劉 軍 曹建剛 姚慶斌 李稚君1, 付 鑫 馬信龍,4△
鈣敏感受體在人骨關節(jié)炎軟骨中的表達研究
劉 軍1,2曹建剛1,2姚慶斌3李稚君1,3付 鑫2馬信龍1,2,4△
目的 研究鈣敏感受體(CaSR)在人骨性關節(jié)炎(OA)軟骨中的表達強度,探討其與OA發(fā)病機制的關系。方法收集5例因膝關節(jié)OA接受全膝關節(jié)置換術患者的股骨遠端及脛骨近端標本,HE染色后根據(jù)Collins病理學分級標準進行關節(jié)軟骨退變分級,Collins 0級切片8張為軟骨正常組,CollinsⅡ級切片8張為軟骨退變組,免疫組織化學染色后比較2組軟骨組織內CaSR的表達強度。結果CaSR在OA軟骨中陽性表達,CaSR在軟骨正常組的表達強度低于退變軟骨組(評分:1.63±0.95 vs 3.52±0.78,t=8.99,P<0.05)。結論CaSR活化與關節(jié)軟骨退變有關。
骨性關節(jié)炎;膝關節(jié);軟骨細胞;鈣敏感受體;免疫組織化學
骨性關節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種發(fā)病率很高的以軟骨退行性變和繼發(fā)骨質增生為主的慢性退行性骨關節(jié)疾病,多見于中老年人。臨床以關節(jié)軟骨損壞為主要病理特征,常影響患者的肢體功能和日常生活,嚴重時甚至造成關節(jié)殘疾?;颊哧P節(jié)軟骨細胞外基質合成與降解失衡是造成軟骨變性的重要原因之一。Yamaguchi等[1]發(fā)現(xiàn)在骨組織微環(huán)境中,軟骨細胞和成骨細胞中鈣敏感受體(CaSR)的活化能夠促進骨重建過程,但其與OA軟骨的關系尚未明確。本研究通過觀察CaSR在膝關節(jié)OA軟骨組織中的表達水平,探討其在OA中的作用。
1.1 一般資料 選取在我院接受全膝關節(jié)置換的患者5例,其中女4例,男1例,年齡58~71歲,平均(65.40±5.32)歲;病史5.5~20.0年,平均(12.70±5.43)年。納入標準:(1)符合中華醫(yī)學會骨科學分會提出的骨關節(jié)炎診治指南(2007版)中骨關節(jié)炎的診斷依據(jù),并經(jīng)膝關節(jié)置換術中證實。(2)無心血管、肝、腎等重要臟器病變。(3)術前4周未使用非甾體類抗炎藥、皮質醇等。排除類風濕、感染性關節(jié)炎等其他關節(jié)疾患者。
1.2 主要試劑及耗材 CaSR抗體(Sigma公司),即用型高效免疫組化二抗試劑盒(優(yōu)寧維生物公司),乙醇、二甲苯、PBS緩沖液、蒸餾水、防脫玻片、蓋玻片、顯微鏡等由天津醫(yī)科大學組織與胚胎學教研室提供。
1.3 實驗方法 將全膝關節(jié)置換術中所取軟骨及含軟骨下骨標本用生理鹽水沖洗后,肉眼初步篩選出軟骨表面光滑的輕、中度退變組織塊,切成1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm小塊,用體積分數(shù)為10%的福爾馬林固定,自動脫水機脫水(全程14 h),58~60℃石蠟包埋,5例膝關節(jié)標本共制作蠟塊24枚,垂直于關節(jié)軟骨切取5 μm厚組織切片。對組織切片進行HE染色后,根據(jù)Collins病理學分級標準將關節(jié)軟骨退變分級如下[2]:0級為關節(jié)軟骨正常,軟骨細胞分布均勻。Ⅰ級為軟骨淺表可見切線裂隙。Ⅱ級為縱行裂隙形成,軟骨細胞增殖并呈簇狀排列。Ⅲ級為深部裂隙形成,裂隙累及軟骨全層深達鈣化帶,軟骨剝脫,深部偶見少量軟骨細胞增殖呈簇狀排列。Ⅳ級為侵蝕軟骨下組織,軟骨完全剝脫,軟骨下骨暴露,見明顯骨贅。選取Collins 0級切片8張標記為軟骨正常組,CollinsⅡ級切片8張標記為軟骨退變組,分別對2組源蠟塊再次切片后進行免疫組織化學染色,按二步法免疫組化染色試劑盒說明書進行操作,然后鏡下觀察。
1.4 免疫組化染色結果判定 采用半定量積分法對每張切片的陽性細胞率及陽性細胞著色強度進行分級記分,然后根據(jù)兩項之和確定其陽性強度[3]。陽性細胞率即陽性細胞占計數(shù)細胞的比例,每張切片計數(shù)5個400倍視野細胞:陽性細胞率10%為0分;10%~25%為1分;25.1%~50%為2分;50.1%~70%為3分;70.1%~100%為4分。陽性細胞著色強度:僅細胞核藍色者為陰性,細胞漿棕黃色或棕褐色顆粒者為陽性。陰性(-)為0分,弱陽性(+)為1分,陽性(++)為2分,強陽性(+++)為3分。
