亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與先天神經(jīng)管缺陷的相關(guān)性研究

2014-07-09 01:01張潔瓊徐東萍

中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生 2014年13期

張潔瓊　徐東萍

[摘要] 目的研究亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與紅細(xì)胞葉酸濃度的關(guān)系。方法采用PCR法對(duì)育齡女性5 128例進(jìn)行亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性分析，并分別給予早孕者400μg、800μg葉酸口服補(bǔ)充1個(gè)月，比較干預(yù)前后紅細(xì)胞葉酸濃度。結(jié)果純合CC型早孕受試者口服400 μg葉酸1個(gè)月后平均紅細(xì)胞葉酸濃度與口服800 μg葉酸者相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >0.05）；突變基因型CT型、TT型早孕受試者差異則均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）。結(jié)論對(duì)育齡婦女開(kāi)展MTHFR基因多態(tài)性檢測(cè)有利于指導(dǎo)補(bǔ)充葉酸劑量，值得臨床進(jìn)一步研究。

[關(guān)鍵詞] 亞甲基四氫葉酸還原酶；基因多態(tài)性；葉酸；神經(jīng)管缺陷

[中圖分類號(hào)] R722.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2014）13-0016-03

出生缺陷的圍生兒中神經(jīng)管缺陷約占21%，占比最高，中國(guó)每年約有8萬(wàn)～10萬(wàn)名神經(jīng)管缺陷兒出生 [1]。隨著近年來(lái)分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，葉酸代謝障礙被認(rèn)為與多種出生缺陷疾病有關(guān)，如神經(jīng)管缺陷、唇腭裂、先天性心臟病和唐氏綜合征等[2]。亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）是葉酸代謝的關(guān)鍵酶，一旦MTHFR基因發(fā)生突變，則導(dǎo)致人體攝入的葉酸無(wú)法轉(zhuǎn)換成有效形式，葉酸利用率下降；MTHFR基因677位核苷酸的多態(tài)性形成了CC、CT和TT 3種基因型，相對(duì)于正常的CC基因型，雜合的CT基因型MTHFR酶活性降低35%，純合的TT基因型活性降低70%。MTHFR基因突變導(dǎo)致酶活性的改變，引起葉酸利用障礙，增加了發(fā)生神經(jīng)管畸形（NTDs）的風(fēng)險(xiǎn)[3]。預(yù)防性補(bǔ)充葉酸防止出生缺陷已經(jīng)得到了世界范圍內(nèi)的認(rèn)可。婦產(chǎn)科醫(yī)師通常按照統(tǒng)一的劑量（400μg）來(lái)建議孕期女性服用葉酸，標(biāo)準(zhǔn)劑量的葉酸補(bǔ)充可能無(wú)法滿足MTHFR基因發(fā)生突變的女性胎兒發(fā)育需要[4]。因此對(duì)孕期女性進(jìn)行基因檢測(cè)以指導(dǎo)臨床個(gè)性化用藥是必要的，本研究擬通過(guò)本地區(qū)育齡女性的MTHFR基因大樣本檢測(cè)，了解該地區(qū)育齡女性MTHFR基因的多態(tài)性分布情況，并探討MTHFR基因多態(tài)性與服用葉酸前后紅細(xì)胞葉酸濃度的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，收集2009年1月～2013年6月期間就診于我院門診的育齡女性，入選標(biāo)準(zhǔn)：育齡期漢族女性，同意抽血化驗(yàn)。病例排除標(biāo)準(zhǔn)：中晚期孕婦；合并慢性肝腎疾病、血液系統(tǒng)病、惡性貧血、胃十二指腸切除術(shù)后、精神障礙性疾病。入選實(shí)驗(yàn)對(duì)象5 128例，其中早孕（孕8～14周）育齡女性753例作為早孕組。

