在高糖條件下錳超氧化物歧化酶刺激MSC提高血管內(nèi)皮細胞活性的研究

張鵬　紀(jì)亮　沈雷　王玉　李萌　劉琰

[摘要] 目的 觀察高糖環(huán)境下，錳超氧化物歧化酶（MnSOD）刺激間充質(zhì)干細胞（MSC）上清液對人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞（HUVEC）增殖和趨化能力的影響。 方法 高糖MSC培養(yǎng)基條件下，100μg/L MnSOD刺激的MSC為實驗組，未刺激的MSC為對照組，添加Akt阻斷劑5μmol/L Tricirlbine為Akt阻斷劑組，利用各組條件培養(yǎng)基在高糖1640培養(yǎng)基條件下，培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC），使用MTT法觀察各條件培養(yǎng)基對HUVEC增殖的影響，并利用細胞劃痕實驗和Transwell細胞遷移實驗對HUVEC的趨化情況進行評估。 結(jié)果 與對照組相比，MSC實驗組條件培養(yǎng)基促進HUVEC增殖；但是Akt阻斷劑組HUVEC增殖能力降低；MSC實驗組條件培養(yǎng)基作用的HUVEC趨化活動與對照組相比明顯提高，但MSC實驗組HUVEC趨化活動在Akt阻斷劑組明顯被抑制；MSC實驗組條件培養(yǎng)基中VEGF含量比對照組明顯提高。結(jié)論 高糖條件下MnSOD可以通過刺激間充質(zhì)干細胞旁分泌VEGF等細胞因子對血管內(nèi)皮細胞增殖、趨化等能力產(chǎn)生影響。

[關(guān)鍵詞] 間充質(zhì)干細胞；錳超氧化物歧化酶；旁分泌；人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞

[中圖分類號] R329.2 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2014）13-0013-03

全球糖尿病患者到2035年將增加5.92億[1]。高血糖增加活性氧，致使皮膚血管內(nèi)皮細胞代謝紊亂 [2]。MSC移植到糖尿病足傷口，可以加速傷口愈合[3]，MnSOD在對抗活性氧的過程中發(fā)揮重要作用，如果利用MnSOD發(fā)揮對MSC的抗高糖損傷作用，將達到促進潰瘍區(qū)血管新生之目的，促使MSC細胞療法的廣泛臨床應(yīng)用具有重要意義[4]。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)和分組

人骨髓間充質(zhì)干細胞（MSC）和人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）分別在正?；蚋咛荕SC培養(yǎng)基中培養(yǎng)MSC為對照組，或添加100mmol/L MnSOD為實驗組（MnSOD-MSC），添加5μmol/l Tricirlbine為Akt阻斷劑組。

提取各組細胞上清液為條件培養(yǎng)基（conditioned medium， CM），分別為MSC對照組、MnSOD-MSC組、Akt阻斷劑組條件培養(yǎng)基。人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）實驗分組按條件培養(yǎng)基而定。

1.2 條件培養(yǎng)基中VEGF、GSHPX、SOD檢測

收集各組MSC條件培養(yǎng)基，使用英國Randox公司生產(chǎn)的ELISA試劑盒測定SOD、GSHPX和VEGF的含量。

1.3 細胞劃痕試驗

HUVEC接種于6孔板，0.1%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，1000μL槍頭劃痕，并添加2mM羥基脲（Sigma），培養(yǎng)24h，采用IPP軟件計算劃痕面積閉合率。

1.4 Transwell細胞遷移實驗

HUVEC用0.1%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，以8×103個細胞/孔接種，放置在Transwell細胞小室內(nèi)，孵箱6h，計算染色的細胞數(shù)目（100×）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS18.0軟件包，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 間充質(zhì)干細胞在高糖環(huán)境下的增殖

正常MSC對照組的OD值為（0.913±0.344），高糖條件下，MSC對照組、MnSOD-MSC組和Akt阻斷劑組的OD值分別為（0.425±0.147）、（1.261±0.579）和（0.635±0.812）。其中正常MSC對照組與高糖條件下MSC對照組、高糖條件下MSC對照組和MnSOD-MSC組、高糖條件下MnSOD-MSC組和Akt阻斷劑組OD值比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。

2.2各組CM對HUVEC增殖影響

高糖條件下，MSC對照組、MnSOD-MSC組和Akt阻斷劑組CM對HUVEC增殖的OD值分別為（0.824±0.176）、（1.590±0.152）和（1.073±0.294），其中前兩組和后兩組分別比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。

