新型異亮氨酸雙加氧酶及其重組大腸桿菌合成羥基異亮氨酸

付敏杰， 聶堯， 穆曉清， 徐巖，2， 肖榮

（1江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2江南大學(xué)食品生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；3羅格斯大學(xué)高級(jí)生物技術(shù)與醫(yī)學(xué)中心，新澤西州 08854，美國(guó)）

新型異亮氨酸雙加氧酶及其重組大腸桿菌合成羥基異亮氨酸

付敏杰1， 聶堯1， 穆曉清1， 徐巖1，2， 肖榮3

（1江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2江南大學(xué)食品生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；3羅格斯大學(xué)高級(jí)生物技術(shù)與醫(yī)學(xué)中心，新澤西州 08854，美國(guó)）

異亮氨酸雙加氧酶（IDO）可特異性的轉(zhuǎn)化底物L(fēng)-異亮氨酸（L-Ile）生成4-羥基-L-異亮氨酸（4-HIL），該產(chǎn)物具有促進(jìn)胰島素分泌的功能，可用于抗糖尿病、降膽固醇等。本研究結(jié)合了酶標(biāo)顯色和薄層層析（TLC）的方法從自然界中篩到了具有IDO活性的菌株，并將該菌株中的目的基因ido克隆到大腸桿菌中，獲得重組表達(dá)菌株，并且驗(yàn)證該菌具有IDO的轉(zhuǎn)化功能。本研究?jī)?yōu)化了轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系和條件，同時(shí)通過(guò)30℃過(guò)夜溫育菌體細(xì)胞的方法，使該菌株全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成4-HIL的產(chǎn)率達(dá)到85%以上。

異亮氨酸雙加氧酶；異亮氨酸；羥基異亮氨酸; 生物轉(zhuǎn)化; 重組表達(dá)

4-羥基-L-異亮氨酸(4-HIL）是一種新型胰島素分泌促進(jìn)劑，可用于治療Ⅱ型糖尿病。而關(guān)于4-HIL的合成已有一些相關(guān)報(bào)道，Wang等[1]研究了一種有效的八步合成4-HIL的方法，其轉(zhuǎn)化總產(chǎn)率為39%，該方法的關(guān)鍵步驟是利用Geotrichum candidum生物轉(zhuǎn)化2-甲基乙酰乙酸乙酯生成(2S,3R)-2-甲基-3-羥基丁酸已酯，接著將上述反應(yīng)的產(chǎn)物作不對(duì)稱斯特雷克爾合成（是一種從α-羥基腈制備氨基酸的合成法）。Rolland-Fulcrand等[2]研究了有6個(gè)步驟完全控制立體化學(xué)酶合成4-HIL的方法，該方法最后一步是利用商業(yè)化應(yīng)用的固定化青霉素?；窯酶解拆分(N)-苯乙酰內(nèi)酯衍生物。Smirnov等[3-4]利用4-羥基-3-甲基-2-酮基-戊酸鹽醛縮酶和支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶的雙酶偶聯(lián)，經(jīng)過(guò)兩步反應(yīng)將乙醛、α-酮基丁酸鹽和L-谷氨酸轉(zhuǎn)化生成4-HIL。

Haefelé等[5]發(fā)現(xiàn)在葫蘆巴種子中4-羥基-L-異亮氨酸的合成過(guò)程中有雙加氧酶，當(dāng)有Fe2+、α-酮戊二酸（α-KG）、抗壞血酸和氧氣存在時(shí)，該酶可一步催化合成4-HIL，此后關(guān)于該酶的研究才開始逐漸深入。Kodera等[6]從Bacillus thuringiensis中發(fā)現(xiàn)了可一步催化合成4-HIL的L-異亮氨酸雙加氧酶（IDO），即L-異亮氨酸羥基化酶，探索該酶催化合成4-HIL的路線，如圖1所示，IDO催化底物L(fēng)-異亮氨酸發(fā)生羥基化，生成4-HIL；該研究通過(guò)質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌產(chǎn)羥基化酶催化底物L(fēng)-異亮氨酸，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為4-HIL。

