神經(jīng)降壓素在雄激素非依賴性前列腺腫瘤動物模型中的表達

王 江蔣 寧尚芝群 陳 靖方軍凱張 超牛遠杰△

神經(jīng)降壓素在雄激素非依賴性前列腺腫瘤動物模型中的表達

王 江1，2蔣 寧1尚芝群1陳 靖1方軍凱2張 超3牛遠杰1△

目的 觀察神經(jīng)降壓素（NT）在原位前列腺腫瘤動物模型中的表達。方法利用原位種植包埋法和外科手術(shù)去勢技術(shù)對Balbc-nu裸鼠分別構(gòu)建雄激素依賴、去勢3 d和雄激素非依賴性原位前列腺腫瘤動物模型；Affymetrix基因芯片技術(shù)檢測NT在3組腫瘤組織中mRNA的表達差異，運用熒光實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）驗證結(jié)果；HE染色在光鏡下觀察腫瘤組織病理學改變；ELISA法測定裸鼠血清前列腺特異性抗原（PSA）濃度；免疫組織化學法檢測3組腫瘤組織中NT的蛋白相對表達量。結(jié)果與雄激素依賴組比較，雄激素非依賴組和去勢3 d 組NTmRNA表達分別上調(diào)5.10和下調(diào)0.33；用RT-PCR和qRT-PCR驗證其結(jié)果，雄激素非依賴組的表達水平較雄激素依賴組分別上調(diào)1.41和7.27（P＜0.01），去勢3 d組的表達水平分別下調(diào)0.78和0.46（P＜0.05）；腫瘤組織HE染色可見明顯的核異型性和瘤節(jié)結(jié)構(gòu)；雄激素依賴組PSA和NT結(jié)果均分別為（0.48±0.03）μg/L和0.031±0.008，去勢3 d組均分別為（0.17±0.03）μg/L和0.021±0.004，雄激素非依賴組均分別為（0.87±0.02）μg/L和0.042±0.010；與雄激素依賴組比較，去勢3 d組表達降低，雄激素非依賴組表達升高（P＜0.01）。結(jié)論NT在前列腺腫瘤由雄激素依賴向雄激素非依賴這一變化過程中起著一定的作用，可以作為雄激素非依賴性前列腺腫瘤治療靶點和特異性診斷指標。

前列腺腫瘤；小鼠,裸；疾病模型,動物；芯片分析技術(shù)；聚合酶鏈反應(yīng)；免疫組織化學；神經(jīng)降壓肽

前列腺腫瘤是西方國家常見的惡性腫瘤之一，死亡率位于男性惡性腫瘤的首位[1]；我國前列腺腫瘤占泌尿系腫瘤的比例由20世紀60年代的3.3％上升到90年代的13.4％，僅次于膀胱癌及腎癌[2]。由于臨床上尚無有效的方法治療或遏制雄激素非依賴性前列腺腫瘤（androgen independent prostate cancer，AIPC）的生長，AIPC的發(fā)生和治療成為前列腺腫瘤治療中最棘手的問題[3]。神經(jīng)降壓素（neurotensin，NT）是從牛下丘腦分離獲得的由13個氨基酸組成的多肽，可通過自分泌、旁分泌或內(nèi)分泌作用對細胞發(fā)揮神經(jīng)遞質(zhì)或局部激素的生理作用[4]。NT對體內(nèi)和體外培養(yǎng)的癌細胞分別起到營養(yǎng)和增殖分化作用[5]。在正常前列腺組織內(nèi)沒有NT，但雄激素依賴前列腺腫瘤（androgen dependent prostate cancer，ADPC）和AIPC中存在且有NT分泌[6]。由于AIPC標本的收集和原位前列腺腫瘤動物模型建立均比較困難，NT在前列腺腫瘤激素依賴性轉(zhuǎn)變過程中的表現(xiàn)尚鮮見報道。本研究利用基因芯片技術(shù)、酶聯(lián)免疫法和免疫組化等技術(shù)，觀察NT在原位前列腺腫瘤動物模型上的表達，進一步探討NT在AIPC進展中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料 6周齡Balbc-nu雄性裸鼠32只，體質(zhì)量16～18 g，購自中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所資源研究開發(fā)中心，合格證號SCXK2009-0004；LNCaP細胞購自美國ATCC公司；兔抗人多克隆NT抗體(BML-NA1230)，200 μL購自Enzo公司；DAB試劑盒購自北京中杉金橋；即用型SP免疫組化通用試劑盒購自天津市津脈基因測繪技術(shù)有限公司；日本Nikon ECLIPSE90i光學顯微鏡照相系統(tǒng)購自日本Nikon公司；分光光度計BioPhptpmeter購自美國eppenddorf公司；DYY-6C型電泳儀購自北京市六一儀器廠；Tanon-1600全自動數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司；ABI7900高通量實時熒光定量PCR系統(tǒng)購自廣東華運儀生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組 裸鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，利用隨機數(shù)字表將動物均分為雄激素依賴組、去勢3 d組、雄激素非依賴組和空白對照組，每組8只。給予規(guī)律光照，常規(guī)喂養(yǎng)。

