水產(chǎn)品等食品中磺胺類抗生素殘留分析與預處理方法的研究進展

韓歡+徐婧+孔亮+李偉*+董美玲+劉琪+王春龍

DOI:10.3969/j.issn.1004-6755.2014.06.018

摘 要：對水產(chǎn)品等食品中磺胺類抗生素常用的分析方法和預處理方法進行了綜述，歸納和比較了毛細管電泳法、微生物方法、液相色譜-質(zhì)譜法、免疫法、氣相色譜法、分光光度法、高效液相色譜法等特點。其中高效液相色譜法由于操作簡便、快速、靈敏、準確的特點，是當前檢測磺胺類抗生素的主要方法。同時，對包括固相萃取、分子印跡等預處理方法進行了綜述。

關(guān)鍵詞：磺胺類抗生素；抗生素殘留分析；高效液相色譜法；分子印跡。

早在人類出現(xiàn)之前，細菌已經(jīng)在不同的生態(tài)位發(fā)揮著重要的作用。在細菌中有相當小的比例是致病菌，它們能夠給人類和動物的健康帶來災難性的影響。在治療細菌感染的歷史過程中，人類就發(fā)現(xiàn)了細菌和植物種類中有益的抗菌性，并開始利用具有抗菌活性的化合物來抑制細菌感染，而這些化合物大多是來自自然界。1929年，弗萊明在實驗中偶然發(fā)現(xiàn)了青霉素，并且在牛津大學病理學教授弗洛里的進一步系統(tǒng)研究之后，抗生素的發(fā)展得到了大力推動[1]。青霉素在首次臨床試驗中，療效效果十分驚人，從此抗生素進行大規(guī)模生產(chǎn)及商品化使用，并且在畜牧、水產(chǎn)品養(yǎng)殖等行業(yè)大面積使用。但隨著抗生素商品化及平民化使用，過度及搭配不當?shù)厥褂每股胤炊鴷＜叭思皠游锏纳踩?，同時也會造成環(huán)境污染。如：產(chǎn)生毒副作用[2]、致病菌產(chǎn)生耐藥性[3]、繼發(fā)性感染[4]、動物源性耐藥菌對人類的危害[5]、影響環(huán)境微生物[6]、食品安全[7]。

1 磺胺類藥物殘留的檢測分析方法

磺胺類藥物（Sulfonamides，SAs）是比較常見的合成抗菌劑，普遍用于漁業(yè)養(yǎng)殖生產(chǎn)，主要有：磺胺嘧啶（Sulfadiazine，SDZ）、磺胺甲基嘧啶（Sulfamerazine，SM1）、磺胺二甲嘧啶（Sulfadimidine，SM2）、磺胺甲基異惡唑（Sulfamethoxazole，SMZ）等。它們主要用于治療魚類的赤皮病、腸炎、鏈球菌病、弧菌病、細菌性豎鱗病、赤鰭病、爛鰓病、鞭毛蟲病、弧菌病、腸炎等等[8-9]。SAs的廣泛應用，使魚病的感染和傳染方面得到了有效的控制。但是人們在享受著抗生素帶給人們方便的同時，許多新的問題也伴隨而來。像毒性反應、二重感染以及細菌產(chǎn)生耐藥性等，尤其是在濫用的情況下能夠產(chǎn)生排尿和造血紊亂等副作用[10]。因此大多數(shù)國家包括我國農(nóng)業(yè)部、日本、歐盟、歐美和國際食品法典委員會（CAC）等都陸續(xù)規(guī)定了食品以及飼料中SAs的最大殘留限量標準[11-12]。其中日本規(guī)定SM1為0.02 mg/kg，磺胺二甲氧嘧啶（Sulfadimethoxine，SDM）為0.04 mg/kg，SM2為0.01 mg/kg，其它按一律標準為0.01 mg/kg[13]。聯(lián)合國食品法典委員會（CAC）、歐盟和歐美等國家規(guī)定水產(chǎn)品中磺胺類藥物殘留量不得超過0.1 mg/kg[14]。 我國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準《NY 5070—無公害食品水產(chǎn)品中漁 藥殘留限量》中規(guī)定，SAs在水產(chǎn)品組織中的最高殘留總量限量為100 μg/kg。另外我國檢測SAs標準還有SN0221-92，SN0208-93，GB/T20759-2006等。

