胱硫醚β-合酶/胱硫醚γ-裂解酶-硫化氫體系小干擾RNA對大鼠正常肝細(xì)胞株BRL凋亡的影響

閆 駿 李彥敏 郭雪西 章明放

胱硫醚β-合酶/胱硫醚γ-裂解酶-硫化氫體系小干擾RNA對大鼠正常肝細(xì)胞株BRL凋亡的影響

閆 駿 李彥敏 郭雪西 章明放△

目的 探討內(nèi)源性胱硫醚β-合酶（CBS）/胱硫醚γ-裂解酶（CSE）-硫化氫（H2S）體系在生理狀態(tài)肝細(xì)胞凋亡中的作用及其機(jī)制。方法培養(yǎng)大鼠正常肝細(xì)胞株BRL。小干擾RNA（siRNA）序列篩選：設(shè)陰性siRNA序列轉(zhuǎn)染組（對照組）、CBS siRNA序列轉(zhuǎn)染組（CBS 1～3序列組）和CSE siRNA序列轉(zhuǎn)染組（CSE 1～3序列組），轉(zhuǎn)染24、48 h；siRNA轉(zhuǎn)染后檢測細(xì)胞凋亡：設(shè)陰性對照組、溶劑對照組、CBS siRNA組、CSE siRNA組、（CBS+CSE）siRNA組，作用時(shí)間為轉(zhuǎn)染后0、4、8、12、24 h；凋亡機(jī)制探討：設(shè)陰性對照組、CBS siRNA組、CSE siRNA組、（CBS+CSE）siRNA組，作用時(shí)間為轉(zhuǎn)染后4、8、12、24 h；每組均4個(gè)平行樣。RT-PCR、Western blot檢測BRL細(xì)胞中CBS、CSE mRNA和蛋白的表達(dá)，siRNA基因靜默CBS、CSE，去蛋白法檢測H2S生成，Hoechst熒光染色、流式細(xì)胞術(shù)檢測BRL細(xì)胞凋亡，熒光染色檢測線粒體膜電位（MMP）變化，Western blot檢測胞漿內(nèi)細(xì)胞色素C（Cyt C）和激活型caspase 3 （cleaved-caspase 3）蛋白表達(dá)變化。結(jié)果BRL細(xì)胞株存在CBS、CSE表達(dá)。CBS/CSE siRNA轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞內(nèi)源性H2S生成降低，凋亡細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞凋亡率隨時(shí)間延長而逐漸增加，BRL細(xì)胞上清乳酸脫氫酶（LDH）活性均未見明顯變化，MMP下降，胞漿內(nèi)Cyt C蛋白表達(dá)上調(diào)，cleaved-caspase3蛋白表達(dá)上調(diào)。結(jié)論抑制內(nèi)源性H2S體系可引起生理狀態(tài)肝細(xì)胞凋亡，機(jī)制可能部分涉及凋亡線粒體途徑。