2.3 各組CM對HUVEC趨化能力的作用

MnSOD-MSC CM組和MSC CM組HUVEC劃痕閉合面積分別為（0.26±0.15）μm2、（0.19±0.03）μm2，兩者具有顯著差異（P<0.01），見圖1A、B、G；Akt阻斷劑CM組HUVEC劃痕閉合面積為（0.17±0.51）cm2，與MnSOD-MSC CM組比較具有顯著差異（P<0.01），見圖1B、C、G。

MnSOD-MSC CM組和MSC CM組HUVEC遷移數(shù)目分別為（1824.85±10.11）、（928. 64±13.24），兩者具有顯著差異（P<0.01），見圖1D、E、H；Akt阻斷劑CM組HUVEC遷移數(shù)目為（1121.50±21.67），與MnSOD-MSC CM組比較有顯著差異（P<0.01），見圖1E、F、H。

圖1 HUVEC劃痕和遷移結(jié)果

A-C：各組HUVEC細胞劃痕圖（40×），圖框代表0h劃痕面積；D-F：各組CM組HUVEC細胞遷移圖（100×）；G：HUVEC劃痕統(tǒng)計圖，*P<0.01；H：HUVEC遷移統(tǒng)計圖，*P<0.01

2.4 各組CM中細胞因子的檢測

各組條件培養(yǎng)基中VEGF、GSHPX、SOD的檢測，見表1。

表1 各組條件培養(yǎng)基中VEGF、GSHPX、SOD含量（ng/L，n=9，x±s）

3 討論

血管發(fā)生的有關(guān)細胞因子和生長因子密切配合，協(xié)調(diào)統(tǒng)一地參與調(diào)節(jié)血管生成[5]。糖尿病足主要病理變化為局部微血管、神經(jīng)的病理變化，并產(chǎn)生大量自由基[2]。糖尿病小鼠皮膚MnSOD等抗氧化酶活性顯著降低[5]。雖然MSC有正?？寡趸赶到y(tǒng)，但是糖尿病時的MSC細胞活性降低，其分泌的MnSOD等抗自由基酶類降低，影響MSC生物作用[6]。MnSOD基因轉(zhuǎn)染自身骨髓干細胞可以重建損傷性食管炎內(nèi)膜修復(fù)[7]，提示該基因修飾的MSC能夠歸巢到糖尿病傷口，加速傷口愈合[8]。

本實驗結(jié)果表明，高血糖條件下，MnSOD可以促使MSC增殖，發(fā)揮了MnSOD的抗自由基保護細胞的作用，抗高糖效果非常明顯。MnSOD刺激的MSC改善血管內(nèi)皮細胞活性，促進血管內(nèi)皮細胞增殖，并發(fā)揮了促使HUVEC遷移等能力，MnSOD刺激的MSC條件培養(yǎng)基中VEGF、SOD等血管活化因子或抗自由基蛋白表達升高，其機制可能是由于在MnSOD的刺激下，通過Akt途徑活化MSC，促使MSC旁分泌VEGF、SOD等細胞因子，分泌的SOD等物質(zhì)保護血管內(nèi)皮細胞對抗高血糖環(huán)境，而產(chǎn)生的VEGF等因子則對血管內(nèi)皮細胞具有促進成血管的能力，如果將MnSOD刺激的MSC移植到糖尿病足皮膚區(qū)域，可以發(fā)揮對抗自由基、保護細胞、促進血管新生的重要功能，將明顯加速傷口愈合，后續(xù)研究我們將會用MnSOD轉(zhuǎn)染的MSC應(yīng)用于體內(nèi)糖尿病動物足實驗?zāi)Ｐ停^察MnSOD-MSC對糖尿病足愈合的作用和機制，為MSC臨床應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)和資料。

[參考文獻]

[1] L. Guariguata， DR. Whitingb， I. Hambletonc，et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035 for the IDF Diabetes Atlas[J]. Diabetes Research and Clinical Practice，2013， 27（11）：1345-1352.

[2] Gray SP， Di ME， Okabe J， et al. NADPH oxidase 1 plays a key role in diabetes mellitus-accelerated atherosclerosis[J]. Circulation， 2013，127（18）：1888-1902.

[3] Hodgkinson CP， Gomez JA， Mirotsou M， et al. Genetic engineering of mesenchymal stem cells and its application in human disease therapy[J]. Hum Gene Ther， 2010，21（11）：1513-1526.

[4] He T， Peterson TE， Holmuhamedov EL， et al. Human endothelial progenitor cells tolerate oxidative stress due to intrinsically high expression of manganese superoxide dismutase[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004，24（11）：2021-2027.