目前，SAs殘留的檢測方法很多，主要有微生物方法、高效液相色譜法（HPLC）、毛細管電泳法、液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)、免疫法、氣相色譜法（GC）、分光光度法等。其中高效液相色譜法簡便、快速、靈敏、準確的特點是當前檢測SAs的主要方法。表1為近年來常用的抗生素分析方法。

1.1 微生物方法

微生物方法是應用較為廣泛的一種檢測方法，尤其是在牛乳中抗生素殘留的檢測。微生物檢測方法分為紙片法、亮黑還原法、TTC法、CHARM抑制法等[15]。該方法具有可直觀、儀器設備成本和檢測成本較低，但該方法的靈敏度和特異性與其它方法對比相對較低。其中酶標抗體檢測法是目前一種趨向靈敏、準確、快速的新型微生物檢測方法[16]。

1.2 高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）

高效液相色譜法（HPLC）是色譜法中一個重要的分支，也是目前應用最廣泛的檢測抗生素的方法。HPLC因載液流速快，固定相和流動相可以自主選擇，所以具有分析速度快、分離效率高的特點，可以檢測近70%的化合物。抗生素殘留在色譜分析時最常用的檢測方式有紫外-可見檢測器（UV-Vis）電化學檢測器（ECD）、熒光檢測器（FLD）和二極管陣列全波長檢測器（DAD）等。如劉勇[17]、ayas-Blanco[18]、Kunihiro Kishida[19]、方炳虎[20]等分別應用反相高效液相色譜法檢測分析牛奶中SAs的殘留，并采用乙腈提取SAs殘留，獲得了良好的分析效果。劉振偉等[21]以乙腈進行提取，HLB小柱凈化，采用紫外-可見檢測器在270 nm處進行檢測，檢測低限能夠達到5 μg/kg，線性在25～300 μg/kg范圍內(nèi)良好。該類方法具有準確度高、精密度好、檢測限低的特點。

1.3 毛細管電泳法（Capillary Electrophoresis，CE）

毛細管電泳法也是一種液相分離的技術(shù)，再用紫外-可見檢測器掃描成電泳譜圖，相對于高效液相色譜來說，CE的柱效更高，對于離子型化合物具有很好的分離效果，并提高了樣品檢測的分辨率。目前由于毛細管電泳和高靈敏度檢測器的聯(lián)用，靈敏度有了極大的提高[22-25]。如Ackermans等建立了毛細管帶電泳法檢測磺胺噻唑（Sulfathiazole，ST）、磺胺甲噁唑（Sulfamethoxazole，SMO）等15種SAs的殘留分析方法[26]。但CE最大的不足是進樣量過低，造成分析誤差升高，并且進樣的待測物受到限制，很難應用于痕量分析。

1.4 液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)

液相色譜-質(zhì)譜法是液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜作為檢測系統(tǒng)的一種結(jié)合方法。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)是色譜和質(zhì)譜優(yōu)勢的互補，提高了對復雜樣品的分離分析能力。HPLC-MS有如下幾個特點：（1）分析范圍廣泛，可以檢測絕大多數(shù)的化合物；（2）分離能力強，通過MS，能夠按照特征離子質(zhì)量可以將色譜中沒有徹底分開的混合物進一步進行分離，并可以定性、定量分析；（3）檢測限低；（4）分析時間快；（5）自動化程度高。如Casetta等建立了HPLC-MS/MS法測定了蜂蜜中SAs的方法[27]。

1.5 免疫學方法

免疫分析方法包括放射免疫分析法（Radioimmunoassay，RIA）、酶聯(lián)免疫分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）、固相免疫傳感器、免疫親和色譜（Immunoaffinity Chromatography，ICA）等。免疫學方法具有操作簡便、分析成本低、靈敏度極高等優(yōu)點。其中酶聯(lián)免疫分析法更是由于特異性強、操作簡便的特點使其成為最為常用的方法之一[28-30]。但由于免疫測定法大多數(shù)是以生物物質(zhì)作為分子檢測識別原件，這些物質(zhì)不易長期保存，并且操作穩(wěn)定性差，容易出現(xiàn)假陽性，因此不適合作為確證試驗。