胱硫醚β合酶；胱硫醚γ裂合酶；硫化氫；RNA,小分子干擾；細(xì)胞凋亡；BRL細(xì)胞

一氧化氮（NO）、一氧化碳（CO）相繼成為氣體信號分子的研究熱點(diǎn)之后，硫化氫（H2S）作為新發(fā)現(xiàn)的第三種氣體信使分子，其生物學(xué)效應(yīng)逐漸得到人們的重視[1]。研究表明內(nèi)源性H2S主要是在胱硫醚β-合成酶(cystathionine β-synthase，CBS)、胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase，CSE)以及半胱氨酸轉(zhuǎn)移酶等的催化作用下產(chǎn)生，少數(shù)由含硫氨基酸代謝生成[2]。CBS和CSE是H2S生成的主要限速酶，其分布存在組織差異性[3]。肝臟是機(jī)體同時(shí)分布有CBS、CSE的少數(shù)器官之一，也是機(jī)體H2S的主要代謝器官[4]。肝臟是體內(nèi)發(fā)揮生物轉(zhuǎn)化、新陳代謝的主要器官，H2S在參與肝細(xì)胞調(diào)節(jié)膽汁分泌、拮抗肝缺血/再灌注損傷等病理生理過程中發(fā)揮了重要作用[5-6]。然而H2S介導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，尤其是生理狀態(tài)下的凋亡機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)選取培養(yǎng)大鼠正常肝細(xì)胞株BRL，模擬肝細(xì)胞體內(nèi)生理狀態(tài)，觀察肝細(xì)胞中CBS-H2S、CSE-H2S體系分布情況，檢測內(nèi)源性H2S生成，并利用小干擾 RNA（small interfering RNA,siRNA）技術(shù)基因沉默CBS-H2S、CSE-H2S體系，旨在探討CBS-H2S與CSE-H2S體系在生理狀態(tài)下肝細(xì)胞凋亡中的作用及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 大鼠正常肝細(xì)胞株BRL購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液及胎牛血清、Lipo 2000TMRNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑盒、CBS/CSE逆轉(zhuǎn)錄PCR引物合成及反應(yīng)體系試劑盒均購自Invitrogen公司。siRNA序列由Invitrogen公司設(shè)計(jì)并合成。兔抗大鼠CBS、CSE一抗、兔抗大鼠細(xì)胞色素C（cytochrome C,Cyt C）一抗、兔抗大鼠激活型caspase 3（cleaved-caspase 3）一抗、兔抗大鼠β-tubulin一抗（內(nèi)參）及辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗均購自Santa Cruz公司。ProteoJETTM胞漿蛋白抽提試劑盒購自Fermentas公司。線粒體膜電位（MMP）檢測試劑盒、細(xì)胞凋亡-Hoechst染色試劑盒與AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒均購自Calbiochem公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理 BRL細(xì)胞接種于含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于含5％CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（1）siRNA序列的篩選。操作方法參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性siRNA序列轉(zhuǎn)染組（對照組）、CBS siRNA序列轉(zhuǎn)染組（CBS 1～3序列組）和CSE siRNA序列轉(zhuǎn)染組（CSE-siRNA 1～3序列組），分別轉(zhuǎn)染24、48 h，見表1。（2）檢測CBS/ CSE siRNA轉(zhuǎn)染后對生理狀態(tài)BRL細(xì)胞凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對照組、溶劑對照組、CBS siRNA組、CSE siRNA組和(CBS+CSE)siRNA組。根據(jù)Lipo 2000TMRNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染成功后，繼續(xù)實(shí)驗(yàn)時(shí)間分別為0、4、8、12、24 h。（3）探討CBS/CSE siRNA轉(zhuǎn)染BRL細(xì)胞可能涉及的凋亡機(jī)制。實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對照組、CBS siRNA組、CSE siRNA組和(CBS+CSE)siRNA組，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為4、8、12、24 h。各組均設(shè)4個(gè)平行樣。

Tab.1 The siRNA sequences of CBS,CSE and negative control groups表1 CBS、CSE、陰性對照siRNA序列

1.2.2 RT-PCR檢測 BRL細(xì)胞中CBS/CSE mRNA的表達(dá) Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，引物序列見表2。擴(kuò)增后以瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，以擴(kuò)增條帶的有無作為BRL細(xì)胞中是否存在CBS/CSE基因表達(dá)的依據(jù)。

Tab.2 The RT-PCR primer sequences of CBS, CSE and GAPDH表2 CBS、CSE、GAPDH的RT-PCR引物序列

1.2.3 Western Blot檢測目的蛋白的表達(dá)水平 BRL細(xì)胞胞漿蛋白的提取按照試劑盒說明書進(jìn)行。蛋白濃度定量后，行SDS-PAGE。待測條帶電泳至分離膠目標(biāo)區(qū)域時(shí)，電轉(zhuǎn)至PVDF膜。抗體稀釋度：一抗為 1∶400～1∶600，二抗為1∶2 000～1∶2 500。以電化學(xué)凝膠成像系統(tǒng)顯影，并記錄目標(biāo)蛋白條帶光密度值，以β-tubulin為內(nèi)參，反映目標(biāo)蛋白CBS/ CSE、Cyt C、cleaved-caspase 3相對表達(dá)量。

