P53對蛋白激酶R和宮頸癌HeLa細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

羅遠材 郭 路

P53對蛋白激酶R和宮頸癌HeLa細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

羅遠材 郭 路

目的 探討P53蛋白對蛋白激酶R（PKR）表達和活性以及對宮頸癌HeLa細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。方法構(gòu)建過表達p53基因的重組質(zhì)粒pEGFP-C1/p53，轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測pEGFP-C1/p53轉(zhuǎn)染組、空質(zhì)粒pEGFP-C1轉(zhuǎn)染組及空白對照組（僅加入轉(zhuǎn)染試劑）p53及PKR mRNA的表達；采用Western Blot法檢測上述3組中P53、PKR、磷酸化型PKR(p-PKR)，PKR下游底物真核細(xì)胞翻譯啟始因子2α （eIF2α）的磷酸化型p-eIF2α的表達；采用四甲基偶氮唑藍（MTT）法檢測HeLa細(xì)胞增殖活性變化，Transwell侵襲實驗檢測HeLa細(xì)胞侵襲能力變化。結(jié)果pEGFP-C1/p53轉(zhuǎn)染組p53及PKR mRNA的相對表達量高于pEGFP-C1轉(zhuǎn)染組和空白對照組（均P＜0.05），pEGFP-C1轉(zhuǎn)染組和空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；pEGFP-C1/p53轉(zhuǎn)染組P53、PKR、p-PKR及p-eIF2α蛋白的相對表達量高于pEGFP-C1轉(zhuǎn)染組和空白對照組（均P＜0.05），pEGFP-C1轉(zhuǎn)染組和空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；pEGFP-C1/p53轉(zhuǎn)染組HeLa細(xì)胞增殖活性及侵襲能力均顯著低于pEGFP-C1轉(zhuǎn)染組和空白對照組（均P＜0.05），pEGFP-C1轉(zhuǎn)染組和空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論P53能上調(diào)PKR的表達及活性，激活PKR/eIF2α信號通路，抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖及侵襲。

基因，p53；蛋白激酶類；細(xì)胞增殖；腫瘤侵潤；真核細(xì)胞翻譯啟始因子2α

高危型人乳頭狀瘤病毒（high-risk human papilloma virus，hsHPV）感染宮頸上皮細(xì)胞在宮頸癌的成因中起重要作用。蛋白激酶R(PKR)是機體抗病毒防御機制中的重要分子，在抵御病毒感染、抗腫瘤方面均發(fā)揮重要的生物學(xué)效應(yīng)。本研究小組前期工作發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌HeLa細(xì)胞中，PKR的表達及活性均受到明顯的抑制[1]。因此，尋找能夠上調(diào)PKR表達及活性的調(diào)控因子對于抵御宮頸hsHPV感染、預(yù)防及治療宮頸癌均具有重要意義。p53基因是機體重要的抑瘤基因，其在誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化與衰老等方面發(fā)揮重要作用，并參與多種基因的調(diào)控[2]。本研究采用使宮頸癌HeLa細(xì)胞過表達p53的方法來觀察其對PKR表達及活性、HeLa細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人宮頸癌HeLa細(xì)胞由天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞形態(tài)學(xué)實驗室提供；pEGFP-C1質(zhì)粒載體、大腸桿菌菌株XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞、內(nèi)切酶KpnⅠ和BamHⅠ、T4DNA連接酶，購自天津賽爾生物技術(shù)有限公司；新生胎牛血清（FBS）、DMEM高糖培養(yǎng)基，購自美國Hyclone生物科技發(fā)展公司；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄和擴增試劑盒均購自北京全式金生物公司；小鼠抗人管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）內(nèi)參單克隆抗體、兔抗人PKR、磷酸化型PKR（p-PKR）（Thr446）、磷酸化型真核細(xì)胞翻譯啟始因子2α（peIF2α）（Ser51）、突變型p53多克隆抗體購自美國Santa Cruz生物公司；HRP-標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、HRP-標(biāo)記山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物公司；噻唑藍(MTT)粉末購自Sigma公司；Transwell侵襲小室購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)條件及生長特點 人宮頸癌HeLa細(xì)胞培養(yǎng)于含10％FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃、5％ CO2、相對濕度90％，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞呈單層貼壁生長，鋪滿培養(yǎng)瓶后用胰蛋白酶消化后進行傳代。