1.6 氣相色譜法（Gas Chromatography，GC）

氣相色譜在早期SAs分析中應用較多。GC可以使用的檢測器通常有火焰電離檢測器（FID）、電子捕獲檢測器（ECD）、熱導檢測器（TCD）等。其中FID、TCD檢測的范圍廣泛，其它的檢測器因檢測化合物的范圍較窄而鮮有應用。GC具有分析速度快、效率高、操作簡單、選擇性較好、低檢測限等優(yōu)點。由于GC/ECD可以作為GC/MS的補充可以測定動物性食品等樣品[31]，所以分析SAs時氣相色譜法主要為GC/ECD。但同時GC只能適用于低沸點、易揮發(fā)但不分解的物質(zhì)進行定性和定量分析，因此在很多實際分析檢測中，GC受到了一定的限制，需要對樣品預處理、色譜條件、流動相的選擇進行改善等優(yōu)化。

1.7 分光光度法

分光光度法有紫外可見分光光度計、原子熒光分光光度計和原子吸收分光光度計，同樣它們在食品領域中已經(jīng)得到了廣泛的應用[32-33]。雖然常規(guī)的光譜學儀器應用廣泛、操作簡便等優(yōu)點，但受到線性范圍、準確度及精密性等性能參數(shù)的制約，從而影響到解決食品中實際樣品檢測問題。Gala B等建立了停止與流動技術(shù)與T型熒光分光法結(jié)合的方法同時測定出牛奶中氨芐青霉素和四環(huán)素[34]。

表1 常用的抗生素分析方法

分析方法 優(yōu)缺點

微生物方法 檢測成本低；靈敏度、特異性較低，容易出現(xiàn)假陽性

高效液相

色譜法（HPLC） 分離速度快、效率高、應用廣泛

毛細管電泳法（CE） 適用于離子型化合物，提高了樣品的檢測靈敏度

液相-質(zhì)譜

聯(lián)用法（LC-MS） 選擇性高、靈敏度高，提高了對復雜樣品的分離能力，分析時間快

免疫分析方法 靈敏度高、特異性強、操作簡便；假陽性較高，不適合作確證試驗

氣相色譜法（GC） 分析速度快、選擇性較好、檢測限低

分光光度法 操作簡便，應用范圍廣發(fā)；準確度和精密度不高

2 針對抗生素分析的樣品預處理方法

由于食品中富含脂肪、蛋白質(zhì)、糖、維生素及氨基酸等基質(zhì)，而且食品中存在大量的干擾物質(zhì)，待測物含量非常低，規(guī)定的濃度量級基本為mg/kg、μg/kg、ng/kg，甚至更低。因此在檢測食品樣品中需要大量而且細致的分離純化和富集過程。樣品預處理是其中必不可少的步驟，也是最關(guān)鍵的步驟。由于樣品預處理可以減少雜質(zhì)對目標物的干擾程度，以及可以對試樣中的痕量組分進行預富集，所以是整個檢測分析過程中誤差的主要來源和分析時間快慢的決定步驟[35]。預富集能力越強、富集成分越單一，檢測靈敏度就越高。而且無論是HPLC還是GC等的檢測方法通常是需要對樣品中的抗生素殘留進行預處理，如分離、純化等步驟。因此，發(fā)展新型快速的樣品預處理方法對于建立食品中抗生素的檢測方法也是非常重要的。目前磺胺類抗生素檢測分析樣品預處理方法主要有液-液萃取法、固相萃取法、微波輔助萃取法、超臨界流體萃取、分子印記法等。表2為近年來常用的抗生素分析的樣品預處理方法。

2.1 液-液萃取

液-液萃取是SAs殘留分析中的一種常用的經(jīng)典提取方法，是早期樣品凈化方法中最常用的方法，一般應用于樣品中被測物質(zhì)與基質(zhì)的分離。其原理是根據(jù)組分在溶劑中的不同溶解度而達到分離或提取目標化合物的目的。張偉紅等先將水產(chǎn)品酸化處理，再用乙腈做萃取溶劑，經(jīng)正己烷脫脂后，蒸發(fā)濃縮，最后用HPLC-MS/MS內(nèi)標法測定了水產(chǎn)品中18種SAs殘留量[36]。液-液萃取方法雖然操作簡便，但是存在處理過程引起的誤差較大、可控性較差等不足，除雜效果有限。

2.2 固相萃取（Solid Phase Extraction，SPE）

固相萃取主要應用于樣品的分離、濃縮和純化。固相萃取方法具有如下優(yōu)點：(1) 富集倍數(shù)高，由于使用的是固相萃取柱富集樣品，所以富集倍數(shù)可以高達數(shù)十倍，甚至是數(shù)百倍；(2) 分離雜質(zhì)效率高，固相萃取可以有針對性地選擇SPE吸附劑，從而有效地分離干擾組分；(3) 有機溶劑消耗量低，僅需少量的洗脫劑就能把待測分析組分洗脫下來；(4)易于收集、操作快捷方便等優(yōu)點，因此目前廣泛應用于食品化學成分、農(nóng)獸藥殘留、環(huán)境污染物等方面的檢測。