1.2.4 內(nèi)源性H2S生成的檢測 根據(jù)去蛋白的方法[8-9]檢測H2S生成變化。首先配制不同濃度的NaHS，建立H2S濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出直線回歸方程：=0.003 185+0.000 061 89X，r= 0.998。0.1 mL待測標(biāo)本加入至10％醋酸鋅0.5 mL混勻，充分沉淀后，以30 mmol/L三氯化鐵0.5 mL、20 mmol/L對苯二胺鹽酸鹽0.5 mL充分混勻、顯色，以10％三氯醋酸1 mL沉淀蛋白，最后以蒸餾水補(bǔ)齊液體總體積至5 mL，6 000 r/min離心5 min，調(diào)定酶標(biāo)儀波長670 nm，檢測吸光度值并代入方程式，以得出待測液上清中H2S的含量。

1.2.5 細(xì)胞上清乳酸脫氫酶（LDH）釋放檢測 以850×g離心3 min收集待測細(xì)胞上清，檢測樣本200 μL；調(diào)定全自動生化儀吸光度波長450 nm，檢測LDH活性。

1.2.6 MMP的檢測 按照MMP檢測試劑盒說明操作，預(yù)制BRL細(xì)胞爬片；滿足實(shí)驗(yàn)條件時(shí)，細(xì)胞爬片以MitoCaptureTM和Buffer 1混合液孵育15 min；隨后以Buffer 2清洗2次；封片處理后，在熒光顯微鏡下觀察并記錄紅色熒光和綠色熒光的強(qiáng)度比值。

1.2.7 Hoechst染色法形態(tài)學(xué)檢測細(xì)胞凋亡 預(yù)制BRL細(xì)胞爬片；細(xì)胞生長滿足實(shí)驗(yàn)要求后，加入0.5 mL 75％乙醇，固定30 min；吸棄固定液，用PBS洗2遍，每次3 min；加入0.5 mL Hoechst 33258染色液，染色5 min；用PBS洗2遍，每次3 min；滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，封片觀察；熒光顯微鏡可檢測到呈藍(lán)色（RGB值：0、0、255）的細(xì)胞核，激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長460 nm。

1.2.8 細(xì)胞凋亡流式檢測 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞以0.25％胰酶消化、收集；洗滌細(xì)胞2次；加入500 μL的AnnexinⅤBinding Buffer懸浮細(xì)胞；加入5 μL AnnexinⅤ-FITC混勻后，加入5 μL Propidium Iodide，混勻避光、室溫反應(yīng)5 min；上機(jī)，流式細(xì)胞儀檢測（Ex=488 nm；Em=530 nm）細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 大鼠正常肝細(xì)胞株BRL細(xì)胞中CBS和CSE基因與蛋白表達(dá) 擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳分別在572 bp和400 bp左右觀察到與目標(biāo)片段長度相符的熒光條帶；CBS、CSE蛋白分子質(zhì)量分別為63、45 ku，見圖1。

2.2 CBS/CSE siRNA對BRL細(xì)胞內(nèi)源性H2S生成的影響

2.2.1 siRNA序列篩選 轉(zhuǎn)染24 h時(shí)，CBS 3序列組CBS蛋白和CSE蛋白表達(dá)均低于對照組（P＜0.05）；CBS siRNA抑制率最高為45.3％，CSE siRNA抑制率最高為52.3％。轉(zhuǎn)染48 h時(shí)，各組間CBS、CSE蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。

