蠟樣芽孢桿菌啟動子片段克隆及轉錄活性分析

張婷婷　馬磊

摘要：為研究蠟樣芽孢桿菌基因的轉錄調控特征，通過鳥槍法和藍白斑篩選，獲得57個蠟樣芽孢桿菌啟動子片段，并以β-半乳糖苷酶為報告基因，比較了這些啟動子片段在大腸埃希菌中的轉錄活性。對轉錄活性較高的4個啟動子克隆片斷進行測序、序列比對、特征分析，發(fā)現(xiàn)這4個克隆序列具有啟動子元件、核糖體結合序列特征，其中2個克隆序列在枯草芽孢桿菌也表現(xiàn)出活性，表明兼有蠟樣芽孢桿菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌RNA聚合酶σ因子序列識別特征。

關鍵詞：啟動子；隨機克??；蠟樣芽孢桿菌；枯草芽孢桿菌

中圖分類號： Q933 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）04-0025-03

收稿日期：2013-11-01

基金項目：國家自然科學基金（編號：31272416）；石河子大學高層次人才科研啟動專項（編號：RCZX201137）；石河子大學優(yōu)秀青年項目（編號：2012ZRKXYQ13）。

作者簡介：張婷婷（1984—），女，新疆石河子人，碩士，講師，主要從事微生物生態(tài)研究。E-mail：120978935@qq.com。

通信作者：馬磊，博士，副教授，主要從事生物信息學與分子遺傳研究。E-mail：mlei@shzu.edu.cn。蠟樣芽孢桿菌屬兼性厭氧微生物，可產生毒素引發(fā)嘔吐、腹瀉等腸胃疾病，嚴重威脅食品業(yè)[1]和飼養(yǎng)業(yè)。然而，蠟樣芽孢桿菌也可分泌抗菌物質，抑制有害微生物生長，降解土壤中的營養(yǎng)成分，改良生態(tài)環(huán)境，其產生的細菌蛋白酶也可被用于麻脫膠、明膠液化、牛奶胨化、還原硝酸鹽、水解淀粉等用途。雖然蠟樣芽孢桿菌典型菌株（ATCC14579）基因組已完成測序[2]，但目前對蠟樣芽孢桿菌基因表達調控系統(tǒng)的研究較少，其內在豐富的遺傳資源有待開發(fā)。本研究利用蠟樣芽孢桿菌（ATCC14579）基因組文庫資源分離、篩選了多個蠟樣芽孢桿菌啟動子序列，分析了其在大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌中的轉錄活性及序列特征，旨在為構建高效表達系統(tǒng)奠定基礎，也為多宿主比較研究提供途徑。

1材料與方法

1.1材料

菌株Bacillus cereus ATCC14579、B.subtilis DB104、Escherichia coli DH5α購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心 （CCTCC）；質粒pE（來自pUC18，攜帶E.coli 質粒復制區(qū)起始，E.coli rep）、pGDV1（攜帶B.subtilis 質粒復制區(qū)起始，B.subtilis rep）、pDL（攜帶β-半乳糖苷酶基因，bgaB）為石河子大學生命科學學院實驗室保存；質粒pEB（E.coli-B.subtilis穿梭載體）、pEB-bgaB 為本研究構建。限制性核酸內切酶、堿性磷酸酶、T4 DNA連接酶購自Promage公司，Taq DNA聚合酶、LA Taq DNA聚合酶購自寶生物工程（大連）有限公司，質粒提取、DNA回收試劑盒購自杭州維特潔生化技術有限公司。引物見表1。

1.2方法

1.2.1啟動子探測載體的構建質粒pGDV1攜帶1段枯草桿菌質粒復制起始區(qū)（B.subtilis rep），通過PCR技術得到該序列（5′端設置BglⅡ位點，3′端設置SacⅠ位點）。在質粒pE基礎上，在BglⅡ、SacⅠ之間插入枯草桿菌質粒復制起始區(qū)（B.subtilis rep），構建大腸埃希菌-枯草桿菌穿梭載體pEB，酶切鑒定。