1.2治療干預(yù)方法

所有入選者均抽取空腹靜脈血2mL到乙二胺四乙酸（EDTA）-Na2抗凝管中，置-70℃冰箱中備用提取基因組DNA進(jìn)行MTHFR基因多態(tài)性檢測(cè)。早孕受試者根據(jù)MTHFR基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果分為CC組、CT組、TT組，然后每個(gè)組再隨機(jī)分為兩組，分別給予400μg、800μg不同劑量的葉酸口服補(bǔ)充1個(gè)月。口服葉酸前及服用1個(gè)月以后均晨空腹抽取靜脈全血4mL，加入EDTA抗凝試管內(nèi)檢測(cè)紅細(xì)胞葉酸濃度。

1.3 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

所有入選者均采用PCR法進(jìn)行C677T 位點(diǎn)MTHFR基因多態(tài)性檢測(cè)；早孕者口服葉酸前后檢測(cè)紅細(xì)胞葉酸水平。

1.3.1 MTHFR基因檢測(cè) 首先利用常規(guī)飽和酚-氯仿抽提法從全血中提取基因組DNA，測(cè)定DNA純度和濃度后-20℃保存?zhèn)溆?。MTHFR基因多態(tài)性檢測(cè)采用PCR法：①M(fèi)THFR-C677T引物設(shè)計(jì) 參照文獻(xiàn)進(jìn)行，上游引物5-TGA AGG AGA AGG TGT CTG CGG GA-3，下游引物5-AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG-3，均由上海生物工程技術(shù)公司提供；②PCR反應(yīng)體系總體積25μL，其中ddH20 18.5μL，10×緩沖液2.5μL，10mM的dNTPs 1μL，12.5pmol/μL的引物各lμL，DNA lμL，所用DNA提取試劑盒由Takara公司生產(chǎn)（Code No.： R004A）；③PCR反應(yīng)條件 94℃預(yù)變性5 min。94℃變性30 s，58℃復(fù)性45s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃終末延伸10 min，最后置于4℃保存；④擴(kuò)增產(chǎn)物的限制性酶切取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8止，用8 U TaqI限制性內(nèi)切酶于37℃酶切6 h，反應(yīng)終止后，產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，染色后以DL 75 bp DNA片段長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)物為參考，在紫外燈下判斷結(jié)果，并拍照分析基因型[5]。

1.3.2紅細(xì)胞葉酸濃度檢測(cè) 采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)抗凝血中紅細(xì)胞葉酸濃度，紅細(xì)胞葉酸檢測(cè)儀由山東鑫科生物科技股份有限公司生產(chǎn)提供。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.0軟件包行統(tǒng)計(jì)研究，計(jì)量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用相對(duì)數(shù)表示，采用χ2檢驗(yàn)，設(shè)定a=0.05、即P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 本地區(qū)育齡女性MTHFR基因的多態(tài)性分布情況

MTHFR基因型PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為134 bp，根據(jù)限制性內(nèi)切酶Taq I酶切片段的情況，基因型有三種，CC型（134 bp 1條帶），CT型（134 bp，75 bp，59 bp 3條帶），TT型（75 bp，59 bp 2條帶）。本次普查本地區(qū)育齡女性共檢出CC型（正?；颍? 689例，CT型（雜合突變型）2 357例，TT型（純合突變型）1 082例，基因多態(tài)性位點(diǎn)遺傳平衡檢驗(yàn)見(jiàn)表1。早孕組共檢出CC型（正?；颍?10例，CT型（雜合突變型）375例，TT型（純合突變型）168例，基因多態(tài)性位點(diǎn)遺傳平衡檢驗(yàn)見(jiàn)表2。

表1 本地區(qū)育齡女性MTHFR基因的多態(tài)性位點(diǎn)遺傳平衡檢驗(yàn)

表2 本地區(qū)早孕女性MTHFR基因的多態(tài)性位點(diǎn)遺傳平衡檢驗(yàn)