2.2.2 siRNA轉(zhuǎn)染對BRL細(xì)胞H2S生成的影響 轉(zhuǎn)染0、4 h時(shí)各組H2S差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；轉(zhuǎn)染8 h 時(shí)CSE siRNA組和(CBS+CSE)siRNA組的H2S低于陰性對照組，CBS siRNA組與陰性對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；轉(zhuǎn)染12、24 h時(shí)CBS siRNA組、CSE siRNA組和(CBS+CSE)siRNA組的H2S均低于陰性對照組（均P＜0.05）,見表3。

Fig.1 The basic expression of CBS/CSE gene and protein in physiological BRL cells圖1 生理狀態(tài)下BRL細(xì)胞CBS、CSE基因和蛋白的基礎(chǔ)表達(dá)

Fig.2 The screening experiment of CBS/CSE siRNA sequences圖2 CBS/CSE siRNA序列篩選實(shí)驗(yàn)

Tab.3 Changes of endogenous H2S generation in BRL cells treated with siRNA表3 CBS/CSE siRNA轉(zhuǎn)染BRL細(xì)胞內(nèi)源性H2S生成變化 （n=4，μmol/L，±s）

Tab.3 Changes of endogenous H2S generation in BRL cells treated with siRNA表3 CBS/CSE siRNA轉(zhuǎn)染BRL細(xì)胞內(nèi)源性H2S生成變化 （n=4，μmol/L，±s）

＊P＜0.05；a與陰性對照組比較，P＜0.05

組別陰性對照組溶劑對照組CBS siRNA組CSE siRNA組(CBS+CSE)siRNA組F 0 h 26.19±3.41 26.19±3.27 26.19±4.93 26.21±3.27 26.68±4.47 0.040 4 h 27.25±3.52 27.23±3.33 26.01±4.11 24.84±3.47 23.33±3.24 1.871組別陰性對照組溶劑對照組CBS siRNA組CSE siRNA組(CBS+CSE)siRNA組F 8 h 26.71±2.43 26.69±2.10 22.83±3.36 17.73±3.54a14.93±2.99a13.100＊12 h 26.82±2.63 26.55±3.37 19.66±4.37a14.33±3.42a9.23±2.45a18.673＊24 h 26.79±4.57 26.62±1.87 13.13±3.01a8.52±2.87a5.63±2.83a30.252＊

2.3 siRNA轉(zhuǎn)染對BRL細(xì)胞凋亡的影響

2.3.1 siRNA轉(zhuǎn)染對BRL細(xì)胞上清LDH活性的影響 CBS/CSE siRNA單獨(dú)或聯(lián)合轉(zhuǎn)染BRL細(xì)胞后不同時(shí)點(diǎn)，BRL細(xì)胞上清LDH活性均未見明顯變化（均P＞0.05）,見表4。

Tab.4 Changes of LDH content in culture supernatant of BRL cells treated with siRNA表4 CBS/CSE siRNA轉(zhuǎn)染BRL細(xì)胞上清LDH活性變化 （n=4，U/L，±s）

Tab.4 Changes of LDH content in culture supernatant of BRL cells treated with siRNA表4 CBS/CSE siRNA轉(zhuǎn)染BRL細(xì)胞上清LDH活性變化 （n=4，U/L，±s）

均P＞0.05

組別陰性對照組溶劑對照組CBS siRNA組CSE siRNA組(CBS+CSE)siRNA組F 0 h 42.91±3.22 42.19±2.23 43.01±2.97 43.21±2.44 43.51±3.47 0.167 4 h 41.95±2.42 41.69±2.57 44.01±3.47 43.83±3.91 42.82±3.77 0.492組別陰性對照組溶劑對照組CBS siRNA組CSE siRNA組(CBS+CSE)siRNA組F 8 h 42.71±3.07 42.23±3.33 44.81±2.06 44.73±4.63 44.74±4.23 0.455 12 h 45.18±3.71 43.55±3.37 45.46±3.37 45.33±2.22 46.23±2.45 1.234 24 h 46.87±2.51 46.32±1.57 46.91±3.31 47.25±2.37 50.63±2.81 2.123