圖1 合成4-羥基-L-異亮氨酸的新型路徑

Ogawa等[6-9]篩選得到了一株產(chǎn)IDO的蘇云金芽孢桿菌，并對(duì)該菌中IDO的酶學(xué)性質(zhì)和生物轉(zhuǎn)化代謝過(guò)程進(jìn)行了研究，進(jìn)而將該酶的基因ido克隆到E. coli中進(jìn)行表達(dá)，并從基因水平對(duì)表達(dá)進(jìn)行了調(diào)控，最終使得IDO催化Ile生產(chǎn)4-HIL的產(chǎn)率最高達(dá)82%。

雖然已有開展生物催化轉(zhuǎn)化羥基異亮氨酸研究的相關(guān)報(bào)道，但能夠羥基化脂肪族氨基酸的雙加氧酶的資源仍然有限。目前，只有日本的一個(gè)研究小組有此方面相關(guān)報(bào)道，而且其在基因水平上調(diào)控的克隆菌株的轉(zhuǎn)化反應(yīng)水平也較為有限。本研究致力于開發(fā)新型催化劑，設(shè)計(jì)新的篩菌方案，結(jié)合酶標(biāo)顯色檢測(cè)和薄層層析檢測(cè)兩種篩選方法，從自然界篩選有雙加氧酶基因的菌株，并對(duì)其功能基因進(jìn)行克隆，通過(guò)誘導(dǎo)使重組酶獲得表達(dá)，得到的重組菌用于全細(xì)胞不對(duì)稱轉(zhuǎn)化，并對(duì)轉(zhuǎn)化條件和體系進(jìn)行優(yōu)化，使得無(wú)基因修飾的原始重組菌的轉(zhuǎn)化水平高于已有的報(bào)道，探索得到了更經(jīng)濟(jì)的生物轉(zhuǎn)化條件。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

含雙加氧酶基因的菌株Bacillussp.從各地采集的土樣中篩選得到；大腸桿菌E. coliJM109、BL21 （DE3）感受態(tài)細(xì)胞由本文作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏。

pET-28a(+)質(zhì)粒，本文作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 主要試劑與儀器

LATaqDNA Polymerase、T4 DNA Ligase、限制性內(nèi)切酶SalI和NcoI、DNA marker，TaKaRa公司；Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside（IPTG），上海生工生物工程公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒，OMEGA BIO-TEK。引物由上海生工生物工程公司合成。

標(biāo)準(zhǔn)品L-異亮氨酸（L-Ile）、4-羥基-L-異亮氨酸（4-HIL）為色譜純；乙腈、甲醇為色譜級(jí)；其他試劑藥品均為分析純。

恒溫水浴鍋，上海華連醫(yī)療器械有限公司；PCR儀、DNA電泳儀、蛋白電泳儀、凝膠成像儀，購(gòu)自Bio-Rad公司；酶標(biāo)儀，Thermo公司；高效液相色譜儀，Waters公司。超聲清洗機(jī)SB-25-12D，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，pH7.0（固體培養(yǎng)基加入15%瓊脂）。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，瓊脂15%，pH7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉4g/L，酵母提取物4g/L，麥芽提取物10g/L，底物L(fēng)-Ile 2g/L，pH7.0。

IDO肉湯培養(yǎng)基：可溶性淀粉4g/L，葡萄糖4g/L，MgSO4·7H2O 0.11g/L，CaCl20.11g/L，底物L(fēng)-Ile 2，pH7.0。

1.2 菌株篩選方法

1.2.1 芽孢桿菌的篩選

將從各地采集的10份土樣各取0.5g于5 mL生理鹽水中充分打散，制成懸浮液，在70～80℃水浴中熱處理15～20min后，將懸浮液靜置取上清為100梯度，再將其稀釋成10-1、10-2梯度，這3個(gè)梯度的土壤懸液涂布到營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)。挑取單菌落，即為芽孢桿菌，作進(jìn)一步篩選。

1.2.2 酶標(biāo)顯色檢測(cè)方法

根據(jù)文獻(xiàn)[10]，加氧酶生物轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)酸化后轉(zhuǎn)化成的酚，可與Gibbs試劑作用顯色，并且有明顯的吸收光譜，因此可通過(guò)酶標(biāo)板用Gibbs試劑對(duì)加氧酶活性進(jìn)行篩選。本研究根據(jù)這一原理設(shè)計(jì)了如下檢測(cè)方法。

