、1.0 g/L）3種因素的3個水平進(jìn)行正交試驗，對紅芽大戟的生根培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，每個處理10瓶，每瓶20個單芽，30 d后統(tǒng)計生根率及平均生根數(shù)：生根率=生根芽數(shù)/接種總數(shù)×100%；平均生根數(shù)=總生根數(shù)/接種總數(shù)×100%。

2結(jié)果與分析

2.1叢生芽快繁培養(yǎng)基優(yōu)化

2.2叢生芽誘導(dǎo)生根

將生長健壯的芽苗單切接入紅芽大戟生根培養(yǎng)基中，30 d 后統(tǒng)計生根率及平均生根數(shù)。為了篩選最佳生根培養(yǎng)基，使用IBA、PP333和活性炭3個水平設(shè)計正交試驗，結(jié)果（表3、表4）表明，IBA的濃度對試管苗的生根率有顯著的影響，但PP333和活性炭對紅芽大戟生根率影響不大。對平均生根數(shù)分析表明，IBA和PP333對試管苗的平均生根數(shù)均有顯著影響，PP333影響要大于IBA，而活性炭影響不顯著（表3、表5）。進(jìn)一步分析，生根率和平均生根數(shù)主要受IBA濃度的影響，在0.5～0.75 mg/L濃度范圍內(nèi)，隨著IBA濃度的增大生根率和平均生根數(shù)上升，當(dāng)IBA濃度高于0.75mg/L時，生根率和平均生根數(shù)都下降，表明IBA濃度過高不利紅芽大戟叢生芽生根。添加低濃度的多效唑有利于叢生芽生長控制和生根，當(dāng)IBA濃度不變、PP333濃度為0.1～0.2 mg/L時，生根率和平均生根數(shù)隨著濃度的增大而升高，當(dāng)濃度升高至0.4 mg/L時，生根率和平均生根數(shù)有所下降，高濃度的PP333抑制叢生芽的生根，最佳的生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.75 mg/L IBA+0.2 mg/L PP333，在此培養(yǎng)基上的生根率達(dá)到100%，平均生根數(shù)為6.7條（圖2）。

2.3再生苗的移栽

根據(jù)紅芽大戟的生長特性，將已生根的試管苗開蓋煉苗2～3 d，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽于消過毒的泥炭+珍珠巖（體積比 1 ∶1）的混合基質(zhì)上，置于透光度為75%育苗棚中，每天噴灑少量的水，30 d后移栽成活率達(dá)92%。表4紅芽大戟生根培養(yǎng)基生根率方差分析

方差來源離均差平方和自由度方差F值P值備注IBA542.892271.4456.810.01≤P<0.05顯著PP333157.56278.7816.490.05≤P<0.1不顯著活性炭2.8921.440.30P≥0.1不顯著誤差9.5624.78注同表2。

3討論

培養(yǎng)基中激素的種類與濃度對植物的繁殖與生根非常關(guān)鍵[7-9]。6-BA是重要的植物激素，可以促進(jìn)細(xì)胞分裂、側(cè)芽生長等[10]。 IAA是植物自身能夠形成的內(nèi)源生長素，能促進(jìn)細(xì)胞分裂與細(xì)胞生長，在植物的生長與發(fā)育上起著關(guān)鍵作用，通過調(diào)節(jié)或影響植物整體或細(xì)胞水平的多種反應(yīng)發(fā)揮作用[11]。NAA是廣譜型植物生長調(diào)節(jié)劑，具有促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大、誘導(dǎo)形成不定根等作用，但是在組織培養(yǎng)過程中也容易致使材料老化和形成愈傷組織。本研究中我們使用 6-BA、NAA和IAA進(jìn)行繁殖篩選，IBA、PP333和活性炭進(jìn)行生根篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)如果細(xì)胞分裂素的濃度超過 2.0 mg/L，芽的增殖會出現(xiàn)異常，如玻璃化、老化等；如NAA濃度高于 0.2 mg/L 時，愈傷較多，影響增殖倍數(shù)。最終確定最佳的增殖培養(yǎng)基為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA+0.2 mg/L NAA+0.3 g/L，與凌征柱等研究使用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA 3.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L[12]和MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L[13]稍有不同，外源激素總濃度相對較低，這有利于降低材料繼代變異可能性。