1.2.2 載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 設(shè)計含有KpnⅠ、BamHⅠ酶切位點并能擴增p53基因（序列號：NC_000017）的引物序列，上游5′-CGGGGTACCATGGAGGAGCCGCAGTCAGATCC-3′，下游5′-CGCGGATCC TCAGTCTGAGTCAGGCCCTTCTG-3′，擴增片段長度1 182 bp。PCR法擴增p53基因序列，反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性45 s，58℃退火40 s，72℃延伸90 s，30個循環(huán)；72℃附加延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)KpnⅠ和BamHⅠ雙酶切后連入線性化的pEGFP-C1質(zhì)粒載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞進行擴增，然后回收、純化重組質(zhì)粒進行酶切鑒定，獲得重組質(zhì)粒pEGFP-C1/p53；轉(zhuǎn)染前1 d將2×105的HeLa細(xì)胞接種至6孔板中，用2 mL的DMEM高糖培養(yǎng)基（含10％FBS）培養(yǎng)24 h后，將p53過表達質(zhì)粒pEGFP-C1/p53載體及其對應(yīng)空載體pEGFP-C1轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，轉(zhuǎn)染步驟嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000的操作說明進行。實驗分3組：pEGFPC1/p53轉(zhuǎn)染組、pEGFP-C1轉(zhuǎn)染組及空白對照組（僅加入轉(zhuǎn)染試劑），轉(zhuǎn)染6 h后更換為含10％FBS的完全培養(yǎng)液，在37℃、5％CO2、相對濕度90％的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，進行下列實驗，mRNA及蛋白提取所用細(xì)胞數(shù)量級相同，每種實驗至少重復(fù)3次。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測p53及PKR mRNA的表達 轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，檢測RNA純度:吸光度(A)260/A280在1.8～2.0之間，瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA的完整性。取4 μL總RNA，加入到20 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，然后以p53及PKR對應(yīng)的PCR引物以及GAPDH作內(nèi)參進行PCR檢測。RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄和擴增的實驗步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明進行。引物序列：GAPDH上游5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′，下游5′-CCATCACGCCACAGTTTCC-3′，擴增片段長616 bp；p53上游5′-AGAATCTCCGCAAGAAAGG-3′，下游5′-GCTGGTATGTCCTACTCCC-3′，擴增片段長度539 bp；PKR上游5′-AAGAAGAGGCGAGAAACTAG-3′，下游5′-TTCAGAAGGGCTCTAACATG-3′，擴增片段長度529 bp。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，56℃退火1 min，72℃延伸40 s，40個循環(huán)；72℃附加延伸6 min。PCR產(chǎn)物進行2％瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)掃描、成像，用Bio-Rad成像分析軟件Quantity One分析結(jié)果。

1.2.4 Western Blot檢測P53、PKR、p-PKR、p-eIF2α及GAPDH蛋白的表達 轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度后進行12％SDS-PAGE變性膠電泳、轉(zhuǎn)膜、5％脫脂奶粉溶液封閉2 h后加入一抗工作液于4℃過夜，TBST洗膜、加入二抗工作液室溫孵育2 h、TBST洗膜后加入化學(xué)發(fā)光底物，感光膠片顯影，經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)掃描、成像，用Bio-Rad成像分析軟件Quantity One分析結(jié)果。目的條帶相對含量＝目的條帶灰度值/標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參灰度值。

