γH2AX對肺癌放射敏感性的預(yù)測效果

韓寶林 王 軒李立芳王永志王廣舜

γH2AX對肺癌放射敏感性的預(yù)測效果

韓寶林1王 軒2李立芳1王永志1王廣舜3△

目的 探討人肺癌細(xì)胞受照后γH2AX表達量變化與肺癌細(xì)胞放射敏感性之間的關(guān)系。方法選擇肺腺癌A549和小細(xì)胞肺癌SBC-3細(xì)胞株，采用細(xì)胞克隆形成實驗檢測經(jīng)不同劑量（0、2、4、6、8、10 Gy）照射后A549 和SBC-3細(xì)胞的克隆形成率，并繪制細(xì)胞生存曲線；應(yīng)用Western blot檢測經(jīng)2 Gy放射劑量照射后不同時間點（0 min、30 min、1 h、2 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h）的細(xì)胞中γH2AX蛋白表達量。分析γH2AX蛋白表達量變化與腫瘤細(xì)胞放射敏感性的相關(guān)性。結(jié)果小細(xì)胞肺癌SBC-3細(xì)胞的放射敏感性明顯高于肺腺癌A549細(xì)胞。兩種細(xì)胞受照后1 h和6 h，γH2AX的表達量均與腫瘤細(xì)胞的平均致死劑量（D0）相關(guān)。結(jié)論γH2AX可以作為肺癌細(xì)胞放射敏感性的一個預(yù)測指標(biāo)。

輻射耐受性；γH2AX蛋白；肺癌；放射敏感性

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率居高不下，已成為我國城鎮(zhèn)居民惡性腫瘤的第一位死因[1]。放射治療是不能接受手術(shù)治療肺癌患者的主要治療手段，但療效較差，5年生存率僅5％～15％[2]。因為腫瘤的異質(zhì)性致使肺癌患者的腫瘤放射敏感性差異較大，而臨床上制定放療方案卻能考慮到這種個體化的差異，實現(xiàn)腫瘤個體化治療的關(guān)鍵是對腫瘤放射敏感性進行預(yù)測。研究發(fā)現(xiàn)磷酸化的H2AX（γH2AX）可作為檢測DNA雙鏈斷裂的一個強有力的新標(biāo)志物[3]。本研究通過檢測人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和SBC-3接受放療后的γH2AX表達水平，研究γH2AX表達與肺癌放射敏感性的關(guān)系，探討其作為預(yù)測肺癌放射敏感性指標(biāo)的可行性，以便指導(dǎo)肺癌臨床個體化放療。

1 材料與方法

1.1 材料 肺腺癌A549和小細(xì)胞肺癌SBC-3細(xì)胞株、PRMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、Dhanks、25 cm2培養(yǎng)瓶、75 cm2培養(yǎng)瓶、PBS、哺乳動物蛋白提取劑、蛋白酶抑制劑、細(xì)胞刮刀、離心機、5×上樣緩沖液、AP、TEMED、去離子水、1.5 mol/L Tris-HCl pH8.8、1 mol/L Tris-HCl pH6.8、10％ SDS、30％丙烯酰胺、預(yù)染蛋白marker、PVDF膜、一抗、二抗、ECL發(fā)光液、化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀、吉姆薩染液。

1.2 細(xì)胞克隆形成實驗 將肺腺癌A549和小細(xì)胞肺癌SBC-3細(xì)胞分別培養(yǎng)于25 cm2培養(yǎng)瓶中，取指數(shù)生長期A549和SBC-3細(xì)胞，消化、懸浮、計數(shù)后，分別接種于10 cm培養(yǎng)皿中，每種細(xì)胞株按照不同照射劑量分為0、2、4、6、8、10 Gy，每個劑量設(shè)3個平行處理孔，接種后培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，分別給予相應(yīng)劑量照射（Varian直線加速器，劑量率300 cGy/min）。照射時細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶或者培養(yǎng)皿中，給予單次X射線照射，培養(yǎng)2周后，棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗3遍并吸盡，多聚甲醛固定20 min，吉姆薩過夜染色后清水沖洗，熒光顯微鏡下觀察克隆集落形態(tài)，拍照，計數(shù)50個以上細(xì)胞的的克隆數(shù)。根據(jù)公式：克隆形成率（PE）=（對照組克隆數(shù)/細(xì)胞接種數(shù)）×100％。計算存活分?jǐn)?shù)（SF）=克隆數(shù)/（細(xì)胞數(shù)× PE）。采用單擊多靶數(shù)學(xué)模型[S=1-（1-eD/D0）n]擬合細(xì)胞生存曲線。