SPE可以根據(jù)抗生素化學性質(zhì)采用不同類型的SPE柱進行固相萃取。其中，用于分析動物源性食品中SAs的SPE柱主要分以下幾種：(1) C18 SPE柱；包艷萍等采用C18 SPE柱凈化蔬菜中SAs，凈化效果良好，回收率為50.80%～9890%[37]。(2) 堿性氧化鋁SPE柱；王欽暉等、李俊鎖等分別在測定蜂蜜、雞肝組織中SAs殘留量時，采用堿性氧化鋁SPE-Pak柱凈化樣品，樣品用乙腈淋洗后售價并分析，結(jié)果表明干擾被測樣品中的雜質(zhì)能夠被去除，該方法操作簡單[31,38]。 (3) Oasis HLB SPE柱；李存等將樣品加入到Oasis HLB SPE柱中進行分離預處理，結(jié)果表明，該預處理方法去除雜質(zhì)效果較好，定量曲線線性良好[39]。(4) Oasis MCX SPE柱；熊芳等采用Oasis MCX SPE柱對動物肝臟中的4種SAs進行萃取[40]。該方法操作簡便，凈化效果好，能夠滿足分析的需要。(5) 硅膠SPE柱；董丹等采用硅膠SPE柱對雞肉中的17種SAs進行凈化，方法回收率為52.30%～124.90%，提高了樣品中被測物質(zhì)的檢測靈敏度[41]。(6) DVB型全自動固相萃取小柱；何桂花等運用全自動固相萃取小柱富集凈化動物臟器組織中的SAs。使用二氯甲烷提取，正己烷除脂。萃取柱經(jīng)甲醇和5%的乙酸溶液處理活化，然后上樣，采用5%的乙酸-甲醇(1:1, v/v)進行洗脫收集后進行分析，結(jié)果表明處理效果較好[42]。由于SPE具有效率高、重復性好、處理速度快等特點，目前已經(jīng)成為抗生素殘留分析預處理方法的一個發(fā)展方向。

2.3 微波輔助萃?。∕icrowave Aided Extraction，MAE）

MAE具有回收率高、萃取時間較短等優(yōu)點，其具體表現(xiàn)為：不僅可以加快樣品中基質(zhì)、大分子物質(zhì)的分離，還可以通過添加極性溶劑吸收微波能來提高溶劑的提取效能；MAE能夠在高溫和高壓下加快分子運動速度，繼而提高了微波萃取的速率。曾慶磊建立了微波輔助水蒸氣萃取的方法提取動物飼料中磺胺類抗生素，能夠快速、高效率地提取飼料中磺胺類抗生素，并減少了樣品中其他雜質(zhì)的提取，達到了較高的回收率[43]。

2.4 超臨界流體萃?。⊿upercritical Fluid Extraction，SFE）

當某一物質(zhì)高于本身的臨界溫度和壓力后，該物質(zhì)物理狀態(tài)處于既不會是液體也不是氣體的狀態(tài)，我們稱之為超臨界流體（Supercritical Fluid，SF）。SF由于其獨特的性質(zhì)而能夠溶解很多物質(zhì)，SFE正式利用這一超臨界流體作為溶劑，因此壓力和溫度都會對流體的溶解能力產(chǎn)生很大的影響。并且SF的表面張力較小，使其能夠快速滲透到樣品中，因此其萃取速度要比普通溶劑的萃取速度快很多。由于這些性質(zhì)使超SFE要比溶液萃取的效果好得多[44]。SFE具有廣泛的實用性、萃取效率高，尤其是不產(chǎn)生污染、節(jié)省能源等優(yōu)點，特別適合于熱敏性天然產(chǎn)物和生理活性物質(zhì)的萃取分離[45]。

2.5 免疫親和色譜法（Immunoaffinity chromatography，IAC）

免疫親和色譜法是一種操作簡便、分離效果理想且精密度高的樣品前處理中方法。IAC有可以對復雜基質(zhì)中痕量組分進行選擇性吸附和富集的特點，檢測線非常低，而且免疫吸附柱經(jīng)適當處理后可以重復使用，目前是殘留分析中比較有效的凈化方法之一，已經(jīng)被應用于多種藥物殘留的測定。李俊鎖等、Sheth H B等分別建立了免疫親和色譜法測定獸藥和蜂蜜中SAs的殘留[46-47]。

