紅球菌CCZU10-1選擇性氧化拆分外消旋苯甲亞砜的性能

楊振興，陶志成，何玉財(cái)，王利群，張躍，邢震，龔磊，潘雪鶴

（常州大學(xué)制藥與生命科學(xué)學(xué)院生物工程研究室，江蘇 常州 213164）

紅球菌CCZU10-1選擇性氧化拆分外消旋苯甲亞砜的性能

楊振興，陶志成，何玉財(cái)，王利群，張躍，邢震，龔磊，潘雪鶴

（常州大學(xué)制藥與生命科學(xué)學(xué)院生物工程研究室，江蘇 常州 213164）

為了高效地合成高光學(xué)純手性亞砜，在單水相體系中利用Rhodococcussp. CCZU10-1選擇性氧化拆分外消旋苯甲亞砜（rac-PMSO）合成了(S)-PMSO（ee＞99.9%）。通過考察反應(yīng)pH值、反應(yīng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速、輔助底物、生物催化劑添加量對(duì)催化反應(yīng)的影響，確定了最適反應(yīng)條件。結(jié)果表明最適反應(yīng)條件為：反應(yīng)pH值8.0、反應(yīng)溫度30℃、搖床轉(zhuǎn)速180r/min、輔助底物為半乳糖（50mmol/L）、細(xì)胞濃度為0.08g(濕重)/mL。在最適反應(yīng)條件下生物轉(zhuǎn)化20mmol/L rac-PMSO時(shí)，(R)-PMSO完全轉(zhuǎn)化，(S)-PMSO（ee＞99.9%）產(chǎn)率為47.1%。因此，研究結(jié)果為工業(yè)化生產(chǎn)(S)-PMSO奠定了基礎(chǔ)。

紅球菌屬；(S)-苯甲亞砜；拆分；生物轉(zhuǎn)化；優(yōu)化

光學(xué)純手性亞砜是一種重要的藥物中間體和手性助劑[1]，可通過不對(duì)稱氧化前手性硫化物或者不對(duì)稱氧化拆分外消旋亞砜獲得[2]。不對(duì)稱氧化硫化物可通過金屬催化劑或純化酶催化進(jìn)行[3]，也可用整細(xì)胞催化進(jìn)行[4]。相比之下，用整細(xì)胞系統(tǒng)催化不對(duì)稱氧化硫化物具有更多的優(yōu)點(diǎn)，可避免手性金屬配合物和純化酶的使用，因此更有發(fā)展前途和應(yīng)用前景。雖然利用整細(xì)胞氧化拆分外消旋亞砜合成光學(xué)純亞砜的最大理論產(chǎn)率僅為50%，但是其砜類產(chǎn)物也是非常有用的藥物（例如多菲萊德、舒多昔康、煙嘧磺隆等）中間體[5-6]。到目前為止，少有報(bào)道利用整細(xì)胞氧化拆分外消旋亞砜高效制備高光學(xué)純亞砜的研究。利用黑曲霉[7]不對(duì)稱氧化拆分外消旋亞砜時(shí)，ee較低（＜50%）；利用Rhodococcussp.ECU0066[8]不對(duì)稱氧化拆分外消旋亞砜時(shí)，(S)-PMSO產(chǎn)率較低 (＜45%)。因此，利用整細(xì)胞氧化拆分外消旋亞砜制備光學(xué)純亞砜仍有上升發(fā)展空間。

最近，作者利用Rhodococcussp. CCZU10-1進(jìn)行氧化拆分rac-PMSO，通過對(duì)反應(yīng)pH值、反應(yīng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速、輔助底物等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了高光學(xué)純(S)-PMSO (ee＞99%，產(chǎn)率47.1%)的高效合成。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 試劑和藥品

外消旋苯甲亞砜和苯甲砜購自上海隆盛化工有限公司，分析純；蛋白胨和酵母膏購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，生化級(jí)；其他試劑均為國產(chǎn)分析級(jí)。

1.2 主要儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀；R2ID旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義市予化儀器制造有限公司；THZ-072 HT恒溫?fù)u床，上海博彩生物科技有限公司。立式壓力蒸汽滅菌器LDZX-50KBS上海申安醫(yī)療器械廠；離心機(jī)TGL-16G上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 菌株

Rhodococcussp. CCZU10-1[9]，作者實(shí)驗(yàn)室篩選獲得。

1.4 培養(yǎng)

首先在250mL搖瓶裝液50mL培養(yǎng)基培養(yǎng)紅球菌24h。培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為180r/min，培養(yǎng)基的成分為：葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 1.5g/L，KH2PO42g/L，無水MgSO40.3g/L，pH值7.0。培養(yǎng)24h，加入誘導(dǎo)劑rac-PMSO（終濃度為0.1mmol/L），繼續(xù)培養(yǎng)24h后離心（10000g，5min）收獲細(xì)胞，然后重懸浮于K2HPO4-KH2PO4（100mmol/L，pH值8.0）緩沖溶液待用。

