β—catenin在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床意義

王敏++++++樸金松++++++高蔚櫻++++++鄭一瑋++++++譚小軍

[摘要] 目的 探討肝細(xì)胞癌肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）β-catenin的表達(dá)與HCC臨床病理特征的關(guān)系。方法 應(yīng)用Envsion法檢測(cè)333例HCC，168例癌旁肝組織及89例正常肝組織的β-catenin表達(dá)；RT-PCR檢測(cè)37例HCC及癌旁組織，肝癌細(xì)胞株HepG2和正常肝細(xì)胞株LO2的β-catenin mRNA表達(dá)。結(jié)果 β-catenin在HCC胞質(zhì)、胞核的陽(yáng)性表達(dá)率為79%/37%；在癌旁和正常肝組織中的表達(dá)率為72%/0%、70%/0%。差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.05）。且分化好的癌細(xì)胞表達(dá)低，分化差的細(xì)胞表達(dá)高。同時(shí)，HCC和HepG2的β-catenin mRNA表達(dá)高于癌旁組織及LO2的表達(dá)。結(jié)論 肝細(xì)胞癌的β-catenin過(guò)表達(dá)提示其在癌的發(fā)生過(guò)程中可能起著促癌的作用。

[關(guān)鍵詞] β-catenin；肝細(xì)胞癌；組織芯片；免疫組織化學(xué)；RT-PCR

[中圖分類號(hào)] R735.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2014）13-0031-04

Wnt/β-catenin信號(hào)途徑調(diào)節(jié)控制著許多生命過(guò)程，包括生物體的生長(zhǎng)、發(fā)育、疾病、衰老與死亡等。同時(shí)，Wnt/β-catenin信號(hào)途徑也與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，有十幾種目前已知的高發(fā)性癌變?cè)从赪nt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的失調(diào)[1]。β-catenin是Wnt信號(hào)途徑中具轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的關(guān)鍵成員，β-catenin能在細(xì)胞核內(nèi)與Wnt途徑的另一類成員LEF1/TCFs 結(jié)合從而激活靶基因的轉(zhuǎn)錄。β-catenin在正常成體細(xì)胞胞漿內(nèi)含量少，而在腫瘤中常出現(xiàn)胞漿內(nèi)累積和核內(nèi)表達(dá)。因此，本研究擬通過(guò)檢測(cè)β-catenin在大樣本肝細(xì)胞癌病例中的表達(dá)，并對(duì)其陽(yáng)性表達(dá)與肝細(xì)胞癌的臨床病理特征進(jìn)行分析，探討其在肝細(xì)胞癌發(fā)生和發(fā)展中的作用，以期進(jìn)一步闡明肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

石蠟標(biāo)本：收集廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科1998年1月～2008年1月明確診斷的肝細(xì)胞癌標(biāo)本333例、癌旁肝組織168例及正常肝組織89例。每例患者均登記臨床病理資料，包括年齡、性別、癌灶大小、HBs-Ag 狀態(tài)、有無(wú)門靜脈癌栓形成、血清AFP水平，腫瘤分級(jí)情況、TMN分期。

組織標(biāo)本與細(xì)胞株：收集廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2010年～2011年外科手術(shù)切除的新鮮肝細(xì)胞癌組織及其對(duì)應(yīng)的癌旁非腫瘤組織共37例，其中男32例，女5例，年齡25～73歲，平均50.1歲。肝細(xì)胞癌細(xì)胞株HepG2，肝正常細(xì)胞株LO2均為廣州醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所保存。

1.2 主要試劑

β-catenin抗體（鼠抗人單克隆抗體，美國(guó)Transduction laboratories，clone 14），EnvisionTM試劑盒（K5007）購(gòu)自DAKO公司；TRIzol Reagent（美國(guó)invitrogen），RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（美國(guó)MBI）。

1.3 方法

采用免疫組化Envision法及RT-PCR法進(jìn)行檢測(cè)，具體實(shí)驗(yàn)步驟參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.4 結(jié)果判斷

染色結(jié)果判斷：β-catenin陽(yáng)性染色部位為胞膜、胞質(zhì)和胞核。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)采用綜合陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比和著色強(qiáng)度進(jìn)行判斷[2]。陽(yáng)性細(xì)胞著色程度按輕、中及重度染色分別計(jì)為1、2、3分。陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比積分如下：0分為陽(yáng)性細(xì)胞比例<5%，1分為6%～25%，2分為26%～50%，3分為51%～75%，4分為>76%。然后根據(jù)兩項(xiàng)評(píng)分乘積判斷結(jié)果。

RNA結(jié)果分析：采用圖像分析軟件Gensnap對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行半定量分析，計(jì)算目的基因和內(nèi)參基因的灰度比值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行處理。采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 β-catenin蛋白的表達(dá)