1.2.2 模型的建立 取對數(shù)生長期的LNCap細胞，注射到裸鼠腋下，待荷瘤生長1個月在無菌條件下收獲皮下腫瘤，分別接種到雄激素依賴組、去勢3 d組與雄激素非依賴組裸鼠前列腺前葉包膜下，并同時接種到雙側(cè)腋下以作標記，密切觀察裸鼠腋下腫瘤的生長變化。（1）雄激素依賴組：待腫瘤生長至2個月收獲前列腺原位腫瘤。（2）去勢3 d組：待腫瘤生長至2個月予以雙側(cè)睪丸手術(shù)去勢，待去勢3 d后收獲前列腺原位腫瘤。（3）雄激素非依賴組：前列腺原位接種15 d予以雙側(cè)睪丸手術(shù)去勢，待去勢2個月后收獲裸鼠前列腺原位腫瘤。（4）空白對照組：僅做雙側(cè)腋下和腹部切開縫合，術(shù)后予以觀察，常規(guī)喂養(yǎng)。

1.2.3 標本的獲得 分別取同代雄激素依賴組、去勢3 d組與雄激素非依賴組原位前列腺腫瘤組織，經(jīng)天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院病理科醫(yī)師證實后，-80℃凍存組織并制作4 μm石蠟切片。

1.2.4 基因芯片 分別取同代-80℃低溫保存原位腫瘤組織，利用北京博奧生物有限公司生物檢測實驗室Affymetrix表達譜芯片技術(shù)觀察NT基因在3組腫瘤組織間表達的差異，利用分子功能注釋系統(tǒng)（Molecule Annotation System，MAS）進行數(shù)據(jù)分析[7]。

1.2.5 熒光實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測NT mRNA表達量 取新鮮或-80℃凍存雄激素依賴組、去勢3 d組和雄激素非依賴組原位腫瘤組織，TRNzol提取組織mRNA，紫外分光光度計測定260 nm和280 nm兩個波長處的吸光度（A）值，測定A260計算RNA濃度，A260/A280判定RNA純度，選取RNA A260/A280＞1.8的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。每個實驗樣本平行重復(fù)測量3次，對cDNA進行4個10×連續(xù)梯度稀釋，用無DNA模板作陰性對照。qRTPCR 25 μL反應(yīng)體系：SYBR Green qPCR Master Mix 12.5 μL，上游引物0.75 μL，下游引物0.75 μL，模板DNA 2 μL，DEPC 水9 μL。根據(jù)GenBank上公布的人類NT mRNA及β-actin mRNA序列，應(yīng)用Primer5軟件設(shè)計引物，NT上游引物5′-GCCAGCTGAAGGAAAGAGGAAGTGC-3′，下游引物5′-TCCAGGAGCTGAAAGCCAGGAGT-3′，產(chǎn)物長度150 bp。βactin上游引物5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，下游引物5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′，產(chǎn)物長度205 bp，同一標本擴增以β-actin作為內(nèi)參照。最佳反應(yīng)條件為三步法：50℃UDG預(yù)處理2 min，95℃預(yù)變性10 min后，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，重復(fù)40個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。凝膠自動成像儀采集圖像并分析測定電泳條帶，相對灰度比值=目的基因/β-actin。qRT-PCR擴增產(chǎn)物采用2-△△Ct相對定量方法進行數(shù)據(jù)分析[8]。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測裸鼠血清前列腺特異抗原（PSA）濃度 酶標板與試劑復(fù)溫，A1、A2和C11孔分別做質(zhì)控點、陰性對照點和空白點，A3～C10加入50 μL樣本+50 μL血清，除C11空白孔以外，每孔加入25 μL一抗和生物素，20～23℃孵育2 h，洗板4遍，加入SA-HRP 100 μL/孔，20～23℃孵育1 h，洗板4遍，加入TMB顯色，20～23℃孵育1 h，加入終止液，450 nm下酶標儀讀數(shù)。

