百合種球脫毒技術(shù)研究進(jìn)展

胡新穎等

摘要：對(duì)近年來(lái)我國(guó)百合種球脫毒技術(shù)的研究進(jìn)展情況進(jìn)行了綜述，介紹了百合常見(jiàn)病毒種類(lèi)及特點(diǎn)，系統(tǒng)闡述了我國(guó)目前常用的百合種球脫毒技術(shù)：愈傷組織培養(yǎng)、莖尖培養(yǎng)、熱處理、抗病毒藥劑應(yīng)用以及多種方式綜合應(yīng)用等。

關(guān)鍵詞：百合；種球；脫毒；研究進(jìn)展

中圖分類(lèi)號(hào)： S682.2+65.04 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）04-0006-03

收稿日期：2013-08-12

基金項(xiàng)目：遼寧省農(nóng)村科技特派團(tuán)項(xiàng)目（編號(hào)：2012215008）。

作者簡(jiǎn)介：胡新穎（1980—），女，河北豐潤(rùn)人，碩士，助理研究員，從事花卉栽培、育種與種球繁育技術(shù)研究，E-mail：huxinying2013@163.com。

通信作者：顏范悅，研究員，從事花卉栽培、育種與種球繁育技術(shù)研究。E-mail：wl401983@163.com。百合（Lilium spp.）為百合科百合屬多年生球根類(lèi)草本植物，因其花大、花色豐富、花形優(yōu)美而深受人們喜愛(ài)，是主要的切花觀賞花卉之一。商業(yè)上用的百合種球主要以扦插繁殖和分球繁殖等無(wú)性繁殖為主。長(zhǎng)期的無(wú)性繁殖使病毒在百合體內(nèi)積累，引發(fā)病毒病，嚴(yán)重影響切花產(chǎn)量和品質(zhì)。另外，栽培管理不當(dāng)，導(dǎo)致溫度過(guò)高，引發(fā)蚜蟲(chóng)危害，使病毒在百合植株間傳播，種球帶毒率日益增加。采取有效措施控制和消除病毒病，生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)無(wú)毒百合種球，是百合種球商品化生產(chǎn)面臨的一個(gè)重要問(wèn)題。目前百合脫毒主要集中在莖尖培養(yǎng)、熱處理、應(yīng)用抗病毒藥劑及綜合脫毒等方法，本文就百合的病毒病種類(lèi)及脫毒技術(shù)做一系統(tǒng)的綜述。

1百合常見(jiàn)病毒病的種類(lèi)及特點(diǎn)

自Stewart（1896）描述百合的壞死條紋以來(lái)，相繼報(bào)道了百合的病毒病原14種。其中發(fā)生普遍，危害嚴(yán)重的病毒有5種，即百合潛隱病毒（lily symptomless virus，LSV）、黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、郁金香碎花病毒（tulip breaking virus，TBV）、異名百合斑駁病毒（lily mottle virus，LMoV）和百合叢簇病毒（lily rosette virus，LRV）。其他9種病毒均在栽培地區(qū)少量發(fā)生，對(duì)百合構(gòu)不成普遍危害[1]。

近年來(lái)，隨著百合引種數(shù)量的增加、種植面積的擴(kuò)大，以及不規(guī)范的種球自繁，病毒病已開(kāi)始在我國(guó)各百合種植區(qū)發(fā)生流行，一般發(fā)病率為40%～50%，二代種球的帶毒率在90%以上，嚴(yán)重制約了我國(guó)百合鮮切花的產(chǎn)量和質(zhì)量。這些病毒在危害百合時(shí)有幾個(gè)突出特點(diǎn)：多種病毒復(fù)合侵染，病癥復(fù)雜、危害重，傳播速度快，病毒在植株內(nèi)分布不均，初侵染與二次侵染特點(diǎn)不同等[2]。病毒病對(duì)百合的危害主要有：植株嚴(yán)重矮化，脈明，花葉，畸形，壞死斑，鱗莖變小，產(chǎn)量下降，種質(zhì)明顯退化，開(kāi)花少且小，有的甚至盲花，嚴(yán)重時(shí)整株枯死，影響百合的藥用、食用和觀賞價(jià)值。

2百合脫毒技術(shù)研究現(xiàn)狀

2.1愈傷組織培養(yǎng)脫毒技術(shù)