5），與枯草桿菌σA（σ43）識別序列-35區(qū)、-10區(qū)有較高同源性，因此其在枯草桿菌中可能由σA起始轉錄。雖然C1、C2、C5可能具有同源性較高的-10區(qū)，但-35區(qū)不太典型。

3結論與討論

本研究構建了以β-半乳糖苷酶（bgaB）[5]為報告基因，在大腸埃希菌、枯草桿菌中均能穩(wěn)定復制的啟動子探測載體（圖1）。該載體所攜帶的bgaB基因不含啟動子和核糖體結合序列，且在其起始密碼子（ATG）上游具有多個酶切位點（NotⅠ、BamHⅠ、PstⅠ），有利于啟動子序列的克隆操作。以往研究中啟動子克隆載體多以抗生素和綠色熒光蛋白（GFP）為報告基因，但是利用抗生素作為啟動子篩選和檢測指標，會因宿主菌產生的耐藥性引起假陽性，檢測數(shù)據(jù)高于真實值；利用綠色熒光蛋白對設備的要求比較高。bgaB對宿主細胞生長影響較小，可特異性分解X-gal生成藍色菌落，便于篩選。

本研究應用啟動子隨機克隆、藍白斑篩選、β-半乳糖苷酶酶活檢測，成功獲得了4個在E.coli中具有較高轉錄、表達活性的蠟樣芽孢桿菌啟動子序列，而且其中2個還能在枯草桿菌中轉錄和表達，因此它們具有多宿主RNA聚合酶σ因子序列識別特征。

參考文獻：

[1]Monika E S，Martina F，Siegfried S，et al. Bacilus cereus，the causative agent of an emetic type of food-borne illness[J]. Molecular Nutrition & Food Research，2004，48（7）：479-487.

[2]Ivanova N，Sorokin A，Anderson I，et al. Genome sequence of Bacillus cereus and comparative analysis with Bacillus anthracis[J]. Nature，2003，423（6935）：87-91.

[3]Yuan G，Wong S L. Regulation of groE expression in Bacillus subtilis：the involvement of the sigma A-like promoter and the roles of the inverted repeat sequence （CIRCE）[J]. Journal of Bacteriology，1995，177（19）：5427-5433.

[4]Cutting S，Vander H. Genetic analysis，in C. R. harwood and S. M. cutting （ed.），molecular biological methods for Bacillus[M]. Chichester：John Wiley，1990：24-27.

[5]Hirata H，F(xiàn)ukazawa T，Negoro S，et al. Structure of a beta-galactosidase gene of Bacillus stearothermophilus[J]. Journal of Bacteriology，1986，166（3）：722-727.

摘要：為研究蠟樣芽孢桿菌基因的轉錄調控特征，通過鳥槍法和藍白斑篩選，獲得57個蠟樣芽孢桿菌啟動子片段，并以β-半乳糖苷酶為報告基因，比較了這些啟動子片段在大腸埃希菌中的轉錄活性。對轉錄活性較高的4個啟動子克隆片斷進行測序、序列比對、特征分析，發(fā)現(xiàn)這4個克隆序列具有啟動子元件、核糖體結合序列特征，其中2個克隆序列在枯草芽孢桿菌也表現(xiàn)出活性，表明兼有蠟樣芽孢桿菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌RNA聚合酶σ因子序列識別特征。

關鍵詞：啟動子；隨機克隆；蠟樣芽孢桿菌；枯草芽孢桿菌

中圖分類號： Q933 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）04-0025-03

收稿日期：2013-11-01

基金項目：國家自然科學基金（編號：31272416）；石河子大學高層次人才科研啟動專項（編號：RCZX201137）；石河子大學優(yōu)秀青年項目（編號：2012ZRKXYQ13）。