1.5 rac-苯甲亞砜的氧化反應(yīng)

在單水相體系，氧化拆分外消旋苯甲亞砜是在10mL帶塞的搖瓶中進(jìn)行的。收獲的靜息細(xì)胞Rhodococcussp. CCZU10-1（0.16g濕菌）重懸于2mL K2HPO4-KH2PO4緩沖溶液（100mmol/L，pH值8.0）。20mmol/L外消旋苯甲亞砜在紅球菌作用下，進(jìn)行選擇性氧化拆分反應(yīng)（30℃和180r/min）。反應(yīng)結(jié)束后，利用等體積乙酸乙酯萃取反應(yīng)體系3次，萃取液進(jìn)一步利用無水硫酸鈉干燥過夜，減壓濃縮至干，2mL乙醇重新溶解后，分析(S)-PMSO的產(chǎn)率和(S)-PMSO的對(duì)映體過量值(ee)。

1.6 分析方法

液相色譜（HPLC）檢測(cè)法：(S)-PMSO的產(chǎn)率和ee值的測(cè)定是通過Daicel的OD-H柱測(cè)定。

檢測(cè)條件：Chiracel OD-H柱（4.6mm×250mm，5 μm），正己烷∶異丙醇=93∶7（體積比），流速為1mL/min，檢測(cè)波長254nm。(R)-PMSO、苯甲砜和(S)-PMSO的出峰時(shí)間分別為20min、24min和26min。

產(chǎn)物的產(chǎn)率(Yield)和對(duì)映體過量值(ee)計(jì)算方法如式（1）和式（2）。

式中，SR0和SS0分別表示反應(yīng)前(R)-PMSO和(S)-PMSO的初始濃度；SR和SS分別表示(R)-PMSO和(S)-PMSO的濃度。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)pH值對(duì)氧化PMSO的影響

反應(yīng)pH值對(duì)生物催化反應(yīng)有著明顯的影響，不同反應(yīng)pH值使底物和生物催化劑的反應(yīng)所處環(huán)境和狀態(tài)不同，導(dǎo)致pH值影響生物催化劑的活性[10-11]。如圖1所示，反應(yīng)pH值(5.0～10.0)對(duì)Rhodococcussp. CCZU10-1氧化PMSO活性有著明顯的影響。在pH值8.0時(shí)，催化活性達(dá)到最大值。因此，最適反應(yīng)pH值為8.0。

2.2 反應(yīng)溫度對(duì)氧化PMSO的影響

反應(yīng)溫度也對(duì)催化活性[12-13]有明顯的影響。如圖2所示，不同反應(yīng)溫度（25～45℃）對(duì)Rhodococcussp. CCZU10-1氧化PMSO的影響比較顯著。當(dāng)溫度為30℃時(shí)，催化活性達(dá)到最大值。繼續(xù)提高反應(yīng)溫度，催化活性明顯下降。因此，30℃為Rhodococcussp. CCZU10-1最適反應(yīng)溫度。

圖1 反應(yīng)pH值對(duì)氧化PMSO活性的影響

圖2 反應(yīng)溫度對(duì)氧化PMSO活性的影響

2.3 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)氧化PMSO的影響

搖床轉(zhuǎn)速對(duì)體系溶氧有著顯著地影響[14]，從而影響Rhodococcussp. CCZU10-1對(duì)rac-PMSO氧化活性。如圖3所示，在低轉(zhuǎn)速（120r/min）下，溶氧較低，導(dǎo)致氧化活性較低；轉(zhuǎn)速提高到180r/min，氧化活性明顯地提高；繼續(xù)提高轉(zhuǎn)速，氧化活性提高不明顯。因此，180r/min為最適搖床轉(zhuǎn)速。

2.4 輔助底物對(duì)氧化PMSO的影響

在生物催化氧化還原反應(yīng)過程中添加輔助底物可以促進(jìn)輔酶再生，從而提高催化效率[15]。10種潛在的輔助底物（半乳糖、甘露糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、乙醇、丙三醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇）（50mmol/L）對(duì)Rhodococcussp. CCZU10-1氧化PMSO的影響進(jìn)行了考察。如圖4所示，不同的輔助底物對(duì)Rhodococcussp. CCZU10-1氧化PMSO有著顯著地影響。當(dāng)輔助底物為半乳糖時(shí)，催化活性達(dá)到最大。因此，最適輔助底物為半乳糖（50mmol/L）。