IBA是植物自身能夠形成的內(nèi)源生長素，是植物主根生長促進(jìn)劑，能提高發(fā)芽率、成活率，并能促進(jìn)細(xì)胞分裂與細(xì)胞生長，誘導(dǎo)形成不定根。在植物組織培養(yǎng)過程中，內(nèi)源激素形成速度緩慢，無法滿足植物生長的需求，需要從培養(yǎng)基中吸收。相關(guān)研究指出，PP333能促進(jìn)植物的根系生長和次生根的發(fā)生。本試驗中選苗是生根的關(guān)鍵因素，主要標(biāo)準(zhǔn)是苗的健壯程度，細(xì)弱苗生根移栽后很難成活。紅芽大戟生根時選擇健壯組培苗進(jìn)行生根培養(yǎng)，同時加入低濃度PP333促進(jìn)次生根的發(fā)生，同時不易讓生根苗生長過高，試管苗纖細(xì)、過高移栽后都不易成活。在生根過程中IBA和PP333有協(xié)同促進(jìn)效果，0.75 mg/L 的IBA與0.2 mg/L PP333聯(lián)合使用生根效果最為理想，紅芽大戟苗莖稈粗壯、根數(shù)多、根系發(fā)育良好，移栽后成活率較高。

參考文獻(xiàn)：

[1]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2009：140-141.

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[4]陳芳清，徐祥浩. 藥用植物紅芽大戟的個體生態(tài)學(xué)研究[J]. 武漢植物學(xué)研究，1995，13（2）：147-151.

[5]衛(wèi)錫錦. 紅大戟的栽培技術(shù)[J]. 中藥材，1997，20（12）：598.

[6]韋瑩，余麗瑩，黃浩，等. 紅芽大戟愈傷組織誘導(dǎo)及分化研究[J]. 廣西植物，2009，29（6）：817-821.

[7]韋榮昌，李林軒，吳慶華，等. 植物激素對涼粉草扦插生根的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（8）：239-240.

[8]王菲彬，王斐，管玲玲，等，植物激素對東方百合試管苗鱗片分化不定芽的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（6）：53-55.

[9]陳豫，胡偉，何磊. 不同濃度激素對胡蘿愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（2）：54-56.

[10]Polanco M C，Peláez M I，Ruiz M L. Factors affecting callus and shoot formation from in vitro cultures of Lens culinaris Medik[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，1988，15（2）：175-182.

[11]Hagen G，Guilfoyle T. Auxin-responsive gene expression：genes，promoters and regulatory factors[J]. Plant Molecular Biology，2002，49（3/4）：373-385.

[12]凌征柱，覃文流，余麗瑩，等. 紅大戟的組織培養(yǎng)及植株再生[J]. 中草藥，2005，36（10）：1555-1557.

[13]黃浩. 藥用植物紅芽大戟組織培養(yǎng)的研究[D]. 南寧：廣西大學(xué)，2006.

方差來源離均差平方和自由度方差F值P值備注IBA542.892271.4456.810.01≤P<0.05顯著PP333157.56278.7816.490.05≤P<0.1不顯著活性炭2.8921.440.30P≥0.1不顯著誤差9.5624.78注同表2。

3討論

培養(yǎng)基中激素的種類與濃度對植物的繁殖與生根非常關(guān)鍵[7-9]。6-BA是重要的植物激素，可以促進(jìn)細(xì)胞分裂、側(cè)芽生長等[10]。 IAA是植物自身能夠形成的內(nèi)源生長素，能促進(jìn)細(xì)胞分裂與細(xì)胞生長，在植物的生長與發(fā)育上起著關(guān)鍵作用，通過調(diào)節(jié)或影響植物整體或細(xì)胞水平的多種反應(yīng)發(fā)揮作用[11]。NAA是廣譜型植物生長調(diào)節(jié)劑，具有促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大、誘導(dǎo)形成不定根等作用，但是在組織培養(yǎng)過程中也容易致使材料老化和形成愈傷組織。本研究中我們使用 6-BA、NAA和IAA進(jìn)行繁殖篩選，IBA、PP333和活性炭進(jìn)行生根篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)如果細(xì)胞分裂素的濃度超過 2.0 mg/L，芽的增殖會出現(xiàn)異常，如玻璃化、老化等；如NAA濃度高于 0.2 mg/L 時，愈傷較多，影響增殖倍數(shù)。最終確定最佳的增殖培養(yǎng)基為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA+0.2 mg/L NAA+0.3 g/L，與凌征柱等研究使用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA 3.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L[12]和MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L[13]稍有不同，外源激素總濃度相對較低，這有利于降低材料繼代變異可能性。