1.2.7 HE染色 將4％多聚甲醛固定組織標本，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋、切片后，行常規(guī)HE染色，光鏡下觀察腫瘤組織病理學改變。

1.2.8 免疫組織化學染色 將4 μm石蠟切片常規(guī)脫蠟，乙醇脫水，3％過氧化氫孵育10 min，PBS沖洗，枸櫞酸鹽微波修復(fù)抗原，10％正常封閉血清封閉，室溫孵育15 min，加兔抗人一抗4℃過夜，PBS替代一抗作為陰性對照，PBS沖洗，加山羊抗兔二抗37℃孵育25 min，PBS沖洗，辣根過氧化物酶37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹脂封固。

1.2.9 染色結(jié)果判斷 利用日本Nikon ECLIPSE90i光學顯微鏡全自動圖像分析系統(tǒng)進行彩色圖像的采集與存儲，所有照片均在相同條件下完成，以細胞漿或細胞核中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒作為陽性細胞。陽性細胞須細胞結(jié)構(gòu)清晰、陽性顆粒定位性好、著色明顯高于背景。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件在免疫組化圖片隨機讀取10個視野進行數(shù)據(jù)分析，測量具有染料色調(diào)的區(qū)域（AOI）和該區(qū)域的累積光密度（IOD）；計算出每張圖片的平均光密度值（MOD），MOD＝SUM（IOD）/SUM（AOI）。MOD值越高，表達越強。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 11.0軟件進行實驗數(shù)據(jù)分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用完全隨機設(shè)計方差分析，多重比較采用LSD檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 基因芯片結(jié)果 雄激素非依賴組腫瘤組織NT表達高于雄激素依賴組，差異倍數(shù)為5.10（|統(tǒng)計量Score(d)|=0.001 78，差異倍數(shù)Fold Change=5.10）；去勢3 d組腫瘤組織NT的表達低于雄激素依賴組，差異倍數(shù)為0.33（|統(tǒng)計量Score(d)|=1.437，差異倍數(shù)Fold Change=0.33）。

2.2 RT-PCR結(jié)果 電泳結(jié)果顯示NT、β-actin條帶位置正確，引物特異性好，無非特異性產(chǎn)物或引物二聚體出現(xiàn)，見圖1。雄激素依賴組、去勢3 d組和雄激素非依賴組相對灰度比值分別為0.88±0.12、0.69±0.13 和1.24±0.15，差異有統(tǒng)計學意義（n=8，F(xiàn)=33.038，P＜0.01）；與雄激素依賴組比較，去勢3 d組下調(diào)0.78 （P＜0.05）；雄激素非依賴組上調(diào)1.41倍（P＜0.01）。

2.3 qRT-PCR擴增結(jié)果 擴增過程中只出現(xiàn)1個NT擴增產(chǎn)物高峰，未見非特異峰，無非特異擴增產(chǎn)物及引物二聚體的形成；擴增曲線均呈典型的S形曲線，目的基因NT在20～25個循環(huán)范圍內(nèi)出現(xiàn)突增，而內(nèi)參基因β-actin在15～20個循環(huán)范圍內(nèi)出現(xiàn)突增，見圖2。

Fig.1 Agarose gel electrophoretogram of NT and β-actin products detected by RT-PCR圖1 NT和β-actin基因擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果

Fig.2 The amplification plot and melting curves of NT and β-actin圖2 NT基因與β-actin基因的擴增曲線和熔解曲線

雄激素依賴組、去勢3 d組與雄激素非依賴組NT相對表達量差異有統(tǒng)計學意義，雄激素非依賴組NT的基因表達水平是雄激素依賴組7.27倍，去勢3 d組是雄激素依賴組的0.46，見表1。

2.4 HE染色組織學 腫瘤細胞幾乎完全取代裸鼠正常前列腺組織，僅可見幾個殘存的正常前列腺腺腔結(jié)構(gòu)，原位前列腺腫瘤異型性明顯，核大深染，細胞排列紊亂，有巨核細胞，間質(zhì)成分少，瘤體中間無壞死，可見明顯的瘤結(jié)結(jié)構(gòu)，見圖3。

Tab.1 The relative expression of NT in three groups of tumor tissues表1 NT在3組腫瘤組織中的相對表達量(n=3，±s)

Tab.1 The relative expression of NT in three groups of tumor tissues表1 NT在3組腫瘤組織中的相對表達量(n=3，±s)