2.3.2 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化 CBS/CSE siRNA單獨(dú)或聯(lián)合轉(zhuǎn)染BRL細(xì)胞后4 h即出現(xiàn)凋亡細(xì)胞，且隨時(shí)間延長而出現(xiàn)凋亡細(xì)胞數(shù)量增多趨勢。陰性對照和溶劑對照組均未見凋亡細(xì)胞，見圖3。

2.3.3 細(xì)胞凋亡流式檢測結(jié)果 除轉(zhuǎn)染0 h時(shí)，各組BRL細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余時(shí)點(diǎn)CBS siRNA組、CSE siRNA組和(CBS+CSE)siRNA組BRL細(xì)胞凋亡率均高于陰性對照組（均P＜0.05）,見表5。

Tab.5 Apoptosis variation of BRL cells treated with CBS/CSE siRNA表 5CBS/CSE siRNA轉(zhuǎn)染后BRL細(xì)胞凋亡率變化（n=4，％，±s）

Tab.5 Apoptosis variation of BRL cells treated with CBS/CSE siRNA表 5CBS/CSE siRNA轉(zhuǎn)染后BRL細(xì)胞凋亡率變化（n=4，％，±s）

＊P＜0.05；a與陰性對照組比較，P＜0.05

組別陰性對照組溶劑對照組CBS siRNA組CSE siRNA組(CBS+CSE)siRNA組F 0 h 0.2±0.2 0.2±0.1 0.5±0.2 0.5±0.2 0.5±0.1 2.893 4 h 0.3±0.1 0.2±0.2 12.8±0.2a16.9±0.2a20.8±0.2a1 234.159＊組別陰性對照組溶劑對照組CBS siRNA組CSE siRNA組(CBS+CSE)siRNA組F 8 h 0.3±0.1 0.3±0.2 24.6±0.2a27.4±0.1a30.2±0.2a3 057.859＊12 h 0.4±0.1 0.3±0.2 27.2±0.2a31.6±0.2a35.5±0.1a3 197.946＊24 h 0.4±0.2 0.4±0.1 31.9±0.2a35.6±0.1a41.3±0.2a4 255.039＊

2.4 CBS/CSE siRNA轉(zhuǎn)染BRL細(xì)胞MMP、Cyt C及cleaved-caspase 3蛋白表達(dá)的變化

2.4.1 MMP CBS siRNA組轉(zhuǎn)染12、24 h時(shí)MMP低于陰性對照組，4、8 h時(shí)與陰性對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CSE siRNA組除除轉(zhuǎn)染4 h時(shí)MMP與陰性對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，轉(zhuǎn)染8、12、24 h時(shí)均低于陰性對照組；(CBS+CSE)siRNA組轉(zhuǎn)染后各時(shí)點(diǎn)MMP均低于陰性對照組（均P＜0.05）,見圖4、表6。

2.4.2 Cyt C蛋白 轉(zhuǎn)染4 h時(shí)各組Cyt C蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；轉(zhuǎn)染8 h時(shí)CSE siRNA組和(CBS+CSE)siRNA組高于陰性對照組，CBS siRNA組與陰性對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；轉(zhuǎn)染12、24 h時(shí)CBS siRNA組、CSE siRNA組和(CBS+CSE)siRNA組均高于陰性對照組（均P＜0.05），見圖5、表7。

2.4.3 cleaved-caspase 3蛋白 CBS siRNA組、CSE siRNA組和（CBS+CSE）siRNA組cleaved-caspase 3蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)染24 h時(shí)高于陰性對照組（P＜0.05），其余時(shí)點(diǎn)與陰性對照組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表6、表8。

Tab.6 Comparison of MMP levels between BRL cells treated with CBS/CSE siRNA表6 CBS/CSE siRNA轉(zhuǎn)染BRL細(xì)胞后胞漿內(nèi)MMP水平比較 （n=4，±s）