2.2 MTHFR基因多態(tài)性與服用葉酸前后紅細(xì)胞葉酸濃度的相關(guān)性

本組早期孕婦干預(yù)前CT型平均紅細(xì)胞葉酸濃度（274.5±28.5）nmol/L，TT型平均紅細(xì)胞葉酸濃度（257.3±33.4）nmol/L，與CC型平均紅細(xì)胞葉酸濃度（297.2±31.3）nmol/L相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t1=8.152，P=0.015；t2=10.213，P=0.010）。口服400 μg葉酸1個(gè)月前后，CC型早孕受試者差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），CT型、TT型差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；口服800 μg葉酸1個(gè)月前后，CC型、CT型、TT型早孕受試者差異比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。CC型早孕受試者口服400 μg葉酸1個(gè)月后平均紅細(xì)胞葉酸濃度與口服800 μg葉酸者相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；CT型、TT型早孕受試者口服400 μg葉酸1個(gè)月后平均紅細(xì)胞葉酸濃度與口服800 μg葉酸者分別相比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），詳見(jiàn)表3。

3 討論

神經(jīng)管缺陷（neural tube defects，NTDs）是因神經(jīng)管上皮的早期發(fā)生及分化紊亂而導(dǎo)致的一種最常見(jiàn)且后果嚴(yán)重的出生缺陷畸形，包括脊柱裂、無(wú)腦兒、脊髓脊膜或腦膜膨出、顱脊柱裂等臨床類型，是引起自然流產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)及新生兒死亡最重要因素[6]。目前NTDs發(fā)病機(jī)制尚不清楚，一般認(rèn)為是環(huán)境與遺傳因素共同作用的結(jié)果，當(dāng)前的研究熱點(diǎn)是NTDs與同型半胱氨酸代謝相關(guān)性；近年來(lái)葉酸代謝途徑中酶體系多態(tài)性與神經(jīng)管缺陷發(fā)生相關(guān)性研究得到關(guān)注 [7]。

5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶（5，10-methyl-netetrahydrofolate，MTHFR）屬人同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）代謝途徑過(guò)程中的關(guān)鍵酶，其主要作用是催化5，10-亞甲基四氫葉酸經(jīng)還原反應(yīng)轉(zhuǎn)變5-甲基四氫葉酸的[8]。5-甲基四氫葉酸是葉酸的一種重要活性形式。而葉酸是蛋氨酸代謝中限速反應(yīng)過(guò)程，5-甲基四氫葉酸可脫落活性甲基并轉(zhuǎn)給同型半胱氨酸（Hcy），生成蛋氨酸。葉酸過(guò)低，則會(huì)引起蛋氨酸合成量的減少，導(dǎo)致血中同型半胱氨酸（Hcy）積存過(guò)多，這在孕早期階段會(huì)干擾神經(jīng)管的閉合，從而發(fā)生神經(jīng)管缺陷性胎兒[9，10]。研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR基因的C677T突變可導(dǎo)致的酶活性和熱敏感性降低，使身體對(duì)低葉酸水平的耐受范圍縮窄[11，12]。但是如果機(jī)體攝入大量的葉酸而且沒(méi)有其他半胱氨酸代謝酶缺陷存在時(shí)，由于酶活反應(yīng)底物濃度增加，同樣可以維持正常的Hcy代謝，MTHFR基因的C677T突變則不會(huì)引起高Hcy血癥，但是葉酸攝入不足時(shí)，MTHFR基因突變則可導(dǎo)致高Hcy血癥[13]。

雖然MTHFR基因突變頻率存在明顯的地區(qū)、種族差異，但來(lái)自不同地區(qū)的大樣本數(shù)據(jù)研究均證實(shí)，母親C677T突變是導(dǎo)致NTD兒遺傳風(fēng)險(xiǎn)的高危因素，MTHFR基因C677T型為子代發(fā)生NTD的危險(xiǎn)因素之一[14]。我們的研究結(jié)果表明，早期孕婦CT型、TT型紅細(xì)胞葉酸濃度相對(duì)較低，補(bǔ)充較大劑量（800 μg）葉酸時(shí)能夠有效地維持紅細(xì)胞葉酸濃度，常規(guī)劑量400 μg一定程度上不能滿足MTHFR基因C677T型突變?cè)袐D的正常葉酸水平需求。