1.3 Western blot實驗 將肺腺癌A549和小細(xì)胞肺癌SBC-3細(xì)胞分別培養(yǎng)于25 cm2培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁并長滿整個培養(yǎng)瓶約75％體積時，給予2 Gy射線照射，照射后放回細(xì)胞培養(yǎng)箱，并在照射后不同時間點（0 min、30 min、1 h、2 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h）將相對應(yīng)的培養(yǎng)瓶從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出，棄去培養(yǎng)液，PBS洗3遍并吸盡，細(xì)胞裂解液與蛋白酶抑制劑的混合液提取細(xì)胞總蛋白。BCA方法測定蛋白濃度，然后蛋白變性、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉、兔抗人γH2AX作為一抗以及兔抗人β-actin為內(nèi)參封閉過夜。再加入羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育，最后進行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。實驗重復(fù)3次。采用Image J軟件分析Western blot條帶的灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SigmaPlot擬合放射生存曲線，采用SPSS15.0分析，多組比較采用F檢驗，2組比較采用t檢驗，線性相關(guān)分析γH2AX表達量與腫瘤細(xì)胞放射敏感性的相關(guān)性，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌A549細(xì)胞和小細(xì)胞肺癌SBC-3細(xì)胞的放射敏感性 SBC-3細(xì)胞的放射敏感性明顯高于A549細(xì)胞（F=1 023.221，P=0.033），見圖1。從擬合的細(xì)胞生存曲線得出放射敏感性參數(shù)SF和平均致死劑量（D0），SBC-3細(xì)胞的SF（0.376 vs 0.495）、D0(1.452 vs 2.490)均低于A549細(xì)胞。

Fig.1 The cell survival curves of two cell lines圖1 兩種肺癌細(xì)胞的生存曲線

2.2 兩種肺癌細(xì)胞接受2 Gy照射后γH2AX的表達變化 SBC-3細(xì)胞和A549細(xì)胞經(jīng)2 Gy射線照射后，γH2AX蛋白表達量在照射后1 h有明顯升高，在照射后6 h明顯降低，低于1 h（t分別為131.22和97.23，均P＜0.01），見圖2、3。

Fig.2 The expression of γH2AX in A549 with 2 Gy radiation dose detected by Western blot assay圖2 A549細(xì)胞株接受2 Gy照射后γH2AX蛋白隨時間變化情況

Fig.3 The expression of γH2AX in SCB-3 with 2 Gy radiation dose detected by Western blot assay圖3 SBC-3細(xì)胞株接受2 Gy照射后γH2AX蛋白隨時間變化情況

2.3 γH2AX的表達量變化與腫瘤放射敏感性的相關(guān)性 兩種細(xì)胞受照后1 h和6 h，γH2AX的表達量均與腫瘤細(xì)胞的放射敏感性參數(shù)D0相關(guān)，見表1。

Tab.1 The relation between radiosensitivity parameter D0and γH2AX expression in two lung cancer cell lines表1 γH2AX的表達量與肺癌細(xì)胞D0的相關(guān)性（r）

3 討論

克隆形成實驗可用來研究腫瘤細(xì)胞的增殖能力及細(xì)胞對不同殺傷因素的敏感性[4]。在評價照射導(dǎo)致細(xì)胞死亡方面，克隆形成實驗常被作為“金標(biāo)準(zhǔn)”[5]。本實驗的克隆形成實驗結(jié)果表明，肺癌細(xì)胞系（A549和SBC-3）接受X線照射后，其細(xì)胞存活率均下降，且隨著放射劑量增加，細(xì)胞存活率逐漸下降；放射敏感性指標(biāo)顯示，SBC-3細(xì)胞對放射線較敏感，表現(xiàn)為該組細(xì)胞生存曲線較陡，SF呈最低值0.376，代表平均致死量的D0值較低為1.452 Gy；相反，A549細(xì)胞對放射線不敏感，表現(xiàn)為該組細(xì)胞生存曲線較平緩，SF呈較高值0.495，代表平均致死量的D0值較低為2.490 Gy。

H2AX是組蛋白H2A家族成員之一。在H2AX的C端有一段由22個殘基組成的高度保守的同源序列，其中包括1個139位的絲氨酸殘基的絲氨酸-谷氨酰胺-谷氨酸（Ser-Gln-Glu,SQE）結(jié)構(gòu)域[6]。細(xì)胞在受到照射后，H2AX的SQE結(jié)構(gòu)域中的絲氨酸殘基迅速磷酸化并在DSBs位點簇集形成焦點。低劑量照射時，磷酸化H2AX所形成的焦點數(shù)量與照射造成的DNA雙鏈斷裂數(shù)量存在線性相關(guān)關(guān)系[7]，因此，γH2AX功能之一就是可以作為電離輻射后細(xì)胞發(fā)生DNA雙鏈斷裂損傷的指示器。DNA損傷時γH2AX能夠快速募集一系列DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白和信號因子，如BRCA1、Nbs1、53BP1、MRN復(fù)合物，從而間接修復(fù)DNA損傷[8]。Celeste等[8]研究發(fā)現(xiàn)在H2AX缺陷的細(xì)胞發(fā)生DNA雙鏈斷裂損傷時，其損傷修復(fù)相關(guān)蛋白也能向損傷位點處聚集，但是移動速度減慢并且不能持續(xù)聚集在損傷位點。一旦γH2AX介導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)完成后，γH2AX會被蛋白磷酸化酶3等脫磷酸化[9]，形成H2AX，在其他DNA損傷修復(fù)中被重新利用，從而使γH2AX在損傷位點被有效地去除。即在電離輻射后，γH2AX存在一個形成與消失的過程，并且此過程體現(xiàn)著DNA損傷及其修復(fù)過程。本實驗Western blot實驗結(jié)果表明，各實驗組γH2AX水平在照射后一段時間隨著時間增加而增加，在1～2 h達到峰值，在隨后的時間內(nèi)，各組γH2AX水平隨著時間的推移逐漸降低。γH2AX在受照后1 h、6 h的表達率與兩種肺癌細(xì)胞的放射敏感性存在明顯的相關(guān)性，且6 h的相關(guān)性更好。說明在接受照射后，A549細(xì)胞株的DNA損傷發(fā)生率明顯低于SBC-3細(xì)胞株。而在受照后6 h，受損的DNA的修復(fù)率卻明顯高于SBC-3細(xì)胞株，這致使A549細(xì)胞株在受照后因照射所致的細(xì)胞死亡明顯少于SBC-3細(xì)胞株，因此，SBC-3細(xì)胞株的放射敏感性明顯高于A549細(xì)胞株。這些結(jié)果與生存曲線反應(yīng)的結(jié)果相一致。所以，細(xì)胞在受照后不同時間點的γH2AX表達量的變化可以替代生存曲線來反映細(xì)胞的放射敏感性。近年來，已經(jīng)有研究報道γH2AX可以作為腫瘤細(xì)胞DNA損傷的一個靈敏和特異的生物指標(biāo)，可用于判斷腫瘤對于放療是敏感還是抵抗[9]。