1.2.5 MTT法檢測HeLa細(xì)胞增殖活性 于96孔板中，用p53過表達質(zhì)粒pEGFP-C1/p53載體及其對應(yīng)空載體pEGFP-C1轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，每組設(shè)6個復(fù)孔，每孔分別加入新鮮配制的5 g/L MTT溶液20 μL，同時設(shè)置調(diào)零孔。培養(yǎng)箱內(nèi)溫育4 h，分別于轉(zhuǎn)染后12、24和48 h各檢測1次。檢測前每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，酶標(biāo)儀波長490 nm處檢測各孔的A值，以此間接代表每組細(xì)胞的增殖狀態(tài)。

1.2.6 Transwell侵襲實驗檢測HeLa細(xì)胞侵襲能力 于24孔板中，每組設(shè)4個復(fù)孔，將Matrigel基質(zhì)膠稀釋1倍后均勻鋪于Transwell小室的上室微孔膜上，37℃孵育4 h。收集轉(zhuǎn)染48 h后的HeLa細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至2×105/mL，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中饑餓培養(yǎng)24 h。Transwell小室的上室加入不含血清的饑餓培養(yǎng)細(xì)胞懸液200 μL 及0.1％BSA，下室加入500 μL含15％FBS的DMEM培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)36 h，棉簽擦去上室上面的非侵襲細(xì)胞及基質(zhì)膠，4％多聚甲醛室溫固定30 min，0.01％伊紅染液37℃染色30 min，將小室晾干，正置于載玻片上，在倒置顯微鏡下隨機讀取10個200×視野，計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)目并取均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料多組間比較用單因素方差分析，多重比較采用Newman-Keuls-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組p53、PKR mRNA的表達水平 p53及PKR mRNA的相對表達量在pEGFP-C1/p53轉(zhuǎn)染組均高于pEGFP-C1轉(zhuǎn)染組和空白對照組（P＜0.05），而pEGFP-C1轉(zhuǎn)染組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,見圖1、表1。

Fig.1 Transcription level of p53 and PKR in every group圖1 各組p53、PKR mRNA的表達

2.2 各組P53、PKR、p-PKR、p-eIF2α蛋白的表達水平 P53、PKR、p-PKR、p-eIF2α蛋白的相對表達量在pEGFP-C1/p53轉(zhuǎn)染組均高于pEGFP-C1轉(zhuǎn)染組和空白對照組（P＜0.05），而pEGFP-C1轉(zhuǎn)染組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖2、表1。

2.3 各組HeLa細(xì)胞增殖活性 轉(zhuǎn)染后12 h,細(xì)胞增殖活性A值3組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；轉(zhuǎn)染后24 h和48 h，pEGFP-C1/p53轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖活性A值均低于pEGFP-C1轉(zhuǎn)染組和空白對照組（P＜0.05），而pEGFP-C1轉(zhuǎn)染組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

Fig.2 Protein expression of p53，PKR，p-PKR and p-eIF2α in every group圖2 各組P53、PKR、p-PKR、p-eIF2α蛋白的表達

Tab.1 Transcription levels of of p53，PKR mRNA and protein expression levels of P53，PKR，p-PKR and p-eIF2α in every group表1 各組p53、PKR mRNA及P53、PKR、p-PKR、p-eIF2α蛋白的表達水平 （n=6，±s）

Tab.1 Transcription levels of of p53，PKR mRNA and protein expression levels of P53，PKR，p-PKR and p-eIF2α in every group表1 各組p53、PKR mRNA及P53、PKR、p-PKR、p-eIF2α蛋白的表達水平 （n=6，±s）

＊P＜0.05；a與pEGFP-C1/p53轉(zhuǎn)染組比較，P＜0.05，表2同

組別pEGFP-C1/p53轉(zhuǎn)染組pEGFP-C1轉(zhuǎn)染組空白對照組F mRNA p53 1.35±0.42 0.76±0.22a0.71±0.21a7.658＊PKR 0.94±0.31 0.58±0.14a0.56±0.12a6.823＊組別pEGFP-C1/p53轉(zhuǎn)染組pEGFP-C1轉(zhuǎn)染組空白對照組F蛋白P53 1.28±0.37 0.62±0.15a0.57±0.14a7.239＊PKR 1.73±0.46 0.77±0.21a0.82±0.24a8.261＊p-PKR 0.89±0.25 0.23±0.07a0.26±0.08a8.787＊p-eIF2α 0.53±0.12 0.15±0.04a0.17±0.04a7.586＊