β-catenin蛋白在胞膜的陽(yáng)性表達(dá)率是70%（234/333）；在癌旁和正常肝組織的表達(dá)率分別是60%（100/168）和65%（58/89）。β-catenin在非癌組織中的膜表達(dá)低于在癌組織中的膜表達(dá)（封三圖4A、C、D）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，肝細(xì)胞癌中β-catenin膜的表達(dá)與在非腫瘤組織中膜的表達(dá)兩兩比較有顯著性差異（癌旁，P=0.000；正常肝組織，P=0.000）； β-catenin胞質(zhì)的陽(yáng)性表達(dá)率是79%（262/333）；在癌旁和正常肝組織中的表達(dá)率分別是72%（122/168）和70%（62/89）。β-catenin在非癌組織中的胞質(zhì)表達(dá)低于在癌組織中的表達(dá)（封三圖4A、C、D）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，肝細(xì)胞癌中β-catenin胞質(zhì)的表達(dá)與在非腫瘤組織中胞質(zhì)的表達(dá)兩兩比較有顯著性差異（癌旁，P=0.000； 正常肝組織，P=0.000）； β-catenin蛋白在胞核的陽(yáng)性表達(dá)率是37%（123/333），在非癌組織中無(wú)核表達(dá)（封三圖4B）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，肝細(xì)胞癌中β-catenin胞核表達(dá)與在非腫瘤組織中核表達(dá)兩兩比較有顯著性差異（癌旁，P=0.000； 正常肝組織，P=0.000）。

2.2 β-catenin mRNA的表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了37例肝細(xì)胞癌及對(duì)應(yīng)的癌旁非腫瘤組織中β-catenin mRNA的表達(dá)。β-catenin mRNA在癌旁非腫瘤組織的表達(dá)明顯低于其在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)（圖1）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，β-catenin mRNA在肝細(xì)胞癌組織和癌旁非腫瘤組織中的表達(dá)量有顯著性差異（P=0.001）。本實(shí)驗(yàn)也檢測(cè)了β-catenin mRNA在肝癌細(xì)胞株HepG2和正常肝細(xì)胞株LO2的表達(dá)。β-catenin mRNA在HepG2的表達(dá)明顯高于其在LO2的表達(dá)（圖1）。

A：肝細(xì)胞癌（T）及對(duì)應(yīng)的癌旁非腫瘤組織（P）中β-catenin mRNA的表達(dá)；B：1.正常肝細(xì)胞株LO2中未檢測(cè)出β-catenin mRNA的表達(dá)；2.肝細(xì)胞癌細(xì)胞株HepG2中β-catenin mRNA 過(guò)表達(dá)

圖1 β-catenin mRNA的表達(dá)

2.3 β-catenin蛋白的表達(dá)與肝細(xì)胞癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

β-catenin胞質(zhì)表達(dá)與腫瘤細(xì)胞分化密切相關(guān)（P=0.031），隨著細(xì)胞的分化程度降低而增加。與年齡、性別、AFP值、腫瘤大小、HBs-Ag 感染、門靜脈癌栓和TNM分期無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。β-catenin蛋白核表達(dá)與HBV 感染密切相關(guān)（強(qiáng)度，P=0.028；百分比，P=0.026），與細(xì)胞分化程度相關(guān)（P=0.023），β-catenin蛋白核表達(dá)隨著細(xì)胞分化程度的降低而增加。與年齡、性別、AFP值、腫瘤大小、門靜脈癌栓和TNM分期比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

3 討論

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率地區(qū)差異很大，常見(jiàn)于亞洲和非洲國(guó)家。HCC的發(fā)生是一個(gè)多階段、多因素協(xié)同作用，經(jīng)過(guò)啟動(dòng)、促癌和演進(jìn)等多步驟過(guò)程以及多個(gè)癌基因和相關(guān)基因參與、多個(gè)基因發(fā)生突變的結(jié)果。有研究顯示，β-catenin基因外顯子3突變?cè)诟伟┲惺穷l發(fā)事件，可達(dá)62.5%，其突變可使β-catenin穩(wěn)定化，促進(jìn)肝癌的發(fā)生[3]。

正常情況下β-catenin主要與細(xì)胞膜上E-cadherin結(jié)合參與細(xì)胞黏附作用，細(xì)胞內(nèi)的β-catenin與糖原合成酶激酶3（GSK-3），結(jié)直腸腺瘤息肉蛋白（APC）和軸蛋白（Axin）結(jié)合，形成多聚蛋白復(fù)合體。并在APC和GSK-3β等作用下很快降解，不會(huì)形成聚集。當(dāng)Wnt蛋白與胞膜受體結(jié)合后抑制GSK-3激活，阻止β-catenin多聚蛋白復(fù)合體的形成，β-catenin降解減少?gòu)亩M(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)形成β-catenin-Tcf/Lef復(fù)合體，調(diào)控下游靶基因的表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。如乳腺癌、食管癌、結(jié)直腸癌、惡性黑色素瘤、白血病、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌、原發(fā)性肝癌、甲狀腺癌、胰腺癌等惡性腫瘤中都有Wnt/β-catenin通路異常[4]。