2.6 分子印跡法（Molecular Imprinting）

表2 抗生素分析中常用的樣品預處理方法

預處理方法 優(yōu)缺點

液-液萃取 操作簡便，應用范圍廣，是早期凈化方法中最常見的。

固相萃取 富集倍數(shù)高、分離雜質(zhì)效率高、易于收集、操作簡便。

微波輔助萃取 可以與樣品直接作用，反應速度快，提高了溶劑活性。

超臨界流體萃取 由于超臨界流體表面張力小，因此萃取速度比普通溶劑快。

免疫親和色譜 可以對復雜基質(zhì)中痕量組分進行選擇性吸附和富集，免疫吸附柱可重復使用。

分子印跡整體柱 具有構(gòu)效預定性、特異識別性、穩(wěn)定性好、重復性好。

分子印跡技術(shù)最早是由Pauling提出以抗原為模板合成抗體的理論為啟發(fā)[48]，直到1972年由德國Wulff等研究小組才人工合成出對糖類化合物具有較高選擇的共價型分子印跡聚合物[49]。到1993年Mosbach等在Nature上發(fā)表了非共價型分子印跡聚合物合成及其仿生免疫分析應用的文章后[50]，分子印跡技術(shù)得到了迅猛發(fā)展。分子印跡技術(shù)通常來講是指通過加入模板分子能夠形成對某一特定的分子具有特異性選擇的聚合物，并且當模板分子去除后，聚合物中形成與模板分子空間結(jié)構(gòu)相匹配的空穴，從而這個空穴對模板分子具有高度的選擇識別性。分子印跡技術(shù)具有構(gòu)效預定性（predetermination）、特異識別性（specific recognition）、廣泛實用性（practicability）、穩(wěn)定性好、使用壽命長等特點[51]。在以磺胺類作為模板分子的整體柱報道中，劉祥軍等以SMO作為模板分子，四乙烯基吡啶（4-vinyl pyridine，4-Vpy）為功能單體，采用了原位聚合法在色譜柱中直接制備了SMO分子印跡整體柱，并顯示出良好的識別能力。

中國加入世界貿(mào)易組織之后，各國政府使用貿(mào)易保護政策來維護本國的經(jīng)濟利益，而食品安全問題已經(jīng)成為影響貿(mào)易的關(guān)鍵因素，各國對食品中SAs的殘留量制定了嚴格的控制標準。近年來，由于水產(chǎn)養(yǎng)殖病害多發(fā)，不規(guī)范用藥情況依然存在。另外，由于水產(chǎn)養(yǎng)殖的集約化，飼料藥物添加劑和亞治療量的各類抗生素在生產(chǎn)中廣泛應用，以及不合理用藥等因素，使水產(chǎn)品藥物殘留問題日益突出。我國由于出口產(chǎn)品SAs殘留超標，造成了外貿(mào)受阻，給我國的經(jīng)濟和形象帶來了嚴重影響。因此無論是從產(chǎn)品的本身需求方面，還是為相關(guān)法規(guī)和標準的執(zhí)行提供科學技術(shù)依據(jù)，提高并完善檢測包括水產(chǎn)品在內(nèi)的食品中SAs殘留的技術(shù)都是至關(guān)重要的。

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Sample handling methods and analysis strategies for the determination

of sulfa antibiotic residues in the aquatic products and other foods

HAN Huan, XU Jing, KONG Liang, LI Wei*, DONG Mei

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ling, LIU Qi, WANG Chun

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long

(Dalian Ocean University, Dalian 116023, China)

Abstract：This review summarizes recent progress in the development of the common methods used for determination and sample handling strategies for the analysis of sulfa antibiotic residues in the aquatic products and other foods, including capillary electrophoresis (CE), microbial method, liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), immunoassay, gas chromatography (GC), ultraviolet visible spectrophotometry (UV-Vis), high performance liquid chromatography (HPLC), etc.Compare with the other methods，HPLC demonstrate some advantages in analysis of antibiotics，such as rapid, sensitive and accurate.And the evaluated sample handling strategies include SPE, molecular imprinting technique, etc.

Key words：sulfa antibiotics, antibiotic residues, high performance liquid chromatography (HPLC), molecular imprinting technique (MIT).

（收稿日期：2014-03-22；修回日期：2014-03-27）