利用百合鱗片、莖尖等外植體誘導(dǎo)愈傷組織，進(jìn)而誘導(dǎo)分化無(wú)毒試管苗或鱗莖，是脫除百合植株體內(nèi)病毒的一種途徑。據(jù)鄭麗娜研究表明，百合鱗片通過(guò)誘導(dǎo)出愈傷組織，再分化成帶葉的小鱗莖，經(jīng)檢測(cè)，脫毒率總體偏低，在317%～46.7%之間，此途徑暫不能成為百合脫毒的有效途徑[3]。此外，愈傷組織在長(zhǎng)期無(wú)性培養(yǎng)過(guò)程中，由于培養(yǎng)基中激素、生長(zhǎng)素物質(zhì)的刺激影響，通常會(huì)發(fā)生體細(xì)胞無(wú)性系變異，這種變異的范圍和方向都是不定的，因此對(duì)于無(wú)性繁殖作物而言，為了保持優(yōu)良性狀，一般不采用此法[4]。但是，這種脫毒方式有其自身的優(yōu)點(diǎn)，比如，實(shí)驗(yàn)室可行性強(qiáng)、分化率控制性強(qiáng)、周期較短、一次性成苗數(shù)量多等，在馬鈴薯、天竺葵、大蒜、草莓等植物上應(yīng)用已先后獲得成功，在百合上應(yīng)用此種脫毒方法有進(jìn)一步研究的價(jià)值和空間。

2.2莖尖培養(yǎng)脫毒技術(shù)

莖尖培養(yǎng)脫毒是利用病毒在較老的器官和組織內(nèi)含量較高，在莖尖等幼嫩的或未成熟的組織和器官中含量較低的原理，剝?nèi)∏o尖組織培養(yǎng)，脫除植株體內(nèi)病毒。早在1962年，Phillips就利用莖尖培養(yǎng)成功脫除百合病毒。1966年Mori和Hamaya通過(guò)莖尖培養(yǎng)獲得了百合無(wú)病毒植株。從此，莖尖培養(yǎng)被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)無(wú)毒百合種苗。

通過(guò)莖尖培養(yǎng)獲得無(wú)病毒植株的難易程度與品種和感染病毒的種類(lèi)有直接關(guān)系。徐品三等利用不同百合品種的不定芽培養(yǎng)證明了這一點(diǎn)，各品種的再生子球中，“香華麗”百合的LSV和TBV檢出率較高，分別是50%和59%，“卡薩布蘭卡”百合中的LSV容易脫去，脫毒率達(dá)76%，“魅麗”百合中的CMV能全部脫去。其原因可能是它們生長(zhǎng)點(diǎn)附近病毒的濃度、維管束分化程度以及細(xì)胞代謝活性不同的緣故[5]。

采用莖尖培養(yǎng)時(shí)切取莖尖的大小是研究人員一直在探求的問(wèn)題。切取莖尖太大，成活率高，但脫毒效果差；切取莖尖太小，脫毒率雖高，但操作不方便。因此，選擇適當(dāng)?shù)那o尖大小，兼顧成活率和脫毒率2個(gè)因素，是成功利用莖尖培養(yǎng)獲得脫毒原種球的關(guān)鍵。邵增龍等認(rèn)為剝?nèi)?.2～0.3 mm 的莖尖分生組織進(jìn)行培養(yǎng)的脫毒效果較好且易成活[6]。張文珠等研究表明，直接剝?nèi)?.2～0.5 mm的莖尖，脫毒率達(dá)38%[7]。朱旭東等先用鱗片誘導(dǎo)分化不定芽，再利用無(wú)菌不定芽剝?nèi)?.5 mm以下莖尖進(jìn)行培養(yǎng)，降低了污染率，提高了成活率且節(jié)省了材料，但脫毒效果一般[8]。鐘海豐等認(rèn)為新鮮百合種球經(jīng)4 ℃冷藏處理1個(gè)月后剝?nèi)?.2 mm莖尖培養(yǎng)的脫毒方法，既提高出芽率，也達(dá)到了較理想的脫毒率，是百合脫毒的較好方法[9]。綜上所述，莖尖培養(yǎng)切取莖尖的最適大小為0.2～0.5 mm。操作需在解剖鏡下進(jìn)行。

莖尖二次脫毒是對(duì)莖尖培養(yǎng)方法的改進(jìn)，具有簡(jiǎn)便、易掌握、速度快、分化率高、脫毒率高、污染率低等特點(diǎn)。鄭麗娜等一次剝?nèi)∏o尖0.2～0.4 mm，培養(yǎng)成苗后，剝?nèi)o(wú)根苗的莖尖（0.4～0.6 mm）進(jìn)行二次脫毒培養(yǎng)，脫毒率都在75%以上[3]。侯娜研究表明，2～3 mm組培苗莖尖經(jīng)過(guò)1次莖尖培養(yǎng)+4次繼代脫毒處理后，CMV和LSV的脫毒率都能達(dá)到100%[10]。