Tab.6 Comparison of MMP levels between BRL cells treated with CBS/CSE siRNA表6 CBS/CSE siRNA轉(zhuǎn)染BRL細(xì)胞后胞漿內(nèi)MMP水平比較 （n=4，±s）

＊P＜0.05；a與陰性對照組比較，P＜0.05

組別陰性對照組CBS siRNA組CSE siRNA組(CBS+CSE)siRNA組F 4 h 0.43±0.01 0.42±0.01 0.42±0.01 0.39±0.01a12.171＊8 h 0.43±0.01 0.42±0.01 0.39±0.01a0.38±0.01a23.178＊12 h 0.43±0.01 0.39±0.01a0.38±0.01a0.35±0.01a65.483＊24 h 0.43±0.01 0.38±0.01a0.36±0.01a0.32±0.01a113.162＊

Fig.5 The Cyt C expression level in BRL cells treated with CBS/CSE siRNA圖5 CBS/CSE siRNA轉(zhuǎn)染BRL細(xì)胞后胞漿內(nèi)Cyt C蛋白表達(dá)變化

Tab.7 Cyt C protein expression level in BRL cells treated with CBS/CSE siRNA表7 CBS/CSE siRNA轉(zhuǎn)染BRL細(xì)胞后胞漿內(nèi)Cyt C蛋白表達(dá)水平比較 （n=4，±s）

Tab.7 Cyt C protein expression level in BRL cells treated with CBS/CSE siRNA表7 CBS/CSE siRNA轉(zhuǎn)染BRL細(xì)胞后胞漿內(nèi)Cyt C蛋白表達(dá)水平比較 （n=4，±s）

＊P＜0.05；a與陰性對照組比較，P＜0.05

組別陰性對照組CBS siRNA組CSE siRNA組(CBS+CSE)siRNA組F 4 h 0.17±0.01 0.18±0.02 0.20±0.02 0.21±0.02 7.493 8 h 0.17±0.02 0.22±0.01 0.24±0.02a0.26±0.02a18.112＊12 h 0.17±0.02 0.24±0.01a0.25±0.02a0.43±0.02a42.367＊24 h 0.17±0.03 0.27±0.02a0.28±0.02a0.52±0.03a51.221＊

Fig.6 The cleaved-capase 3 expression in BRL cells treated with CBS/CSE siRNA圖6 CBS/CSE siRNA轉(zhuǎn)染BRL細(xì)胞后cleaved-capase 3蛋白表達(dá)變化

Tab.8 The cleaved-caspase 3 protein expression level in BRL cells treated with CBS/CSE siRNA表8 CBS/CSE siRNA轉(zhuǎn)染BRL細(xì)胞后胞漿內(nèi)cleavedcaspase 3蛋白表達(dá)水平比較 （n=4，±s）

Tab.8 The cleaved-caspase 3 protein expression level in BRL cells treated with CBS/CSE siRNA表8 CBS/CSE siRNA轉(zhuǎn)染BRL細(xì)胞后胞漿內(nèi)cleavedcaspase 3蛋白表達(dá)水平比較 （n=4，±s）

＊P＜0.05；a與陰性對照組比較，P＜0.05

組別陰性對照組CBS siRNA組CSE siRNA組(CBS+CSE)siRNA組F 4 h 0.02±0.02 0.02±0.02 0.03±0.01 0.03±0.02 0.653 8 h 0.02±0.01 0.03±0.01 0.04±0.02 0.05±0.03 1.690 12 h 0.02±0.02 0.04±0.01 0.05±0.02 0.05±0.02 1.826 24 h 0.03±0.02 0.17±0.02a0.18±0.02a0.22±0.03a74.909＊