接種針挑取芽孢桿菌單菌落接種到含500μL發(fā)酵培養(yǎng)基的96孔酶標(biāo)板中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)2 天，然后加入500μL溶有15mmol/L氯苯的發(fā)酵培養(yǎng)基，用膜包住板，于37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)，12 h后將板離心，取上清100μL加入到酶標(biāo)板孔中，再加入100μL 0.1mmol/L HCl，將酶標(biāo)板于37℃靜置30min，然后分別加入20μL 1mol/L Tris-HCl(pH8.5)和25μL 0.4% Gibbs乙醇溶液，于室溫下反應(yīng)40min后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)在652nm下的吸光度值。

1.2.3 薄層層析（TLC）檢測(cè)方法

根據(jù)氨基酸薄層層析茚三酮顯色方法的原理，本研究采用硅膠板薄層分配層析來(lái)分離檢測(cè)氨基酸，當(dāng)展開劑隨著點(diǎn)過(guò)樣的層析板遷移時(shí)，由于樣品中不同氨基酸在展開劑中的分配系數(shù)不同，遷移速度也不同，從而達(dá)到分離的目的。層析結(jié)束后，將層析板置于烘箱中烘干至板上出現(xiàn)氨基酸斑點(diǎn)。

將篩到的芽孢桿菌接種到96孔板中的1mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、200r/min振蕩培養(yǎng)2 天，培養(yǎng)液離心，取上清0.25μL點(diǎn)樣進(jìn)行層析。展開劑∶正丁醇∶乙酸∶水=4∶1∶0.5（質(zhì)量比），顯色劑為0.3%茚三酮，溶于展開劑中。

1.3 基因組DNA提取和質(zhì)粒的提取

芽孢桿菌基因組的提取參照細(xì)菌基因組提取試劑盒說(shuō)明書方法（北京天根生化科技有限公司）。

質(zhì)粒提取參照質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書的方法（TaKaRa公司）。

1.4 目的基因ido的克隆

根據(jù)已報(bào)道的IDO雙加氧酶基因（GenBank Accession No. KC884243.1），在NCBI上BLAST后，根據(jù)相關(guān)基因的同源性設(shè)計(jì)了以下簡(jiǎn)并引物。

上游引物I-F-NcoⅠ為

下游引物I-R-SalⅠ為

以篩選到的芽孢桿菌基因組為模板，采用PCR方法擴(kuò)增ido基因，擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5min； 95℃ 1min，56℃ 1min，72℃ 1min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。取5μL PCR產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后與pMD19-T在16℃下連接4 h，連接產(chǎn)物用熱激發(fā)轉(zhuǎn)化到E. coliJM109感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，獲得陽(yáng)性重組質(zhì)粒pMD19-T-ido?；驕y(cè)序由上海生工生物工程公司完成。

1.5 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)上述測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)以下表達(dá)引物用于PCR。

上游引物I-F-NcoⅠ為

下游引物I-R-SalⅠ為

PCR產(chǎn)物純化后用限制性內(nèi)切酶NcoI和SalI酶切，同時(shí)雙酶切載體pET-28a，膠回收pET-28a的線性質(zhì)粒和目的基因，用T4 DNA Ligase連接載體和目的基因在16℃下過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，涂布卡那抗生素平板，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)化子酶切驗(yàn)證和測(cè)序，確認(rèn)獲得陽(yáng)性克隆E. coliBL21/pET-28a-ido。

1.6 目的基因ido誘導(dǎo)表達(dá)

重組菌的單菌落接種到含有卡那抗生素的3mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取1mL種子液轉(zhuǎn)接至含有卡那抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.6～0.8。向培養(yǎng)基中加入終濃為0.5mmol/L的IPTG，于30℃、200r/min進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)夜。細(xì)胞總蛋白和胞內(nèi)蛋白含量經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)。

1.7 重組菌生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)