靳慧潔報(bào)道的莖尖超低溫脫毒技術(shù)[11]是一條新的脫毒途徑。試驗(yàn)表明，繼代后20 d的百合組培苗，經(jīng)超低溫處理，在 40 ℃ 水浴化凍后，切取0.5～0.8 mm的莖尖，脫毒率、成活率較高，生長(zhǎng)較快，整個(gè)操作簡(jiǎn)單易行，可達(dá)到大規(guī)模實(shí)際生產(chǎn)的需求。

2.3熱處理與莖尖培養(yǎng)結(jié)合的脫毒技術(shù)

熱處理是根據(jù)病毒在高溫下出現(xiàn)鈍化，其復(fù)制明顯減弱或停止，植物在高溫培養(yǎng)期間生長(zhǎng)的嫩稍不帶病毒，取其嫩梢進(jìn)行培養(yǎng)從而達(dá)到脫毒的目的。熱處理脫毒法已應(yīng)用多年，被世界多個(gè)國(guó)家利用。該項(xiàng)技術(shù)要求的設(shè)備條件比較簡(jiǎn)單，脫毒操作也較容易。主要缺點(diǎn)是脫毒時(shí)間長(zhǎng)，脫毒不完全，若溫度過(guò)高或處理時(shí)間太長(zhǎng)，又會(huì)降低植株的成活率。此外，由于溫度難以控制以及各病毒對(duì)溫度的敏感范圍不一樣，很難獲得理想的控制效果。因此，目前百合脫毒技術(shù)研究中，熱處理多與莖尖培養(yǎng)脫毒結(jié)合應(yīng)用，能達(dá)到較好的脫毒效果。

熱處理與莖尖培養(yǎng)相結(jié)合的方式基本有2種：一是先對(duì)鱗莖或試管苗進(jìn)行熱處理，然后切取莖尖檢測(cè)脫毒效果，相關(guān)研究報(bào)道較多。徐品三等以“鐵炮”百合感病種球?yàn)椴牧希瑢?duì)其進(jìn)行37 ℃熱處理20 d后再進(jìn)行組織培養(yǎng)，子球再生率僅為40%左右，但LSV脫毒率達(dá)95%以上[12]。陳劍勇以“索蚌”小鱗莖為外植體，采用50 ℃熱水處理30 min結(jié)合莖尖培養(yǎng)，脫毒率可達(dá)80%，直接莖尖培養(yǎng)的脫毒率僅為30%[13]。吳斌等將帶LSV、CMV、LMoV的百合子球放入恒溫箱中，35 ℃ 左右培養(yǎng)4周后病毒含量明顯降低。剝?nèi)?.4～0.6 mm莖尖2次脫毒，4個(gè)月后組培苗帶毒率降為0%[14]。周曉波等以帶LSV的“卷丹珠”芽為材料，36 ℃處理10 d后，剝?nèi)?.2 mm大小的莖尖進(jìn)行培養(yǎng)，脫毒率達(dá)100%[15]。劉芬等研究表明，花絲培養(yǎng)結(jié)合37±2 ℃熱處理28 d后，切取0.8～1.0 mm的莖尖再生芽脫毒效果最好，脫毒率達(dá)80%以上[16-17]。江洪如等將“龍牙”百合鱗莖在58 ℃處理10～20 min，再在38 ℃溫度下熱處理72 h，結(jié)合0.2～0.4 mm莖尖培養(yǎng)，可完全脫去LSV、CMV和LMoV[18]。羅麗萍等以“龍牙”百合組培小鱗莖為試材，白天40～42 ℃、夜晚35 ℃熱處理60 d后，剝?nèi)?.2～0.3 mm的莖尖進(jìn)行培養(yǎng)，成活率和脫毒率都較高[19]。陳麗等將“卷丹”鱗莖經(jīng)28～30 ℃高溫催芽后，剝?nèi)⌒∮?.2 mm的微生長(zhǎng)點(diǎn)進(jìn)行培養(yǎng)，脫毒率達(dá)100%[20]。不同的百合品種經(jīng)熱處理后脫毒效果是有差異的。姜春華對(duì)東方系百合的不同品種進(jìn)行2次遞進(jìn)熱處理和莖尖脫毒。結(jié)果表明，高溫處理的最理想溫度是40～45 ℃，熱處理后剝?nèi)?.2～0.6 mm的莖尖進(jìn)行脫毒培養(yǎng)，“西伯利亞”的脫毒率為100%，吸光度值低，脫毒徹底；“凝星”的脫毒率為100%，但吸光度值高，脫毒不徹底，效果一般[21]。