Lai等[5]研究結(jié)果顯示β-catenin mRNA在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)明顯高于癌旁肝組織，免疫組化結(jié)果亦顯示β-catenin異常累積出現(xiàn)在肝細(xì)胞癌細(xì)胞胞核中； Austinat等[6]的研究顯示，在53例肝細(xì)胞癌標(biāo)本中有42例呈胞質(zhì)/胞核陽(yáng)性表達(dá)；Inagawa的研究亦表明[7]β-catenin 在肝癌中呈局部或廣泛核內(nèi)表達(dá)，其核陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)35.3%，在癌旁非腫瘤組織中無(wú)胞核表達(dá)。Higgs MR等[8]的研究顯示HCV型肝炎病毒誘導(dǎo)活化的β-catenin促進(jìn)c-Myc基因的表達(dá)，表明β-catenin與HCV相關(guān)肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。Evason KJ等[9]研究發(fā)現(xiàn)β-catenin在非典型肝細(xì)胞腺瘤樣腫瘤與高分化肝細(xì)胞癌中的激活都有相似的形態(tài)學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)的改變，提示β-catenin在肝細(xì)胞癌發(fā)生的早期發(fā)生改變。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，β-catenin在癌旁肝組織和正常肝組織中中主要聚集在肝細(xì)胞膜，在大樣本肝細(xì)胞癌組織中β-catenin胞質(zhì)/核表達(dá)明顯升高，核表達(dá)陽(yáng)性率為37%。RT-PCR結(jié)果顯示β-catenin mRNA在癌組織表達(dá)高，在非腫瘤組織中表達(dá)低；在肝癌細(xì)胞株HepG2表達(dá)高，在正常肝細(xì)胞株LO2表達(dá)低。與王啟明等[10]的研究結(jié)果一致，亦提示β-catenin的激活與肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展密切關(guān)系。

HCC的眾多臨床病理參數(shù)都與其生物學(xué)行為或預(yù)后存在著一定的聯(lián)系。徐兵等[11]研究發(fā)現(xiàn)，β-catenin的異位表達(dá)與腫瘤的分級(jí)密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，β-catenin胞質(zhì)/核的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞分化程度和HBs-Ag狀態(tài)（status）顯著相關(guān)；β-catenin在分化差的細(xì)胞質(zhì)/核表達(dá)高，分化好的細(xì)胞質(zhì)/核表達(dá)低。β-catenin作為Wnt/β-catenin通路的關(guān)鍵成員，對(duì)細(xì)胞的分化有重要影響。Witjes CD等[12]研究表明β-catenin蛋白在胞質(zhì)和核內(nèi)的積聚與肝細(xì)胞癌細(xì)胞分化相關(guān)，低分化細(xì)胞表達(dá)升高，高分化細(xì)胞中減低。因此，本研究結(jié)果提示β-catenin蛋白的異常積聚過(guò)程伴隨著細(xì)胞分化程度的降低，參與了肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Surana R，Sikka S，Cai W，et al. Secreted frizzled related proteins： Implications in cancers[J]. Biochim Biophys Acta，2013，1845（1）：53-65.

[2] Chengquan Z，Ross B，Russell V，et al. Diagnostic utility of WT1 immunostaining in ovarian sertoli cell tumor[J]. Am J Surg Pathol，2007，31：1378-1384.

[3] Lachenmayer A，Alsinet C，Savic R，et al. Wnt-pathway activation in two molecular classes of hepatocellular carcinoma and experimental modulation by sorafenib[J]. Clin Cancer Res，2012，18（18）：4997-5007.

[4] Klaus A，Birchmeier W. Wnt signalling and its impact on development and cancer[J]. Nat Rev Cancer，2008，8（5）：387-398.

[5] Lai TY，Su CC，Kuo WW，et al. β-catenin plays a key role in metastasis of human hepatocellular carcinoma[J]. Oncol Rep，2011，26（2）：415-422.

[6] Austinat M，Dunsch R，Gaunitz F，et al. Correlation between beta-catenin mutations and expression of Wnt-signaling target genes in hepatocellular carcinoma[J]. Mol Cancer，2008，7（21）：1-9.

[7] Inagawa S，Itabashi M，F(xiàn)ukao K，et al. Expression and prognostic roles of β-catenin in hepatocellular carcinoma[J]. Clin Cancer Res，2002，8（2）：450-456.