發(fā)酵獲得的菌體，經(jīng)生理鹽水洗滌2次后，用50mmol/L pH8.0的Tris-HCl緩沖液懸浮備用。

生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系（2mL）：20%的濕菌體，10mmol/L L-Ile底物，10mmol/Lα-KG，0.5mmol/L FeSO4·7H2O，10mmol/L 抗壞血酸，50mmol/L pH8.0 的Tris-HCl緩沖液。

生物轉(zhuǎn)化條件：28℃，200r/min反應(yīng)1 h。

1.8 生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件優(yōu)化

1.8.1 轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系優(yōu)化

分別對(duì)1.7節(jié)中所述反應(yīng)體系各物質(zhì)進(jìn)行單因素考察，單因素分別為菌體細(xì)胞（0～50%）、α-KG （0～50mmol/L）、FeSO4·7H2O（0～2mmol/L）、抗壞血酸（0～50mmol/L）、L-Ile（0～120mmol/L）。

1.8.2 轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件優(yōu)化

保持1.7節(jié)中反應(yīng)體系成分不變的情況下，分別從不同反應(yīng)pH值（7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10）和不同反應(yīng)時(shí)間（1 h、5 h、10 h、15 h、20 h、25 h）上來(lái)比較重組酶IDO酶活水平，尋找最佳轉(zhuǎn)化條件。

1.8.3 轉(zhuǎn)化反應(yīng)優(yōu)化策略

根據(jù)文獻(xiàn)[11]，不同溫度處理過(guò)的菌體用來(lái)作反應(yīng)，轉(zhuǎn)化效果更好。本研究將菌體懸浮液分別在20℃、30℃、37℃溫育12 h，然后再做反應(yīng)，同時(shí)將反應(yīng)體系的物質(zhì)濃度提高2倍，考察轉(zhuǎn)化情況。

1.9 底物與產(chǎn)物的分析檢測(cè)方法

1.9.1 反應(yīng)液衍生化

反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液離心，取250μL上清轉(zhuǎn)移到5mL離心管中，加入250μL 2mol/L pH9.2的硼酸緩沖液，再加入500μL 5倍過(guò)量的芴甲氧羰酰氯（Fmoc-Cl）乙腈溶液，待衍生化反應(yīng)完成后加入500μL對(duì)Fmoc-Cl兩倍過(guò)量的2-氨基金剛烷(ADAM)的乙腈/水（1∶1，體積比）溶液，阻止過(guò)量的Fmoc-Cl水解。溶液用0.22μm的有機(jī)膜過(guò)濾后用HPLC檢測(cè)。1.9.2 HPLC檢測(cè)條件

Diomansil C18柱（250mm×4.6mm），流速1.0mL/min，紫外檢測(cè)器263nm，流動(dòng)相A為50mmol/L 的NaAc-HAc 緩沖體系，pH值為4.2，流動(dòng)相B為乙腈。采用50∶50等度洗脫。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)雙加氧酶菌株的篩選

根據(jù)文獻(xiàn)，產(chǎn)雙加氧酶的微生物種類較多，如Rhodococcus[12]、Pseudomonas[13-15]、Klebsiella[16]、Exophiala[17]、Bacillus[6，18-19]、Aspergillus[20]等，因?yàn)檠挎邨U菌中的雙加氧酶在轉(zhuǎn)化羥基化方面酶活較高，轉(zhuǎn)化性能較好[6，21-22]，因此本研究利用專一性篩選芽孢桿菌的方法從土樣中篩選獲得芽孢桿菌，按1.2.1節(jié)的方法從自然界土樣中共得到芽孢桿菌579株。

將得到的芽孢桿菌分別按照酶標(biāo)顯色檢測(cè)和TLC檢測(cè)兩種篩選方法進(jìn)行進(jìn)一步的篩選，結(jié)果如圖2所示。通過(guò)酶標(biāo)顯色方法共得到364株菌株，顯色為深藍(lán)色[如圖2(a)所示，顯色越深，吸光度值越大]；將這364株菌株再通過(guò)TLC檢測(cè)，共得到56株候選菌株。從以上篩選得到的菌株中選取酶標(biāo)儀檢測(cè)值高，且TLC檢測(cè)目的產(chǎn)物斑較大的菌株[如圖2(b)所示]，可初步確定其具有加氧酶酶活。