1.5 統(tǒng)計學方法 使用軟件SPSS 19.0進行統(tǒng)計學分析處理,計量資料采用±s表示,組間比較采用t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 HE染色結果 軟骨正常組關節(jié)軟骨基本正常,軟骨細胞排列均勻,見圖1;Ⅰ級切片5張,軟骨表面見微小切線裂隙,少量簇聚的軟骨細胞;Ⅱ級切片8張,可見軟骨縱行裂隙形成,軟骨細胞增生并呈簇狀排列,見圖2;Ⅲ級切片2張,軟骨深部裂隙形成,裂隙達鈣化帶(潮線),偶見簇聚軟骨細胞;Ⅳ級切片1張,可見軟骨下組織侵蝕,軟骨剝脫、缺失,軟骨下骨暴露,軟骨細胞少,排列凌亂,基質染色不均勻。
2.2 免疫組織化學結果 CaSR在膝OA軟骨中陽性表達,陽性細胞染色位于軟骨細胞胞漿中,分布密集呈棕黃色顆粒狀,在OA退變期軟骨細胞中的表達強度明顯增高。CaSR在膝關節(jié)退變軟骨(Collins病理分級Ⅱ級)中存在較高強度的表達,見圖3;在正常膝關節(jié)軟骨(Collins病理分級0級)中表達較少或無表達,見圖4。CaSR在軟骨正常組的表達強度低于軟骨退變組(評分:1.63±0.95 vs 3.52±0.78,t=8.99,P<0.05)。
OA是一種最為常見的非炎性滑膜關節(jié)疾病,目前對該病的病因和發(fā)病機制尚不完全清楚。研究發(fā)現(xiàn),軟骨細胞的凋亡過度是關節(jié)軟骨退變發(fā)展成OA的重要原因[4]。CaSR是G蛋白偶聯(lián)受體的C家族成員,由氨基胞外域、7個跨膜螺旋的跨膜域和胞內羧基尾部組成。CaSR主要分布在參與鈣穩(wěn)態(tài)調節(jié)的甲狀旁腺、胃腸道、骨組織和腎組織以及其他細胞(如中樞和外周神經(jīng)、肝臟,血細胞、胰腺β細胞等),其功能主要是維持Ca2+和其他金屬離子穩(wěn)態(tài),還可調節(jié)細胞增殖、分化、離子通道開啟、激素分泌等[5-6]。動物實驗研究證實OA軟骨組織中存在CaSR的表達,且軟骨細胞和成骨細胞中CaSR的活化能促進骨重建過程[1,7]。為進一步證實人OA軟骨與CaSR之間的關系,本研究通過免疫組織化學方法證實了人OA軟骨中存在CaSR的表達,且其表達強度與軟骨退變程度相關。CaSR在Collins病理分級為Ⅱ級軟骨中的表達顯著高于0級的軟骨組織,但由于本研究排除了軟骨細胞較少的Ⅲ級、Ⅳ級軟骨組織切片,所以并不能證實OA中CaSR與軟骨退變程度存在正相關。
國內外目前關于CaSR在骨關節(jié)炎中表達機制的研究較少,尤其是在人膝關節(jié)軟骨細胞退變病理過程中CaSR的功能表達及其病理生理意義報道更少。盡管研究已證實,在成骨細胞中CaSR可促進細胞增殖、分化以及礦化作用;而在破骨細胞中,CaSR可引起細胞分化和凋亡[8-9]。但由于關節(jié)軟骨主要由軟骨細胞和細胞外基質構成,與骨代謝有所不同,軟骨細胞通過分解代謝和合成代謝的細胞因子來調節(jié)保持微環(huán)境的平衡。根據(jù)軟骨細胞的調節(jié)功能,可以把細胞因子分為分解代謝的細胞因子,包括:白細胞介素(IL)-1,腫瘤壞死因子(TNF)-α,IL-17,IL-18等;合成代謝的細胞因子,包括:胰島素樣生長因子(IGF)1,轉化生長因子(TGF)-β,骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)2、4、6等[10]。因此以后研究CaSR在OA軟骨組織中的作用可圍繞與OA相關的細胞因子展開。
Fig.1 HE staining showed Collins grade 0,structural integrity of cartilage,evenly distributed chondrocytes(×100)圖1 HE染色后Collins病理分級0級,軟骨結構完整,軟骨細胞均勻分布(×100)
Fig.2 HE staining showed Collins gradeⅡ,fissures formed in deep of cartilage,cartilage cells arranged in clusters(×100)圖2 HE染色后Collins病理分級Ⅱ級,可見軟骨深部裂隙形成,軟骨細胞成簇排列(×100)
Fig.3 CaSR showed brown granular cytoplasm in the articular chondrocytes of knee OA of Collins gradeⅡ(×400)圖3 CaSR在膝OA Collins病理分級Ⅱ級的關節(jié)軟骨細胞胞漿中呈棕黃色顆粒狀(×400)