IBA是植物自身能夠形成的內(nèi)源生長素，是植物主根生長促進(jìn)劑，能提高發(fā)芽率、成活率，并能促進(jìn)細(xì)胞分裂與細(xì)胞生長，誘導(dǎo)形成不定根。在植物組織培養(yǎng)過程中，內(nèi)源激素形成速度緩慢，無法滿足植物生長的需求，需要從培養(yǎng)基中吸收。相關(guān)研究指出，PP333能促進(jìn)植物的根系生長和次生根的發(fā)生。本試驗中選苗是生根的關(guān)鍵因素，主要標(biāo)準(zhǔn)是苗的健壯程度，細(xì)弱苗生根移栽后很難成活。紅芽大戟生根時選擇健壯組培苗進(jìn)行生根培養(yǎng)，同時加入低濃度PP333促進(jìn)次生根的發(fā)生，同時不易讓生根苗生長過高，試管苗纖細(xì)、過高移栽后都不易成活。在生根過程中IBA和PP333有協(xié)同促進(jìn)效果，0.75 mg/L 的IBA與0.2 mg/L PP333聯(lián)合使用生根效果最為理想，紅芽大戟苗莖稈粗壯、根數(shù)多、根系發(fā)育良好，移栽后成活率較高。

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[9]陳豫，胡偉，何磊. 不同濃度激素對胡蘿愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（2）：54-56.

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[12]凌征柱，覃文流，余麗瑩，等. 紅大戟的組織培養(yǎng)及植株再生[J]. 中草藥，2005，36（10）：1555-1557.

[13]黃浩. 藥用植物紅芽大戟組織培養(yǎng)的研究[D]. 南寧：廣西大學(xué)，2006.

方差來源離均差平方和自由度方差F值P值備注IBA542.892271.4456.810.01≤P<0.05顯著PP333157.56278.7816.490.05≤P<0.1不顯著活性炭2.8921.440.30P≥0.1不顯著誤差9.5624.78注同表2。

3討論

培養(yǎng)基中激素的種類與濃度對植物的繁殖與生根非常關(guān)鍵[7-9]。6-BA是重要的植物激素，可以促進(jìn)細(xì)胞分裂、側(cè)芽生長等[10]。 IAA是植物自身能夠形成的內(nèi)源生長素，能促進(jìn)細(xì)胞分裂與細(xì)胞生長，在植物的生長與發(fā)育上起著關(guān)鍵作用，通過調(diào)節(jié)或影響植物整體或細(xì)胞水平的多種反應(yīng)發(fā)揮作用[11]。NAA是廣譜型植物生長調(diào)節(jié)劑，具有促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大、誘導(dǎo)形成不定根等作用，但是在組織培養(yǎng)過程中也容易致使材料老化和形成愈傷組織。本研究中我們使用 6-BA、NAA和IAA進(jìn)行繁殖篩選，IBA、PP333和活性炭進(jìn)行生根篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)如果細(xì)胞分裂素的濃度超過 2.0 mg/L，芽的增殖會出現(xiàn)異常，如玻璃化、老化等；如NAA濃度高于 0.2 mg/L 時，愈傷較多，影響增殖倍數(shù)。最終確定最佳的增殖培養(yǎng)基為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA+0.2 mg/L NAA+0.3 g/L，與凌征柱等研究使用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA 3.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L[12]和MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L[13]稍有不同，外源激素總濃度相對較低，這有利于降低材料繼代變異可能性。

IBA是植物自身能夠形成的內(nèi)源生長素，是植物主根生長促進(jìn)劑，能提高發(fā)芽率、成活率，并能促進(jìn)細(xì)胞分裂與細(xì)胞生長，誘導(dǎo)形成不定根。在植物組織培養(yǎng)過程中，內(nèi)源激素形成速度緩慢，無法滿足植物生長的需求，需要從培養(yǎng)基中吸收。相關(guān)研究指出，PP333能促進(jìn)植物的根系生長和次生根的發(fā)生。本試驗中選苗是生根的關(guān)鍵因素，主要標(biāo)準(zhǔn)是苗的健壯程度，細(xì)弱苗生根移栽后很難成活。紅芽大戟生根時選擇健壯組培苗進(jìn)行生根培養(yǎng)，同時加入低濃度PP333促進(jìn)次生根的發(fā)生，同時不易讓生根苗生長過高，試管苗纖細(xì)、過高移栽后都不易成活。在生根過程中IBA和PP333有協(xié)同促進(jìn)效果，0.75 mg/L 的IBA與0.2 mg/L PP333聯(lián)合使用生根效果最為理想，紅芽大戟苗莖稈粗壯、根數(shù)多、根系發(fā)育良好，移栽后成活率較高。

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