圖2 酶標(biāo)板的反應(yīng)顯色和TLC檢測(cè)的產(chǎn)物斑

2.2 加氧酶基因的克隆與表達(dá)

以篩選到的芽孢桿菌中篩選現(xiàn)象最明顯的菌株基因組DNA為模板，用設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物進(jìn)行PCR，PCR后得到的目的條帶經(jīng)純化與pMD19-T載體連接，經(jīng)酶切鑒定，獲得重組質(zhì)粒pMD19-T-ido。基因測(cè)序結(jié)果顯示基因長(zhǎng)度723 bp，編碼240個(gè)氨基酸；IDO氨基酸序列比對(duì)結(jié)果如圖3所示，與其他7個(gè)類似蛋白的氨基酸序列一致性達(dá)96.65%。目的基因表達(dá)產(chǎn)物的序列分析表明，本研究篩選獲得的菌株含有一種新型的潛在雙加氧酶。

用表達(dá)引物通過(guò)PCR從重組質(zhì)粒pMD19-T-ido中調(diào)取ido基因，構(gòu)建重組的表達(dá)質(zhì)粒pET 28a-ido，并將其轉(zhuǎn)化至E. coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE分析可知，重組菌在接近29 kDa處比對(duì)照多出一條蛋白條帶，表明重組酶IDO在大腸桿菌中獲得表達(dá)，其相對(duì)分子質(zhì)量約為31 kDa。對(duì)IPTG的濃度進(jìn)行優(yōu)化可知，當(dāng)IPTG濃度為0.5mmol/L時(shí)，可溶性蛋白表達(dá)量較大，在0.5mmol/L IPTG的誘導(dǎo)情況下，誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化結(jié)果如圖4所示，由圖4可知，在30℃時(shí)的可溶性蛋白表達(dá)量最大。因此該重組菌誘導(dǎo)表達(dá)的最佳溫度定為30℃，IPTG濃度定為0.5mmol/L。

圖3 加氧酶氨基酸序列比對(duì)結(jié)果

圖4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

圖5 α-KG濃度對(duì)產(chǎn)率的影響

2.3 重組菌轉(zhuǎn)化反應(yīng)

2.3.1 反應(yīng)體系組成對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)率總體優(yōu)于粗酶液轉(zhuǎn)化體系，因此本實(shí)驗(yàn)選取全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行下一步的優(yōu)化。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果如下。

由于雙加氧酶IDO催化Ile羥基化生成4-HIL的過(guò)程與α-KG生成琥珀酸的過(guò)程相偶聯(lián)，所以α-KG是作為該催化反應(yīng)的輔底物參與上述反應(yīng)，由圖5可知當(dāng)α-KG的濃度在0～40mmol/L變化時(shí)，轉(zhuǎn)化產(chǎn)率變化不大，超過(guò)40mmol/L，產(chǎn)率急劇下降至0。根據(jù)文獻(xiàn)[6]，α-KG是該轉(zhuǎn)化反應(yīng)所必需的，從圖5可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)不添加α-KG時(shí)，轉(zhuǎn)化反應(yīng)的產(chǎn)率也在60%以上，這與已有報(bào)道酶液反應(yīng)體系不同，可能是由于細(xì)胞內(nèi)源的α-KG在參與反應(yīng)，解決了酶液反應(yīng)體系所不能克服的輔底物α-KG的循環(huán)再生、Ile羥基化反應(yīng)與α-KG轉(zhuǎn)化為琥珀酸反應(yīng)的偶聯(lián)等問(wèn)題，體現(xiàn)了全細(xì)胞反應(yīng)體系的優(yōu)勢(shì)。

抗壞血酸并不是雙加氧酶IDO轉(zhuǎn)化反應(yīng)所必需的，但卻可以極大地促進(jìn)反應(yīng)速率[6]，因此由圖6可看出，其對(duì)反應(yīng)產(chǎn)率的影響不大，抗壞血酸濃度在0～50mmol/L變化時(shí)，產(chǎn)率都維持在60%左右，但總體呈現(xiàn)先上升后維持不變的趨勢(shì)，因此全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系只需在反應(yīng)前期補(bǔ)充少量抗壞血酸即可滿足反應(yīng)所需，與已報(bào)道的酶液反應(yīng)體系相比，該轉(zhuǎn)化體系在資源消耗方面更經(jīng)濟(jì)。