Fig.4 CaSR weakly expressed in the articular chondrocytes of knee OA of Collins grade 0(×400)圖4 CaSR在膝OA Collins病理分級0級的關節(jié)軟骨細胞胞漿中僅見弱表達(×400)
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(2014-01-12收稿 2014-04-25修回)
(本文編輯 閆娟)
The Expression of Calcium-Sensing Receptor in Human Osteoarthritis Cartilage
LIU Jun1,2,CAO Jiangang1,2,YAO Qingbin3,LI Zhijun1,3,F(xiàn)U Xin2,MA Xinlong1,2,4△
1 General Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300052,China;2 Department of Joint Surgery,Tianjin Hospital; 3 Basic Medical College of Tianjin Medical University;4 Tianjin Institute of Integrative Medicine Orthopedics,Tianjin Hospital△
E-mail:maxinlong8686@sina.com
ObjectiveTo investigate calcium-sensing receptor(CaSR)expression level in osteoarthritis(OA)cartilage,and the relationship with OA pathogenesis thereof.MethodsThe degenerated human cartilage of distal femur and proximal tibia came from 5 patients with OA underwent total knee replacement surgery.The tissue specimens were stained by HE.According to the Collins histological grading standards,articular cartilage degeneration was classificated in specimens.Eight HE slices of Collins grade 0 were used as normal cartilage group.Eight HE slices of Collins gradeⅡwere used as degeneration cartilage group.The CaSR expression levels detected by immunohistochemical staining technique were compared between two groups.ResultsExpression of CaSR was detected in osteoarthritis cartilage.The expression intensity of CaSR was significantly lower in normal cartilage group than that of degeneration of cartilage group(score:1.63±0.95 vs 3.52± 0.78,t=8.99,P<0.05).ConclusionThe activation of CaSR is associated with the degeneration of articular cartilage.
osteoarthritis;knee;chondrocyte;calcium-sensing receptor;immunohistochemistry
R684.3
A
10.3969/j.issn.0253-9896.2014.09.018
天津市衛(wèi)生局科技基金重點項目(2013kz063)
1天津醫(yī)科大學總醫(yī)院骨科(郵編300052);天津市天津醫(yī)院關節(jié)外科;3天津醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院;4天津醫(yī)院、天津市中西醫(yī)結合骨科研究所
△通訊作者 E-mail:maxinlong8686@sina.com