3 討論

近年來H2S在細(xì)胞凋亡過程中的作用及機(jī)制成為研究熱點(diǎn)之一，有研究顯示外源性H2S在抑制平滑肌細(xì)胞增殖的同時(shí)，可進(jìn)一步促進(jìn)自發(fā)性高血壓大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞凋亡[10]。應(yīng)用NaHS能顯著減弱由肝臟缺血/再灌注引起的肝損傷的嚴(yán)重性，并抑制脂質(zhì)過氧化作用以及血清中炎癥因子的產(chǎn)生，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡和凋亡相關(guān)蛋白的產(chǎn)生[11]。然而內(nèi)源性H2S參與生理狀態(tài)下肝細(xì)胞凋亡的相關(guān)研究，尤其是內(nèi)源性H2S在介導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的過程中發(fā)揮促進(jìn)還是抑制的作用尚不明確。

以往研究中，涉及肝臟或肝細(xì)胞內(nèi)源性H2S研究時(shí)，多以CSE代表肝內(nèi)H2S的主要合成酶[12-13]，本課題組觀察到BRL細(xì)胞中同時(shí)存在CBS、CSE的基礎(chǔ)表達(dá)。尤其是CBS-H2S體系，已有報(bào)道其存在于肝臟整體器官中[14]，本研究進(jìn)一步明確了其分布于肝細(xì)胞中，并篩選出CBS/CSE siRNA最佳序列轉(zhuǎn)染BRL細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合轉(zhuǎn)染兩種siRNA，可減少BRL細(xì)胞內(nèi)源性H2S生成，與單獨(dú)轉(zhuǎn)染CBS或CSE siRNA相比，聯(lián)合轉(zhuǎn)染CBS siRNA和CSE siRNA后12 h，內(nèi)源性H2S生成分別減少了50％和35.59％，提示CBS和CSE在內(nèi)源性H2S酶促反應(yīng)生成中均發(fā)揮作用，但作用大小有所區(qū)別。在研究肝臟或肝細(xì)胞內(nèi)源性H2S時(shí)，僅研究一個(gè)來源的H2S不足以充分反映肝臟或肝細(xì)胞內(nèi)源性H2S酶促生成情況。

CBS/CSE siRNA單獨(dú)或聯(lián)合轉(zhuǎn)染BRL細(xì)胞后，細(xì)胞上清中LDH活性未見明顯變化。LDH一般穩(wěn)定存在于正常細(xì)胞胞漿中，在細(xì)胞膜完整性遭到破壞時(shí)才會大量逸出至細(xì)胞外，本研究結(jié)果提示siRNA轉(zhuǎn)染體系試劑處理細(xì)胞后，未影響細(xì)胞膜相的完整性。本研究結(jié)果顯示，CBS siRNA、CSE siRNA分別單獨(dú)處理BRL細(xì)胞后4～24 h，細(xì)胞凋亡率隨時(shí)間變化而明顯增加，且均明顯高于陰性對照組，提示抑制CBS源性、CSE源性H2S生成均可導(dǎo)致BRL細(xì)胞凋亡；其中，與CBS siRNA單獨(dú)處理組相比，聯(lián)合轉(zhuǎn)染CBS與CSE siRNA處理BRL細(xì)胞12 h后，內(nèi)源性H2S生成減少了50％，而細(xì)胞凋亡率增加了30.83％，與CSE siRNA單獨(dú)處理組相比，聯(lián)合轉(zhuǎn)染12 h后內(nèi)源性H2S生成減少了35.59％，細(xì)胞凋亡率增加了11.97％，提示兩種來源的H2S發(fā)揮的作用大小不同，且CBS源性H2S略少于CSE源性H2S生成，二者之間可能存在一定的代償機(jī)制。在探討肝細(xì)胞凋亡途徑的過程中，單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用CBS/CSE siRNA作用BRL細(xì)胞后，細(xì)胞MMP下降，胞漿內(nèi)Cyt C蛋白表達(dá)上調(diào)，cleaved-caspase3蛋白表達(dá)上調(diào)，這一過程符合凋亡線粒體通路中MMP下降，開啟線粒體膜孔，進(jìn)而使線粒體膜內(nèi)Cyt C逸出至胞漿內(nèi)，通過一系列轉(zhuǎn)導(dǎo)，活化caspase 3系統(tǒng)的過程節(jié)點(diǎn)[15]，提示內(nèi)源性H2S參與凋亡的通路可能部分涉及了凋亡的線粒體途徑，并最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。