根據(jù)文獻(xiàn)[23]，多數(shù)雙加氧酶催化反應(yīng)時(shí)要利用鐵離子金屬中心與底物等物質(zhì)發(fā)生作用，因此亞鐵離子是該酶促反應(yīng)所必需的。由圖7可知，隨著亞鐵離子濃度的增大，產(chǎn)率也逐漸增大，當(dāng)亞鐵離子濃度為0.5mmol/L時(shí)，產(chǎn)率達(dá)到最大，且之后隨著亞鐵離子濃度的增大，產(chǎn)率基本保持不變。

作為該轉(zhuǎn)化反應(yīng)的關(guān)鍵底物，Ile的影響尤為重要。由圖8可知，底物濃度對(duì)產(chǎn)率的影響呈罩鐘形，隨著底物濃度的增大，產(chǎn)率先增大后減小，在底物濃度為10mmol/L左右達(dá)到最大。當(dāng)?shù)孜餄舛却笥?0mmol/L時(shí)，體系表現(xiàn)出明顯的底物抑制。

2.3.2 反應(yīng)條件對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

由圖9知該重組菌的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系在pH值中性左右產(chǎn)率變化不大，在pH值為7.5時(shí)產(chǎn)率相對(duì)其他略微偏高，隨著pH值的增大，產(chǎn)率逐漸下降。有文獻(xiàn)報(bào)道[11]，在堿性條件下，構(gòu)成細(xì)胞細(xì)胞膜的雙脂層可能被部分溶解，擴(kuò)大了細(xì)胞通道，有利于產(chǎn)物可底物的進(jìn)出細(xì)胞，從而使細(xì)胞表現(xiàn)出更高的酶活性，這可能是導(dǎo)致pH值為9.5時(shí)產(chǎn)率較高的原因。

反應(yīng)體系溫度影響菌體細(xì)胞所產(chǎn)酶的催化活性[24]，由圖10知溫度對(duì)該轉(zhuǎn)化反應(yīng)影響不大，產(chǎn)率隨著溫度的上升總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在28℃時(shí)，轉(zhuǎn)化反應(yīng)產(chǎn)率相對(duì)較高。

2.3.3 細(xì)胞質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

圖7 亞鐵離子濃度對(duì)產(chǎn)率的影響

圖8 異亮氨酸濃度對(duì)產(chǎn)率的影響

圖9 反應(yīng)體系pH值對(duì)產(chǎn)率的影響

圖10 反應(yīng)體系溫度對(duì)產(chǎn)率的影響

雙加氧酶IDO催化的反應(yīng)需要氧氣參與，體系中細(xì)胞的多少影響著氧氣的利用速率和效果，進(jìn)而影響反應(yīng)的產(chǎn)率。由圖11所示，細(xì)胞質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)產(chǎn)率的影響與常規(guī)反應(yīng)現(xiàn)象不同的是，在細(xì)胞質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%時(shí)產(chǎn)率已達(dá)最高，可達(dá)84%，隨著細(xì)胞質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，因反應(yīng)體系黏度過(guò)大，物質(zhì)傳遞以及氧氣供應(yīng)都受限，產(chǎn)率急劇下降。

圖11 細(xì)胞質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)產(chǎn)率的影響

2.3.4 過(guò)夜溫育細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

根據(jù)文獻(xiàn)[11]，在不同溫度（低于酶失活溫度）下處理過(guò)的菌體，其細(xì)胞結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化，致使部分酶擴(kuò)散至細(xì)胞外，部分消除了物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞的擴(kuò)散限制，從而使這種細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效果更好。從圖12可以看出，在底物濃度為20mmol/L時(shí)，經(jīng)過(guò)20℃、30℃溫育后，體系的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率明顯高于對(duì)照組，且在30℃溫育后的菌體的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率達(dá)85%以上，因此本研究利用該方法在全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系的底物濃度為20mmol/L時(shí)，將轉(zhuǎn)化率提高至85%以上。