作者簡介：張婷婷（1984—），女，新疆石河子人，碩士，講師，主要從事微生物生態(tài)研究。E-mail：120978935@qq.com。

通信作者：馬磊，博士，副教授，主要從事生物信息學與分子遺傳研究。E-mail：mlei@shzu.edu.cn。蠟樣芽孢桿菌屬兼性厭氧微生物，可產生毒素引發(fā)嘔吐、腹瀉等腸胃疾病，嚴重威脅食品業(yè)[1]和飼養(yǎng)業(yè)。然而，蠟樣芽孢桿菌也可分泌抗菌物質，抑制有害微生物生長，降解土壤中的營養(yǎng)成分，改良生態(tài)環(huán)境，其產生的細菌蛋白酶也可被用于麻脫膠、明膠液化、牛奶胨化、還原硝酸鹽、水解淀粉等用途。雖然蠟樣芽孢桿菌典型菌株（ATCC14579）基因組已完成測序[2]，但目前對蠟樣芽孢桿菌基因表達調控系統(tǒng)的研究較少，其內在豐富的遺傳資源有待開發(fā)。本研究利用蠟樣芽孢桿菌（ATCC14579）基因組文庫資源分離、篩選了多個蠟樣芽孢桿菌啟動子序列，分析了其在大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌中的轉錄活性及序列特征，旨在為構建高效表達系統(tǒng)奠定基礎，也為多宿主比較研究提供途徑。

1材料與方法

1.1材料

菌株Bacillus cereus ATCC14579、B.subtilis DB104、Escherichia coli DH5α購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心 （CCTCC）；質粒pE（來自pUC18，攜帶E.coli 質粒復制區(qū)起始，E.coli rep）、pGDV1（攜帶B.subtilis 質粒復制區(qū)起始，B.subtilis rep）、pDL（攜帶β-半乳糖苷酶基因，bgaB）為石河子大學生命科學學院實驗室保存；質粒pEB（E.coli-B.subtilis穿梭載體）、pEB-bgaB 為本研究構建。限制性核酸內切酶、堿性磷酸酶、T4 DNA連接酶購自Promage公司，Taq DNA聚合酶、LA Taq DNA聚合酶購自寶生物工程（大連）有限公司，質粒提取、DNA回收試劑盒購自杭州維特潔生化技術有限公司。引物見表1。

1.2方法

1.2.1啟動子探測載體的構建質粒pGDV1攜帶1段枯草桿菌質粒復制起始區(qū)（B.subtilis rep），通過PCR技術得到該序列（5′端設置BglⅡ位點，3′端設置SacⅠ位點）。在質粒pE基礎上，在BglⅡ、SacⅠ之間插入枯草桿菌質粒復制起始區(qū)（B.subtilis rep），構建大腸埃希菌-枯草桿菌穿梭載體pEB，酶切鑒定。

5），與枯草桿菌σA（σ43）識別序列-35區(qū)、-10區(qū)有較高同源性，因此其在枯草桿菌中可能由σA起始轉錄。雖然C1、C2、C5可能具有同源性較高的-10區(qū)，但-35區(qū)不太典型。

3結論與討論

本研究構建了以β-半乳糖苷酶（bgaB）[5]為報告基因，在大腸埃希菌、枯草桿菌中均能穩(wěn)定復制的啟動子探測載體（圖1）。該載體所攜帶的bgaB基因不含啟動子和核糖體結合序列，且在其起始密碼子（ATG）上游具有多個酶切位點（NotⅠ、BamHⅠ、PstⅠ），有利于啟動子序列的克隆操作。以往研究中啟動子克隆載體多以抗生素和綠色熒光蛋白（GFP）為報告基因，但是利用抗生素作為啟動子篩選和檢測指標，會因宿主菌產生的耐藥性引起假陽性，檢測數(shù)據(jù)高于真實值；利用綠色熒光蛋白對設備的要求比較高。bgaB對宿主細胞生長影響較小，可特異性分解X-gal生成藍色菌落，便于篩選。

本研究應用啟動子隨機克隆、藍白斑篩選、β-半乳糖苷酶酶活檢測，成功獲得了4個在E.coli中具有較高轉錄、表達活性的蠟樣芽孢桿菌啟動子序列，而且其中2個還能在枯草桿菌中轉錄和表達，因此它們具有多宿主RNA聚合酶σ因子序列識別特征。

參考文獻：

[1]Monika E S，Martina F，Siegfried S，et al. Bacilus cereus，the causative agent of an emetic type of food-borne illness[J]. Molecular Nutrition & Food Research，2004，48（7）：479-487.