＊＊P＜0.01；a與雄激素依賴組比較，b與去勢3 d組比較，P＜0.01

組別雄激素依賴組去勢3 d組雄激素非依賴組F △Ct值4.643±0.193 5.762±0.241a1.781±0.484ab109.215＊＊△△Ct值0 1.119±0.180 -2.862±0.318 2-△△Ct 1 0.459 7.266

Fig.3 HE staining of prostate cancer in three groups（HE,×200）圖3 3組前列腺腫瘤組織HE染色結(jié)果（HE,×200）

2.5 裸鼠血清PSA濃度 空白對照組裸鼠PSA濃度為0 μg/L，雄激素依賴組、去勢3 d組和雄激素非依賴組PSA濃度(μg/L)分別為0.48±0.03、0.17±0.03 和0.87±0.02，3組差異均有統(tǒng)計學意義（n=8，F(xiàn)= 52.012，P＜0.01）。

2.6 NT免疫組化結(jié)果 雄激素依賴組、去勢3 d組和雄激素非依賴組MOD值分別為0.031±0.008、0.021±0.004和0.042±0.010，差異有統(tǒng)計學意義（n= 10，F(xiàn)=17.125，P＜0.01）；與雄激素依賴組比較，去勢3 d組出現(xiàn)NT表達下降（P＜0.05），而雄激素非依賴組NT表達增高（P＜0.05）。3組前列腺腫瘤組織NT免疫組化結(jié)果見圖4。

Fig.4 The positive expression of NT in three groups of tumor tissues（SABC,×200）圖4 NT在3組前列腺腫瘤組織的陽性表達（SABC,×200）

3 討論

3.1 成功建立原位前列腺腫瘤動物模型 原位種植是將腫瘤組織（或細胞懸液）移植到與腫瘤原發(fā)部位相對應(yīng)的移植宿主器官組織內(nèi)，由于原位移植可獲得與人體內(nèi)相同或相近的微環(huán)境，能更客觀模擬人體腫瘤的發(fā)展過程[9]。該模型被認為是目前最理想的前列腺腫瘤動物模型，能較好地模擬人體內(nèi)前列腺腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移的全過程。本研究結(jié)合皮下種植和原位種植包埋法首先建立了ADPC原位前列腺腫瘤動物模型，再利用手術(shù)去勢模擬前列腺腫瘤內(nèi)分泌治療，抑制雄激素依賴性腫瘤細胞的生長并出現(xiàn)PSA分泌下降。當前列腺腫瘤細胞逐漸適應(yīng)低雄激素環(huán)境后，PSA分泌也逐漸增加并出現(xiàn)持續(xù)高表達，提示前列腺腫瘤細胞的增殖已逐漸失去對雄激素的依賴，成功建立了AIPC原位前列腺腫瘤動物模型。HE染色和PSA變化支持本動物模型可以模擬臨床上前列腺腫瘤由雄激素依賴轉(zhuǎn)變?yōu)樾奂に胤且蕾囘^程，并能夠體現(xiàn)前列腺腫瘤各階段特點的動物模型。

3.2 NT在前列腺腫瘤的表達 近年來研究發(fā)現(xiàn)，NT在前列腺腫瘤組織中異常表達，Baxendale等[10]發(fā)現(xiàn)NT不僅可以促進雄激素敏感的LNCaP細胞增殖，還可以促進雄激素不敏感的LNCaP-Bic和C4-2b細胞增殖，利用NT拮抗劑SR 48692可以顯著抑制LNCaP、LNCaP-Bic和C4-2b細胞增殖。Almeida等[11]發(fā)現(xiàn)LNCaP細胞經(jīng)過無雄激素體外培養(yǎng)后，仍能合成和分泌NT，而且腫瘤細胞增殖和侵襲能力增強。Moody等[12]指出NT在AIPC LNCap-Bic細胞中其轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均上調(diào)，細胞增殖率明顯提高。

基因芯片結(jié)果顯示NT在去勢3 d組出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄下調(diào)，雄激素非依賴組出現(xiàn)明顯上調(diào)，再利用RTPCR和qRT-PCR進行驗證也出現(xiàn)類似表達；免疫組化結(jié)果顯示，NT翻譯水平在雄激素非依賴組的轉(zhuǎn)化過程中出現(xiàn)先降低后升高的變化趨勢。由此可見，在雄激素依賴組，去勢3 d組和雄激素非依賴組前列腺腫瘤NT均有轉(zhuǎn)錄和翻譯，而且在雄激素非依賴組表達最高。以上研究提示NT在前列腺腫瘤發(fā)生和發(fā)展中可能起到一定的作用，