圖12 不同溫度溫育后的菌體的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率

3 結(jié) 論

本研究以異亮氨酸Ile為底物，從自然界土樣中篩選得到的芽孢桿菌出發(fā)，通過(guò)酶標(biāo)顯色篩選和薄層層析（TLC）篩選得到一株有雙加氧酶IDO活性的菌株，可將L-Ile特異性的轉(zhuǎn)化成4-羥基-L-異亮氨酸（4-HIL）。通過(guò)PCR獲得新型雙加氧酶基因ido，并將其克隆表達(dá)，獲得重組菌，對(duì)該重組菌的誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳誘導(dǎo)條件為0.5 mmol/L的IPTG濃度和30℃的誘導(dǎo)溫度。重組菌誘導(dǎo)表達(dá)后獲得的菌體用于全細(xì)胞體系的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，檢測(cè)到IDO酶特異性催化L-Ile形成的4-HIL，驗(yàn)證了重組酶的活性。對(duì)以上全細(xì)胞轉(zhuǎn)化的反應(yīng)條件和反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞濃度、底物L(fēng)-Ile、FeSO4·7H2O的配比為5%、10mmol/L、0.5mmol/L，在pH 值為7.5、28℃條件下，轉(zhuǎn)化效果最好；且當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)，不加α-KG和抗壞血酸即可滿足反應(yīng)所需，當(dāng)?shù)孜餄舛容^高時(shí)，可適量補(bǔ)充這兩種物質(zhì)。為增大底物量，本研究采取30℃溫育過(guò)夜的細(xì)胞來(lái)轉(zhuǎn)化反應(yīng)，在底物L(fēng)-Ile 濃度為20mmol/L時(shí)，可以達(dá)到85%以上的產(chǎn)率。本研究對(duì)ido基因的篩選和克隆表達(dá)以及對(duì)重組菌的轉(zhuǎn)化反應(yīng)優(yōu)化、不對(duì)稱合成4-HIL的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

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A novel isoleucine dioxygenase and its expression in recombinant Escherichia coli for synthesis of 4-hydroxyisoleucine

FU Minjie1，NIE Yao1，MU Xiaoqing1，XU Yan1，2，XIAO Rong3
（1School of Biotechnology，Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，Jiangsu，China;2State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，
Jiangsu，China;3Center for Advanced Biotechnology and Medicine，Rutgers University，New Jersey 08854，USA）

:Isoleucine dioxygenase (IDO) could hydroxylyze L-isoleucine (L-Ile) to produce 4-hydroxy-L-isoleucine (4-HIL)，which increases glucose-induced insulin release and is usually used in pharmaceuticals with antidiabetic and cholesterol-reducing properties. The strain with dioxygenase activity was screened from natureviacombination of reaction coloration assayed by spectrophotometer and thin-layer chromatography (TLC). The gene encoding IDO (ido) was cloned and expressed inEscherichia coliand the constructed recombinant strain exhibited the function of isoleucine hydroxylation. The reaction conditions were optimized and the yield of transformation with the recombinant whole cells was increased to more than 85% by incubating the cells overnight at 30℃. The newly identified IDO and involved recombinant whole cells would be promising to prepare 4-HIL with high efficiency.

isoleucine dioxygenase; isoleucine; hydroxyl isoleucine; biotransformation; recombinant expression

Q 815

A

1000-6613（2014）11-3037-08

10.3969/j.issn.1000-6613.2014.11.034

2014-02-27；修改稿日期：2014-03-24。

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（2011CB710800）、國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（2011AA02A209、2011AA02A210）、國(guó)家自然科學(xué)基金（21376107、21336009）、高等學(xué)校學(xué)科創(chuàng)新引智計(jì)劃（111計(jì)劃）（111-2-06）、高端外國(guó)專家項(xiàng)目（GDW20133200113）及江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目。

付敏杰（1988—），女，碩士研究生。E-mail jieminfu@yeah. net聯(lián)系人：聶堯，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向酶技術(shù)。E-mail ynie@ jiangnan.edu.cn。徐巖，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail yxu@jiangnan.edu.cn。