Tab.2 Comparison of absorbance value and transmembrane cell number in every group表2 各組細(xì)胞增殖活性及穿膜細(xì)胞數(shù)比較（n=6，±s）

Tab.2 Comparison of absorbance value and transmembrane cell number in every group表2 各組細(xì)胞增殖活性及穿膜細(xì)胞數(shù)比較（n=6，±s）

組別pEGFP-C1/p53轉(zhuǎn)染組pEGFP-C1轉(zhuǎn)染組空白對照組F轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖活性(A值) 12 h 0.47±0.12 0.56±0.14 0.58±0.14 2.496 24 h 0.52±0.13 0.77±0.18a0.79±0.19a6.709＊48 h 0.35±0.09 0.86±0.21a0.88±0.21a7.596＊穿膜細(xì)胞數(shù)（個）22.7±4.6 41.8±7.3a45.2±7.9a18.515＊＊

2.4 各組HeLa細(xì)胞侵襲能力 pEGFP-C1/p53轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)均低于pEGFP-C1轉(zhuǎn)染組和空白對照組（P＜0.05），而pEGFP-C1轉(zhuǎn)染組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

3 討論

p53基因編碼393個氨基酸組成的53 ku的核內(nèi)磷酸化蛋白，被稱為P53蛋白。P53蛋白控制著細(xì)胞周期的啟動，與細(xì)胞周期的調(diào)控、DNA修復(fù)、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡等重要的生物學(xué)功能有關(guān)[3]。目前研究認(rèn)為，hsHPV E6蛋白能使P53蛋白滅活，而hsHPV感染恰恰是宮頸癌發(fā)生的重要因素，因此，p53基因在宮頸癌細(xì)胞的表達及活性被抑制[4]。筆者在前期工作中發(fā)現(xiàn)，通過RNA干擾的辦法沉默宮頸癌HeLa細(xì)胞HPV18 E6基因的表達，PKR的表達及磷酸化水平均顯著升高[1]。究其原因，除了HPV18 E6蛋白對PKR的直接抑制作用外，還可能與HPV18 E6蛋白表達降低，部分恢復(fù)P53蛋白的表達及活性，增強了其對PKR的正調(diào)節(jié)作用有關(guān)。

PKR是一種絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，在病毒復(fù)制過程中產(chǎn)生的雙鏈RNA能與PKR結(jié)合，誘使PKR分子構(gòu)型發(fā)生改變，導(dǎo)致其多個絲氨酸、蘇氨酸位點自動磷酸化而被激活，其中以第446位蘇氨酸殘基磷酸化最為重要[5-7]。PKR的底物主要是真核細(xì)胞翻譯啟動因子2α（eIF2α），激活的PKR能使eIF2α第51位絲氨酸殘基磷酸化，磷酸化的eIF2α再通過其下游一系列級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致宿主細(xì)胞蛋白合成完全受到抑制而凋亡[7]。通過抑制蛋白合成、誘導(dǎo)感染細(xì)胞凋亡是PKR抑制病毒復(fù)制及傳播、及時清除病變細(xì)胞的主要機制。因此，PKR是宿主防御機制中發(fā)動細(xì)胞死亡來對抗病毒感染和腫瘤形成的重要靶點，而PKR/eIF2α信號通路的活性維持對控制HPV感染、及時清除腫瘤前體細(xì)胞具有重要意義。相關(guān)研究認(rèn)為，P53蛋白能直接作用于干擾素調(diào)節(jié)因子9(IRF9)，其為干擾素激活PKR途徑中的重要因子，亦能直接作用于PKR的啟動子，對PKR的表達及激活起重要作用[8-9]。