肝細(xì)胞中內(nèi)源性H2S信號分子的研究需全面考慮多個(gè)酶促反應(yīng)體系及相互間可能的代償機(jī)制，為今后H2S相關(guān)基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用的發(fā)展提供借鑒，但有關(guān)內(nèi)源性H2S氣體信號分子發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的特異性機(jī)制和交互作用尚待進(jìn)一步探討。

Fig.3 The morphological changes of BRL cells treated with siRNA（Hoechst,×400）圖3 CBS/CSE siRNA轉(zhuǎn)染后BRL細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化（Hoechst染色，×400）

Fig.4 MMP variation of BRL cells treated with CBS/CSE siRNA(fluorescence,×400)圖4 CBS/CSE siRNA轉(zhuǎn)染BRL細(xì)胞后MMP變化（熒光顯微鏡，×400）

Fig.4 MMP variation of BRL cells treated with CBS/CSE siRNA(fluorescence,×400)圖4 CBS/CSE siRNA轉(zhuǎn)染BRL細(xì)胞后MMP變化（熒光顯微鏡，×400）

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（2014-07-07收稿 2014-07-17修回）

（本文編輯 陳麗潔）

Small Interfering RNA of Cystathionine β-Synthase/Cystathionine γ-Lyase-Derived Hydrogen Sulfide Synthesis Induces Apoptosis of Rat Hepatic BRL Cell Line

YAN Jun,LI Yanmin,GUO Xuexi,ZHANG Mingfang△
Department of Patholog of Tianjin First Center Hospital,Tianjin 300100,China△

E-mail:yanhuang2@163.com

ObjectiveTo explore the inhibitory effects of endogenous hydrogen sulfide,a novel and important gaseous transmitter generated in mammalian tissues mainly by cystathionine β-synthase(CBS)or cystathionine γ-lyase(CSE) on the apoptosis of the rat hepatic BRL cell line in physiological condition.MethodsBRL cells were cultured,and divided randomly into several groups in different phases of the experiment,including negative-siRNA(control)group,CBS siRNA (CBS 1～3)group and CSE siRNA(CSE 1～3)group,which were used to select the most efficient sequences of siRNAs at 48 or 24-hour transfection.Solution group and(CBS+CSE)siRNA group were added to detect the variation of apoptosis.The BRL cell line was observed and evaluated at 0,4,8,12,and 24 hrs after siRNA transfection.When the mechanisms of the apoptosis were detected,CBS/CSE siRNAs were transfected individually or jointly into BRL cells,and compared with negative-siRNA group to examine the variation.The genic and protein expression of CBS/CSE were detected by RT-PCR and Western blot assay.After transfection of CBS/CSE siRNA,the apoptosis of BRL cells was detected by Hoechst stain and flow cytometry(FCM).The mitochondrial membrane potential(MMP)changes were observed by fluorescent staining.Western blot assay was used to examine the protein expression of intracytoplasm cytochrome C(Cyt C)and cleaved-caspase 3.ResultsCBS and CSE were observed in BRL cells.After transfection of CBS/CSE siRNA,endogenous H2S generation decreased and the apoptosis of BRL cells increased.Accordingly,the expression of intracytoplasm-Cyt C and cleaved-caspase 3 increased.ConclusionThe inhibition of endogenous H2S synthesis induced the apoptosis of BRL cells under physiological condition,which may be involved in mitochondrial pathway of apoptosis.

cystathionine β-synthase;cystathionine gamma-lyase;hydrogen sulfide;RNA,small interfering; apoptosis;BRL cells

R363.1

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.09.002

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81300346）

天津市第一中心醫(yī)院病理科（郵編300100）

△通訊作者 E-mail:yanhuang2@163.com