2.5 生物催化劑添加量的影響

圖3 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)氧化PMSO活性的影響

圖4 輔助底物對(duì)氧化PMSO活性的影響

反應(yīng)過程中，生物催化劑添加量是影響生物催化活性的重要因素之一[16]。因此，進(jìn)一步考察不同Rhodococcussp. CCZU10-1靜息細(xì)胞添加量（0.01～0.2g/mL，濕重）對(duì)催化反應(yīng)的影響。如圖5所示，細(xì)胞濃度對(duì)催化活性具有顯著的影響。當(dāng)細(xì)胞濃度為0.08g (濕重)/mL時(shí)，催化活性達(dá)到最大。當(dāng)細(xì)胞濃度大于0.08g/mL時(shí)，反應(yīng)體系的黏度明顯增加，導(dǎo)致溶氧的降低，最終催化活性顯著下降。因此，0.08g (濕重)/mL為最適Rhodococcussp. CCZU10-1細(xì)胞添加量。

2.6 20mmol/L底物反應(yīng)進(jìn)程

在最適的反應(yīng)條件下，對(duì)催化rac-PMSO（20mmol/L）進(jìn)程進(jìn)行了考察。如圖6所示，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，(R)-PMSO濃度顯著地下降，苯甲砜濃度顯著地上升，而(S)-PMSO大部分保留在反應(yīng)體系中。反應(yīng)6h，(R)-PMSO完全轉(zhuǎn)化，而(S)-PMSO（ee＞ 99.9%，圖7）的產(chǎn)率為47.1%?？赡艿拇呋磻?yīng)rac-PMSO途徑如圖8所示：Rhodococcussp. CCZU10-1對(duì) (R)-PMSO有較高的催化活性，首先將其完全氧化為苯甲砜；而對(duì)(S)-PMSO催化活性較低，將其氧化為少量的苯甲砜；催化過程中苯甲砜未發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步反應(yīng)。值得注意的是，(S)-PMSO和苯甲砜分別是治療胃潰瘍藥物（如奧美拉唑）和抗生素（如甲砜霉素）的關(guān)鍵中間體。

圖5 生物催化劑添加量對(duì)氧化PMSO活性的影響

圖6 催化rac-PMSO的反應(yīng)進(jìn)程

圖7 催化rac-PMSO反應(yīng)前后手性HPLC譜圖

圖8 生物催化氧化rac-PMSO途徑

3 結(jié) 論

通過反應(yīng)pH值、反應(yīng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速、輔助底物、細(xì)胞濃度等因素考察Rhodococcussp. CCZU10-1氧化拆分催化rac-PMSO活性的影響，確定了最適反應(yīng)條件：反應(yīng)pH值8.0，反應(yīng)溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速180r/min，輔助底物為半乳糖（50mmol/L），細(xì)胞添加量為0.08g (濕重)/mL。在20mmol/L體系中反應(yīng)6h，(S)-PMSO （ee＞ 99.9%）的產(chǎn)率為47.1%。

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Selective oxidation resolution of racemic phenyl methyl sulfoxide with Rhodococcus sp. CCZU10-1

YANG Zhenxing，TAO Zhicheng，HE Yucai，WANG Liqun，ZHANG Yue，XING Zhen，GONG Lei，
PAN Xuehe
（Laboratory of Biochemical Engineering，School of Pharmaceutical Engineering and Life Sciences，Changzhou University，Changzhou 213164，Jiangsu，China）

To efficiently synthesize optically active chiral sulfoxides，Rhodococcussp.CCZU10-1 was used for the asymmetric resolution of rac-PMSO into (S)-PMSO (ee＞ 99.9%) in aqueous single-phase system. After optimization，the optimum reaction pH，reaction temperature，shaker speed，co-substrate，cells dosage were 8.0，30℃，180 r/min，galactose (50mmol/L) and 0.08g (wet weight)/mL，respectively. By biotransformation of rac-PMSO (20mmol/L) for 6h under the optimized conditions，(R)-PMSO was completely oxidized into the corresponding sulfone，and (S)-PMSO (ee＞ 99.9%) was obtained at a high yield of 47.1%. These results would lay the foundation of industrial production of (S)-PMSO.

Rhodococcussp.；(S)-PMSO；resolution；biotransformation；optimization

Q 814

A

1000-6613（2014）10-2744-05

10.3969/j.issn.1000-6613.2014.10.037

2014-02-19；修改稿日期：2014-03-04。

國家自然科學(xué)基金（21102011）及江蘇省自然科學(xué)基金（BK20141172）項(xiàng)目。

楊振興（1988—），碩士研究生。聯(lián)系人：何玉財(cái)，博士，副教授。E-mail heyucai2001@163.com；yucaihe2007@aliyun.com。