[2]Ivanova N，Sorokin A，Anderson I，et al. Genome sequence of Bacillus cereus and comparative analysis with Bacillus anthracis[J]. Nature，2003，423（6935）：87-91.

[3]Yuan G，Wong S L. Regulation of groE expression in Bacillus subtilis：the involvement of the sigma A-like promoter and the roles of the inverted repeat sequence （CIRCE）[J]. Journal of Bacteriology，1995，177（19）：5427-5433.

[4]Cutting S，Vander H. Genetic analysis，in C. R. harwood and S. M. cutting （ed.），molecular biological methods for Bacillus[M]. Chichester：John Wiley，1990：24-27.

[5]Hirata H，F(xiàn)ukazawa T，Negoro S，et al. Structure of a beta-galactosidase gene of Bacillus stearothermophilus[J]. Journal of Bacteriology，1986，166（3）：722-727.

摘要：為研究蠟樣芽孢桿菌基因的轉錄調控特征，通過鳥槍法和藍白斑篩選，獲得57個蠟樣芽孢桿菌啟動子片段，并以β-半乳糖苷酶為報告基因，比較了這些啟動子片段在大腸埃希菌中的轉錄活性。對轉錄活性較高的4個啟動子克隆片斷進行測序、序列比對、特征分析，發(fā)現(xiàn)這4個克隆序列具有啟動子元件、核糖體結合序列特征，其中2個克隆序列在枯草芽孢桿菌也表現(xiàn)出活性，表明兼有蠟樣芽孢桿菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌RNA聚合酶σ因子序列識別特征。

關鍵詞：啟動子；隨機克?。幌灅友挎邨U菌；枯草芽孢桿菌

中圖分類號： Q933 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）04-0025-03

收稿日期：2013-11-01

基金項目：國家自然科學基金（編號：31272416）；石河子大學高層次人才科研啟動專項（編號：RCZX201137）；石河子大學優(yōu)秀青年項目（編號：2012ZRKXYQ13）。

作者簡介：張婷婷（1984—），女，新疆石河子人，碩士，講師，主要從事微生物生態(tài)研究。E-mail：120978935@qq.com。

通信作者：馬磊，博士，副教授，主要從事生物信息學與分子遺傳研究。E-mail：mlei@shzu.edu.cn。蠟樣芽孢桿菌屬兼性厭氧微生物，可產生毒素引發(fā)嘔吐、腹瀉等腸胃疾病，嚴重威脅食品業(yè)[1]和飼養(yǎng)業(yè)。然而，蠟樣芽孢桿菌也可分泌抗菌物質，抑制有害微生物生長，降解土壤中的營養(yǎng)成分，改良生態(tài)環(huán)境，其產生的細菌蛋白酶也可被用于麻脫膠、明膠液化、牛奶胨化、還原硝酸鹽、水解淀粉等用途。雖然蠟樣芽孢桿菌典型菌株（ATCC14579）基因組已完成測序[2]，但目前對蠟樣芽孢桿菌基因表達調控系統(tǒng)的研究較少，其內在豐富的遺傳資源有待開發(fā)。本研究利用蠟樣芽孢桿菌（ATCC14579）基因組文庫資源分離、篩選了多個蠟樣芽孢桿菌啟動子序列，分析了其在大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌中的轉錄活性及序列特征，旨在為構建高效表達系統(tǒng)奠定基礎，也為多宿主比較研究提供途徑。