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[8] Volarevic V， Arsenijevic N， Lukic ML， et al. Concise review： Mesenchymal stem cell treatment of the complications of diabetes mellitus[J]. Stem Cells， 2011，29（1）：5-10.

（收稿日期：2014-02-26）

血管發(fā)生的有關(guān)細胞因子和生長因子密切配合，協(xié)調(diào)統(tǒng)一地參與調(diào)節(jié)血管生成[5]。糖尿病足主要病理變化為局部微血管、神經(jīng)的病理變化，并產(chǎn)生大量自由基[2]。糖尿病小鼠皮膚MnSOD等抗氧化酶活性顯著降低[5]。雖然MSC有正?？寡趸赶到y(tǒng)，但是糖尿病時的MSC細胞活性降低，其分泌的MnSOD等抗自由基酶類降低，影響MSC生物作用[6]。MnSOD基因轉(zhuǎn)染自身骨髓干細胞可以重建損傷性食管炎內(nèi)膜修復(fù)[7]，提示該基因修飾的MSC能夠歸巢到糖尿病傷口，加速傷口愈合[8]。

本實驗結(jié)果表明，高血糖條件下，MnSOD可以促使MSC增殖，發(fā)揮了MnSOD的抗自由基保護細胞的作用，抗高糖效果非常明顯。MnSOD刺激的MSC改善血管內(nèi)皮細胞活性，促進血管內(nèi)皮細胞增殖，并發(fā)揮了促使HUVEC遷移等能力，MnSOD刺激的MSC條件培養(yǎng)基中VEGF、SOD等血管活化因子或抗自由基蛋白表達升高，其機制可能是由于在MnSOD的刺激下，通過Akt途徑活化MSC，促使MSC旁分泌VEGF、SOD等細胞因子，分泌的SOD等物質(zhì)保護血管內(nèi)皮細胞對抗高血糖環(huán)境，而產(chǎn)生的VEGF等因子則對血管內(nèi)皮細胞具有促進成血管的能力，如果將MnSOD刺激的MSC移植到糖尿病足皮膚區(qū)域，可以發(fā)揮對抗自由基、保護細胞、促進血管新生的重要功能，將明顯加速傷口愈合，后續(xù)研究我們將會用MnSOD轉(zhuǎn)染的MSC應(yīng)用于體內(nèi)糖尿病動物足實驗?zāi)Ｐ?，觀察MnSOD-MSC對糖尿病足愈合的作用和機制，為MSC臨床應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)和資料。

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（收稿日期：2014-02-26）

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本實驗結(jié)果表明，高血糖條件下，MnSOD可以促使MSC增殖，發(fā)揮了MnSOD的抗自由基保護細胞的作用，抗高糖效果非常明顯。MnSOD刺激的MSC改善血管內(nèi)皮細胞活性，促進血管內(nèi)皮細胞增殖，并發(fā)揮了促使HUVEC遷移等能力，MnSOD刺激的MSC條件培養(yǎng)基中VEGF、SOD等血管活化因子或抗自由基蛋白表達升高，其機制可能是由于在MnSOD的刺激下，通過Akt途徑活化MSC，促使MSC旁分泌VEGF、SOD等細胞因子，分泌的SOD等物質(zhì)保護血管內(nèi)皮細胞對抗高血糖環(huán)境，而產(chǎn)生的VEGF等因子則對血管內(nèi)皮細胞具有促進成血管的能力，如果將MnSOD刺激的MSC移植到糖尿病足皮膚區(qū)域，可以發(fā)揮對抗自由基、保護細胞、促進血管新生的重要功能，將明顯加速傷口愈合，后續(xù)研究我們將會用MnSOD轉(zhuǎn)染的MSC應(yīng)用于體內(nèi)糖尿病動物足實驗?zāi)Ｐ?，觀察MnSOD-MSC對糖尿病足愈合的作用和機制，為MSC臨床應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)和資料。

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[5] Marrotte EJ， Chen DD， Hakim JS， et al. Manganese superoxide dismutase expression in endothelial progenitor cells accelerates wound healing in diabetic mice[J]. J Clin Invest，2010，120（12）：4207-4219.

[6] Cho KA， Woo SY， Seoh JY， et al. Mesenchymal stem cells restore CCl4-induced liver injury by an antioxidative process[J]. Cell Biol Int， 2012，36（12）：1267-1274.

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[8] Volarevic V， Arsenijevic N， Lukic ML， et al. Concise review： Mesenchymal stem cell treatment of the complications of diabetes mellitus[J]. Stem Cells， 2011，29（1）：5-10.

（收稿日期：2014-02-26）