[8] Higgs MR，Lerat H，Pawlotsky JM. Hepatitis C virus-induced activation of β-catenin promotes c-Myc expression and a cascade of pro-carcinogenetic events[J]. Oncogene，2013，32（39）：4683-4693.

[9] Evason KJ，Grenert JP，F(xiàn)errell LD， et al. Atypical hepatocellular adenoma-like neoplasms with β-catenin activation show cytogenetic alterations similar to well-differentiated hepatocellular carcinomas[J]. Hum Pathol，2013，44（5）：750-758.

[10] 王啟明，賈連群，周鴻鷹，等. Wnt/β-catenin 信號(hào)因子在HepG2以及LO2細(xì)胞中的表達(dá)[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2007，32（8）：826-829.

[11] 徐兵，羅慶豐，江凌玲，等. 肝細(xì)胞肝癌β-catenin的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[J].江西醫(yī)藥，2011，46（12）：1072-1074.

[12] Witjes CD， Ten Kate FJ， Verhoef C， et al. Immunohis to chemical characteristics of hepatocellular carcinoma in non-cirrhotic livers[J]. J Clin Pathol，2013，66（8）：687-691.

（收稿日期：2013-11-06）

[5] Lai TY，Su CC，Kuo WW，et al. β-catenin plays a key role in metastasis of human hepatocellular carcinoma[J]. Oncol Rep，2011，26（2）：415-422.

[6] Austinat M，Dunsch R，Gaunitz F，et al. Correlation between beta-catenin mutations and expression of Wnt-signaling target genes in hepatocellular carcinoma[J]. Mol Cancer，2008，7（21）：1-9.

[7] Inagawa S，Itabashi M，F(xiàn)ukao K，et al. Expression and prognostic roles of β-catenin in hepatocellular carcinoma[J]. Clin Cancer Res，2002，8（2）：450-456.

[8] Higgs MR，Lerat H，Pawlotsky JM. Hepatitis C virus-induced activation of β-catenin promotes c-Myc expression and a cascade of pro-carcinogenetic events[J]. Oncogene，2013，32（39）：4683-4693.

[9] Evason KJ，Grenert JP，F(xiàn)errell LD， et al. Atypical hepatocellular adenoma-like neoplasms with β-catenin activation show cytogenetic alterations similar to well-differentiated hepatocellular carcinomas[J]. Hum Pathol，2013，44（5）：750-758.

[10] 王啟明，賈連群，周鴻鷹，等. Wnt/β-catenin 信號(hào)因子在HepG2以及LO2細(xì)胞中的表達(dá)[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2007，32（8）：826-829.

[11] 徐兵，羅慶豐，江凌玲，等. 肝細(xì)胞肝癌β-catenin的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[J].江西醫(yī)藥，2011，46（12）：1072-1074.

[12] Witjes CD， Ten Kate FJ， Verhoef C， et al. Immunohis to chemical characteristics of hepatocellular carcinoma in non-cirrhotic livers[J]. J Clin Pathol，2013，66（8）：687-691.

（收稿日期：2013-11-06）

[5] Lai TY，Su CC，Kuo WW，et al. β-catenin plays a key role in metastasis of human hepatocellular carcinoma[J]. Oncol Rep，2011，26（2）：415-422.

[6] Austinat M，Dunsch R，Gaunitz F，et al. Correlation between beta-catenin mutations and expression of Wnt-signaling target genes in hepatocellular carcinoma[J]. Mol Cancer，2008，7（21）：1-9.

[7] Inagawa S，Itabashi M，F(xiàn)ukao K，et al. Expression and prognostic roles of β-catenin in hepatocellular carcinoma[J]. Clin Cancer Res，2002，8（2）：450-456.

[8] Higgs MR，Lerat H，Pawlotsky JM. Hepatitis C virus-induced activation of β-catenin promotes c-Myc expression and a cascade of pro-carcinogenetic events[J]. Oncogene，2013，32（39）：4683-4693.

[9] Evason KJ，Grenert JP，F(xiàn)errell LD， et al. Atypical hepatocellular adenoma-like neoplasms with β-catenin activation show cytogenetic alterations similar to well-differentiated hepatocellular carcinomas[J]. Hum Pathol，2013，44（5）：750-758.

[10] 王啟明，賈連群，周鴻鷹，等. Wnt/β-catenin 信號(hào)因子在HepG2以及LO2細(xì)胞中的表達(dá)[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2007，32（8）：826-829.

[11] 徐兵，羅慶豐，江凌玲，等. 肝細(xì)胞肝癌β-catenin的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[J].江西醫(yī)藥，2011，46（12）：1072-1074.

[12] Witjes CD， Ten Kate FJ， Verhoef C， et al. Immunohis to chemical characteristics of hepatocellular carcinoma in non-cirrhotic livers[J]. J Clin Pathol，2013，66（8）：687-691.

（收稿日期：2013-11-06）