1材料與方法

1.1材料

菌株Bacillus cereus ATCC14579、B.subtilis DB104、Escherichia coli DH5α購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心 （CCTCC）；質粒pE（來自pUC18，攜帶E.coli 質粒復制區(qū)起始，E.coli rep）、pGDV1（攜帶B.subtilis 質粒復制區(qū)起始，B.subtilis rep）、pDL（攜帶β-半乳糖苷酶基因，bgaB）為石河子大學生命科學學院實驗室保存；質粒pEB（E.coli-B.subtilis穿梭載體）、pEB-bgaB 為本研究構建。限制性核酸內切酶、堿性磷酸酶、T4 DNA連接酶購自Promage公司，Taq DNA聚合酶、LA Taq DNA聚合酶購自寶生物工程（大連）有限公司，質粒提取、DNA回收試劑盒購自杭州維特潔生化技術有限公司。引物見表1。

1.2方法

1.2.1啟動子探測載體的構建質粒pGDV1攜帶1段枯草桿菌質粒復制起始區(qū)（B.subtilis rep），通過PCR技術得到該序列（5′端設置BglⅡ位點，3′端設置SacⅠ位點）。在質粒pE基礎上，在BglⅡ、SacⅠ之間插入枯草桿菌質粒復制起始區(qū)（B.subtilis rep），構建大腸埃希菌-枯草桿菌穿梭載體pEB，酶切鑒定。

5），與枯草桿菌σA（σ43）識別序列-35區(qū)、-10區(qū)有較高同源性，因此其在枯草桿菌中可能由σA起始轉錄。雖然C1、C2、C5可能具有同源性較高的-10區(qū)，但-35區(qū)不太典型。

3結論與討論

本研究構建了以β-半乳糖苷酶（bgaB）[5]為報告基因，在大腸埃希菌、枯草桿菌中均能穩(wěn)定復制的啟動子探測載體（圖1）。該載體所攜帶的bgaB基因不含啟動子和核糖體結合序列，且在其起始密碼子（ATG）上游具有多個酶切位點（NotⅠ、BamHⅠ、PstⅠ），有利于啟動子序列的克隆操作。以往研究中啟動子克隆載體多以抗生素和綠色熒光蛋白（GFP）為報告基因，但是利用抗生素作為啟動子篩選和檢測指標，會因宿主菌產生的耐藥性引起假陽性，檢測數(shù)據(jù)高于真實值；利用綠色熒光蛋白對設備的要求比較高。bgaB對宿主細胞生長影響較小，可特異性分解X-gal生成藍色菌落，便于篩選。

本研究應用啟動子隨機克隆、藍白斑篩選、β-半乳糖苷酶酶活檢測，成功獲得了4個在E.coli中具有較高轉錄、表達活性的蠟樣芽孢桿菌啟動子序列，而且其中2個還能在枯草桿菌中轉錄和表達，因此它們具有多宿主RNA聚合酶σ因子序列識別特征。

參考文獻：

[1]Monika E S，Martina F，Siegfried S，et al. Bacilus cereus，the causative agent of an emetic type of food-borne illness[J]. Molecular Nutrition & Food Research，2004，48（7）：479-487.

[2]Ivanova N，Sorokin A，Anderson I，et al. Genome sequence of Bacillus cereus and comparative analysis with Bacillus anthracis[J]. Nature，2003，423（6935）：87-91.

[3]Yuan G，Wong S L. Regulation of groE expression in Bacillus subtilis：the involvement of the sigma A-like promoter and the roles of the inverted repeat sequence （CIRCE）[J]. Journal of Bacteriology，1995，177（19）：5427-5433.

[4]Cutting S，Vander H. Genetic analysis，in C. R. harwood and S. M. cutting （ed.），molecular biological methods for Bacillus[M]. Chichester：John Wiley，1990：24-27.

[5]Hirata H，F(xiàn)ukazawa T，Negoro S，et al. Structure of a beta-galactosidase gene of Bacillus stearothermophilus[J]. Journal of Bacteriology，1986，166（3）：722-727.