為進一步驗證宮頸癌HeLa細(xì)胞中p53對PKR的調(diào)節(jié)作用，本研究成功構(gòu)建了過表達p53基因的重組質(zhì)粒載體pEGFP-C1/p53，將其轉(zhuǎn)染宮頸癌HeLa細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，PKR的表達及活性（磷酸化水平）均顯著升高，表明p53確實對PKR的表達及活性具有升調(diào)節(jié)作用。PKR是一個重要的凋亡效應(yīng)因子，本研究結(jié)果顯示，在PKR表達及活性升高的情況下，其下游底物p-eIF2α水平亦明顯升高，在此情況下HeLa細(xì)胞蛋白合成將受到顯著地抑制而發(fā)生凋亡，導(dǎo)致其增殖活性下降，而穿膜細(xì)胞數(shù)的顯著降低亦表明HeLa細(xì)胞的侵襲能力同樣受到了明顯的抑制。以上結(jié)果表明，P53蛋白通過上調(diào)PKR的表達及活性激活了PKR/eIF2α信號傳導(dǎo)通路，間接導(dǎo)致HeLa細(xì)胞的增殖及侵襲能力受到了明顯的抑制，故P53可作為PKR/eIF2α信號通路的有效調(diào)節(jié)者。

有研究指出，p53與PKR共表達對調(diào)控細(xì)胞周期阻滯有協(xié)同作用，PKR還可促進P53蛋白磷酸化、增強其穩(wěn)定性及活性[10]，對阻斷HPV感染及誘導(dǎo)病變細(xì)胞凋亡無疑具有重要意義。但如何持久保持兩者在宮頸病變細(xì)胞中的活性還有待更深入的研究。

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（2014-02-13收稿 2014-09-05修回）

（本文編輯 魏杰）

Effect of p53 on Protein Kinase R and Biological Behavior of Cervical Cancer HeLa Cells

LUO Yuancai，GUO Lu
Department of Gynecology and Obstetrics,Tianjin First Central Hospital，Tianjin 300192，China

ObjectiveTo investigate the effects of p53 on expression and activity of protein kinase R(PKR)as well as biological characters of HeLa cells from cervical carcinoma patients.MethodsRecombinant plasmid vector pEGFPC1/p53 was constructed to over-express p53 then it was transfected into HeLa cells.Transcription levels of p53 and PKR mRNA were detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR)among pEGFP-C1/p53 transfection group,pEGFP-C1 transfection group and blank control group（only transfection reagent was added）；Protein expression levels of p53,PKR,phosphated PKR（p-PKR）and phosphated α subunit of eukaryotic initiation factor 2（p-eIF2α）which is the downstream substrate of PKR were detected by Western Blot among three groups；Proliferation of HeLa cell were determined by methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay；Invasion of HeLa cell were determined by Transwell cell assay.ResultsRecombinant plasmid vector pEGFP-C1/p53 was successfully constructed to overexpress p53；Transcription level of p53 and PKR mRNA in pEGFP-C1/p53 transfection group were higher than those in pEGFP-C1 transfection group and in blank control group(P＜0.05)，and there were no significant difference between their levels in pEGFP-C1 transfection group and in blank control group；Protein expression levels of p53,PKR,p-PKR andp-eIF2α in pEGFP-C1/p53 transfection group were higher than those in pEGFP-C1 transfection group and in blank control group(P＜0.05)，and there were no significant difference between those expression levels in pEGFP-C1 transfection group and in blank control group；MTT and Transwell cell results showed that proliferation and invasion of HeLa cells in pEGFP-C1/p53 transfection group were weaker than those in pEGFP-C1 transfection group and in blank control group(P＜0.05)，and there were no significant difference between proliferation and invasion of HeLa cells in pEGFP-C1 transfection group and in blank control group.Conclusionp53 can up-regulate the expression and activity of PKR,promote activation of PKR/eIF2α signal transduction passage and restrain cell proliferation and invasion of HeLa cells.

genes,p53;protein kinases;cell proliferation;neoplasm invasiveness;α subunit of eukaryotic initiation factor 2

R737.33

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.12.005

天津市衛(wèi)生局科技基金重點項目(2012KR05)

天津市第一中心醫(yī)院婦產(chǎn)科（郵編300192）