另一種熱處理方式是先剝?nèi)∏o尖，再對(duì)試管苗進(jìn)行高溫培養(yǎng)，也能達(dá)到較好的脫毒效果。張文珠等以帶毒的Tiber為試材，莖尖培養(yǎng)結(jié)合熱處理，脫毒率達(dá)60%[7]。劉博剝?nèi)в蠰SV病毒的Tiber商品球的莖尖約 2 mm，結(jié)合白天 38 ℃ 10 h，夜間32 ℃ 14 h全暗培養(yǎng)，脫毒率達(dá)100%[22]。高慧卿等以品種Tiber初代培養(yǎng)的無(wú)菌苗為材料，切取0.2～0.5 mm的莖尖結(jié)合65 ℃熱處理30 min再進(jìn)行脫毒培養(yǎng)，LSV的脫毒效果優(yōu)于莖尖培養(yǎng)[23]。張藝萍等將帶有CMV的Siberia組培苗經(jīng)（39±1） ℃熱處理后，2次剝?nèi)?.4～0.6 mm的莖尖培養(yǎng)，脫毒率可達(dá)80%[24]。

熱處理與莖尖培養(yǎng)相結(jié)合之所以能夠提高脫毒效果，是由于熱處理可使植物生長(zhǎng)本身所具有的頂端免疫區(qū)得以擴(kuò)大，有利于切取較大的莖尖，從而提高組織培養(yǎng)的成活率[3]。先對(duì)鱗莖進(jìn)行熱處理再莖尖脫毒的方式，在切取莖尖大小相同的情況下，更有利于提高試管苗的成活率，更適合大規(guī)模脫毒原種球的生產(chǎn)。

2.4熱處理+莖尖培養(yǎng)+抗病毒藥劑綜合脫毒技術(shù)

化學(xué)療法即抗病毒藥劑處理，是一種新的脫毒方法，在外植體培養(yǎng)時(shí)添加抑制植物病毒活性的化學(xué)物質(zhì)，如病毒唑（virazole ）或硫尿嘧啶（2-thiouracil）等，以達(dá)到減輕病毒危害的目的。其作用原理是：抗病毒藥劑在三磷酸狀態(tài)下會(huì)阻止病毒RNA帽子結(jié)構(gòu)形成，抑制病毒增殖或移動(dòng)。徐品三等研究表明，將檢測(cè)出LSV的“卡薩布蘭卡”鱗片組培形成的不定芽，移植在添加DHT的液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，2周后轉(zhuǎn)接到固體培養(yǎng)基中，經(jīng)檢測(cè)脫毒率達(dá)到100%[5]。

單獨(dú)應(yīng)用抗病毒藥劑脫除百合病毒也較少見(jiàn)，一般都是與莖尖培養(yǎng)、熱處理相結(jié)合應(yīng)用，脫毒效果較好。徐榕雪試驗(yàn)表明，病毒唑處理濃度為4 mg/L，莖尖大小為 0.5～0.7 mm，能保證較高的成活率和脫毒率，且操作簡(jiǎn)便、成苗快[25]。王超等研究表明，種球38 ℃光照處理 16 h，25 ℃ 黑暗處理 8 h，待地上部分長(zhǎng)出10 cm左右高時(shí)，切取0.5～0.8 mm莖尖，接種于含病毒唑10 mg/L的培養(yǎng)基中，脫毒效果最好[26]。鄭麗娜等對(duì)種球做相同熱處理，再剝?nèi)?0.8～1.2 mm 莖尖，置于含6 mg/mL病毒唑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 d，脫毒效果最佳，一次性脫毒率可達(dá)到80%以上[27]。張惠華等以2～4 ℃冷庫(kù)休眠84 d、15 ℃室內(nèi)7 d催芽處理后的“索蚌”種球?yàn)樵嚥模?9 ℃（±1 ℃）恒溫處理15 d，剝?nèi)∏o尖大小為0.4～0.5 mm，病毒唑處理濃度為 10 mg/L 時(shí)，脫除病毒效果最好[28]。馬平霞研究表明，2～3 cm的試管苗放入38 ℃ 16 h光照和25 ℃ 8 h黑暗的培養(yǎng)箱中熱處理42 d后，切取莖尖0.3～0.5 mm，接種于含5 mg/L病毒唑的分化培養(yǎng)基上，脫毒率最高達(dá)67.5%[29]。

綜上所述，單一的脫毒處理技術(shù)難以完全脫除病毒，或需要較長(zhǎng)的時(shí)間，熱處理+莖尖培養(yǎng)+抗病毒藥劑的綜合脫毒技術(shù)是目前生產(chǎn)無(wú)毒百合種球最佳的途徑。