綜上所述，針對(duì)育齡婦女開(kāi)展MTHFR基因多態(tài)性檢測(cè)，并用以指導(dǎo)孕期口服補(bǔ)充葉酸劑量的選擇，值得臨床進(jìn)一步研究嘗試。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 畢勝，潘尚哈，張昱，等. 葉酸、維生素B12，MTHFR基因及血漿同型半胱氨酸水平與Alzheimer病關(guān)系的研究[J]. 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2004，14（19）：15-18.

[2] 張海洋，張金華，張會(huì)敏，等. MTHFR基因多態(tài)性與腦卒中的相關(guān)性[J]. 中國(guó)老年學(xué)雜志，2012，32（4）：690-691.

[3] Weiner AS， Boyarskikh UA， Voronina EN，et al. Methylenetetrahydrofolate reductase C677T and methionine synthase A2756G polymorphisms influence on leukocyte genomic DNA methylation level[J]. Gene，2014，533（1）：168-172.

[4] 李軍，史海龍，帖紅莉，等. MTHFR基因多態(tài)性檢測(cè)在神經(jīng)管缺陷干預(yù)中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)優(yōu)生優(yōu)育，2008，14（4）：163-164.

[5] 賀憲民，張群，楊琦，等. 亞甲基四氫葉酸還原酶和甲硫氨酸合成酶還原酶基因多態(tài)性研究[J]. 中國(guó)計(jì)劃生育學(xué)雜志，2010，18（1）：13-18.

[6] 沈立萍，仇小強(qiáng). 亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性、葉酸、同型半胱氨酸與神經(jīng)管缺陷的關(guān)系[J]. 中華流行病學(xué)雜志，2004，25（10）：908-910.

[7] Liu R， Geng P， Ma M， et al. MTHFR C677T polymorphism and migraine risk： A meta-analysis[J]. J Neurol Sci，2013，10： 8.

[8] 周媛，王莉，張軍，等. 亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與先天神經(jīng)管缺陷的關(guān)系[J]. 中國(guó)婦幼保健，2008， 23（22）：3105-3107.

[9] 盧慶彬，王志萍，宮蕊，等. 孕育神經(jīng)管缺陷兒的育齡婦女生命質(zhì)量及相關(guān)因素[J]. 中國(guó)心理衛(wèi)生雜志，2011， 25（3）：185-190.

[10] 馬辰凱，江峰，孫蓮萍，等. 亞甲基四氫葉酸脫氫酶G1958A多態(tài)性與神經(jīng)管缺陷易感性的meta分析[J]. 臨床兒科雜志，2013，（6）：565-569.

[11] 李桂華. 加強(qiáng)農(nóng)村育齡婦女增補(bǔ)葉酸管理預(yù)防神經(jīng)管缺陷[J]. 中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013，10（2）：119-121，125.

[12] 徐霞，陳盛強(qiáng)，謝芳英，等. 廣東漢族人N5，N10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與冠心病的關(guān)系初探[J]. 中國(guó)基層醫(yī)藥，2005，12（6）：661-662.

[13] 周世媛，周繼蘋(píng)，王莉娜，等. MTHFR基因多態(tài)性與法洛四聯(lián)癥的相關(guān)性研究[J]. 山東醫(yī)藥，2012，52（43）：1-3.

[14] 林茜，黃憶明. 孕婦維生素營(yíng)養(yǎng)狀況對(duì)胎兒生長(zhǎng)發(fā)育的影響[J]. 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2001，11（7）：50-51.

（收稿日期：2013-11-20）