[1]Siegel R,Ma J,Zou Z,et al.Cancer Statistics,2014[J].CA Cancer J Clin,2014,64(1):9-29.doi:10.3322/caac.21208.

[2]Castillo R,Pham N,Ansari S,et al.pre-radiotherapy fdg pet predicts radiation pneumonitis in lung cancer[J].Radiat Oncol,2014,9 (1):74.doi:10.1186/1748-717X-9-74.

[3]徐冶,李質(zhì)馨,曹慧玲,等.衣霉素對順鉑誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2013,38(4):283-287.

[4]朱麗紅,申文江,李平,等.X射線對血管平滑肌細(xì)胞作用機制的實驗研究[J].中華放射腫瘤學(xué)雜志,2001,10(2):126-130.

[5]Matthaios D,Hountis P,Karakitsos P,et al.H2AX a promising biomarker for lung cancer:a review[J].Cancer Invest,2013,31(9):582-599.doi:10.3109/07357907.2013.849721.

[6]Zhao J,Guo Z,Zhang H,et al.The potential value of the neutral comet assay and γH2AX foci assay in assessing the radiosensitivity of carbon beam in human tumor cell lines[J].Radiol Oncol,2013,47 (3):247-257.doi:10.2478/raon-2013-0045.eCollection 2013.

[7]Moroni M,Maeda D,Whitnall MH,et al.Evaluation of the gamma-H2AX assay for radiation biodosimetry in a swine model[J].Int J Mol Sci,2013,14(7):14119-14135.doi:10.3390/ijms140714119.

[8]Celeste A,Fernandez-Capetillo O,Kruhlak MJ,et al.Histone H2AX phosphorylation is dispensable for the initial recognition of DNA breaks[J].Nat Cell Biol,2003,5(7):675-679.

[9]Redon CE,Weyemi U,Parekh PR,et al.γ-H2AX and other histone post-translational modifications in the clinic[J].Biochim Biophys Acta,2012,19(7):743-756.doi:10.1016/j.bbagrm.2012.02.021.

（2014-01-20收稿 2014-04-10修回）

（本文編輯 閆娟）

Assessing Radiosensitivity of Lung Cancer with the Expression of γH2AX

HAN Baolin1,WANG Xuan2,LI Lifang1,WANG Yongzhi1,WANG Guangshun3△
1 Department of Radiation Oncology,Clinical Hospital of Baodi of Tianjin Medical University,Tianjin 301800,China；2 Department of Intensive Care Unit,3 Department of Oncology△

E-mail:wgs@bdhospital.com

ObjectiveTo observe the relationship between expression changes of γH2AX and the radiosensitivity of lung cancer cells in vitro.MethodsThe radiosensitivity of lung cancer cell lines A549 and SBC-3 was measured by clone forming assay.The DSBs damage of lung cancer cell lines A549 and SBC-3 was determined by Western blot assay.ResultsThe clone forming rates of lung cancer cell lines A549 and SBC-3 were gradually decreased with the increased radiation dose.γH2AX expression was related to the cell radiosensitivity 1 hour and 6 hours after radiated.ConclusionThe phosphorylated histone γH2AX is a powerful tool to monitor DNA DSBs and to predict the radiosensitivity in lung cancer radiotherapy.

radiation tolerance；γH2AX protein；lung cancer；radiosensitivity

R734.2；R815.2

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.09.005

天津市衛(wèi)生局科技基金資助項目（2012KZ003）

1天津醫(yī)科大學(xué)寶坻臨床學(xué)院放療科（郵編301800），2 ICU，3腫瘤科

△通訊作者 E-mail:wgs@bdhospital.com