3.3 NT在前列腺腫瘤內(nèi)分泌治療期的表現(xiàn)有待深入研究 本次研究還發(fā)現(xiàn)，在外科去勢治療后前列腺腫瘤出現(xiàn)NT翻譯和轉(zhuǎn)錄的降低，初步分析有以下2種可能：（1）因為ADPC腫瘤細胞減少導(dǎo)致NT合成和旁分泌減少，這一結(jié)論得到基因芯片、qRTPCR和免疫組化結(jié)果的支持。（2）作為配體依賴性的轉(zhuǎn)錄因子，NT在低雄激素環(huán)境下依然發(fā)揮細胞增殖和分化作用，NT及其受體相關(guān)的信號通路被頻繁激活使得大量NT被消耗，導(dǎo)致NT在內(nèi)分泌治療期出現(xiàn)低表達，但隨著腫瘤細胞的分化和神經(jīng)內(nèi)分泌細胞的增殖，NT分泌逐漸增多，最終當ADPC轉(zhuǎn)化為AIPC腫瘤細胞，NT出現(xiàn)較高表達。本次研究雄激素依賴組、去勢3 d組和雄激素非依賴組免疫組化圖片上均出現(xiàn)NT表達呈簇狀分布，且在激素非依賴組簇狀分布明顯增多并有融合趨勢，這可能與神經(jīng)內(nèi)分泌細胞參與NT的合成與分泌有關(guān)。因此，NT能否成為前列腺腫瘤內(nèi)分泌治療的靶點和非依賴性前列腺腫瘤的診斷指標有待進一步深入研究。

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（2014-04-09收稿 2014-05-20修回）

（本文編輯 李鵬）

The Expression of Neurotensin in Animal Model of Androgen Independent Prostate Cancer

WANG Jiang1，2，JIANG Ning1，SHANG Zhiqun1，CHEN Jing1，F(xiàn)ANG Junkai2，ZHANG Chao3，NIU Yuanjie1△
1 Tianjin Institute of Urologic Surgery,Second Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300211,China;2 Tianjin Municipal Research Institute for Family Planning;3 Tianjin Biomedical Material Key Laboratory,the Institute of Biomedical Engineering,CAMS and PUMC
△

E-mail:niuyuanjie@gmail.com

ObjectiveTo study the different expressions of neurotensin(NT)at gene and protein level in orthotopic model of prostate cancer.MethodsThe animal models of androgen dependent prostate cancer(ADPC,castrated for 3 days) and androgen independent prostate cancer(AIPC)were established by planting tumor tissue or undergoing surgical castration.Affymetrix microarray technology was carried out to compare the gene expressions of NT.The result was verified by qRT-PCR.HE staining was used to observe the change of pathology.ELSIA and immunohistochemistry technology were finally performed to detect protein expression of prostate-specific antigen(PSA)and NT in three different groups of prostate cancer tumor tissues.ResultsThe expression of NT was 5.10 times higher in AIPC group than that in ADPC group.The expression of NT was 0.33 times lower in castrated 3-day group than that in ADPC group.Resultsof RT-PCR and qRT-PCR showed that the expression levels of NT gene were 1.41 and 7.27 times respectively higher in AIPC group than that in ADPC group，but the expression levels of NT gene were 0.78 and 0.46 times respectively lower in castrated 3-day group than that in ADPC group(P＜0.05).HE resultsshowed that nuclear atypia and tumor structure in three groups.Immunohistochemistry and ELISA resultsshowed that the values of PSA and NT were(0.48±0.03)and(0.031±0.008)μg/L in ADPC group;(0.17± 0.03)and(0.021±0.004)μg/L in castrated 3-day group，and(0.87±0.02)and(0.042±0.010)μg/L in AIPC group.There weresignificantly lower expressions of NT and PSA in castrated 3-day group that those of ADPC group(P＜0.01).ConclusionIn the transition from ADPC to AIPC,the over-expression of NT suggested that NT may be associated with prostate cancer progression.NT may be used as a new therapeutic target and specific diagnostic method of AIPC.

prostatic neoplasms；mice,nude；disease models,animal；microchip analytical procedures；polymerase chain reaction；immunohistochemistry；neurotensin

R737.25，R349.6

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.09.008

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃973計劃（2012CB518304）；國家國際科技合作專項項目（2012DFG32220）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃（14JCYBJC29800）；天津市生物醫(yī)學材料重點實驗室開放課題（院所1309）

1天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院泌尿外科（郵編300211）；2天津市計劃生育研究所男性泌尿科；3中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學工程研究所天津生物醫(yī)學材料重點實驗室

△通訊作者 E-mail:niuyuanjie@gmail.com