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    Hedgehog信號(hào)通路在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及作用

    2014-07-05 16:39:09李曉明楊春雨關(guān)有良
    天津醫(yī)藥 2014年12期
    關(guān)鍵詞:信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)克隆通路

    李曉明楊春雨關(guān)有良

    Hedgehog信號(hào)通路在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及作用

    李曉明1楊春雨2關(guān)有良3

    目的 研究人腎透明細(xì)胞癌(RCCC)中Hedgehog信號(hào)通路相關(guān)因子Shh、Ptch、Smo和Gli1蛋白的表達(dá),探討Hedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常激活與RCCC的關(guān)系。方法應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)76例RCCC標(biāo)本及12例癌旁正常腎組織,應(yīng)用蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)10例新鮮癌組織及癌旁正常腎組織中Shh、Ptch、Smo和Gli1蛋白的表達(dá)。結(jié)果Shh、Ptch、Smo和Gli1蛋白在RCCC中的異常表達(dá)率(分別為52.6%、63.2%、44.7%、60.5%)高于正常腎組織(分別為8.3%、16.7%、8.3%、25.0%)。且其表達(dá)與患者的年齡、性別和腫瘤大小無(wú)顯著相關(guān),而與腫瘤臨床分期有關(guān),隨腫瘤的惡性程度加重,表達(dá)率增加。結(jié)論Hedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在RCCC中呈現(xiàn)高度激活狀態(tài),此通路的激活可能與RCCC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),有望成為治療RCCC的靶點(diǎn)。

    腎透明細(xì)胞癌;Hedgehog信號(hào)通路;免疫組織化學(xué);印跡法,蛋白質(zhì)

    腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是起源于腎實(shí)質(zhì)泌尿小管上皮的惡性腫瘤。腎透明細(xì)胞癌(renal clear cell carcinoma,RCCC)是最常見(jiàn)的成人腎腫瘤,約占RCC的80%。Hedgehog(Hh)信號(hào)傳導(dǎo)通路是一個(gè)高度保守的調(diào)控胚胎發(fā)育的信號(hào)通路,對(duì)胚胎發(fā)育及細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化都有重要調(diào)控作用[1]。此信號(hào)通路的功能異常會(huì)導(dǎo)致各種先天性畸形和腫瘤[2]。有學(xué)者認(rèn)為Hh信號(hào)通路的分子蛋白可以作為特異性治療癌癥的靶點(diǎn)[3]。Hh信號(hào)通路正逐漸成為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)領(lǐng)域新的研究熱點(diǎn),但目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與RCCC發(fā)生關(guān)系的研究相對(duì)較少。本研究通過(guò)免疫組化及蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)Hh信號(hào)通路相關(guān)因子Shh、Ptch、Smo和Gli1蛋白的表達(dá),旨在探討Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常激活與RCCC之間的關(guān)系及臨床意義。

    1 材料與方法

    1.1 材料 收集遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院2005年1月—2013年12月手術(shù)治療、資料完整的腎透明細(xì)胞癌石蠟組織標(biāo)本76例及12例癌旁正常腎組織標(biāo)本。術(shù)前所有患者均未經(jīng)放療和化療。其中男46例,女30例;年齡45~76歲,平均(60.24±4.31)歲。腫瘤分期依據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)(2002AJCC)的分期標(biāo)準(zhǔn),Ⅰ期38例,Ⅱ期22例,Ⅲ期~Ⅳ期16例。10例新鮮腎透明細(xì)胞癌及癌旁組織來(lái)自同一醫(yī)院2011年1月—2013年12月手術(shù)切除標(biāo)本。

    1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 Shh兔多克隆抗體,Ptch羊多克隆抗體,Smo兔多克隆抗體和Gli1兔多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司,β-actin鼠單克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物制品有限公司,SABC試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物制品有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 免疫組化染色 石蠟切片厚5 μm,脫蠟水化,3%H2O2孵育,微波修復(fù),于BSA室溫孵育,分別滴加兔多克隆抗體Shh(1∶50)、羊多克隆抗體Ptch(1∶50)、兔多克隆抗體Smo (1∶50)和兔多克隆抗體Gli1(1∶50)濕盒中4℃過(guò)夜。二抗37℃溫箱20 min,SABC 37℃溫箱30 min,DAB顯色,蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。

    1.3.2 Western Blotting測(cè)定 在10例新鮮腎透明細(xì)胞癌及癌旁組織中加入裂解液,剪碎、離心,考馬斯亮藍(lán)法蛋白質(zhì)定量,上樣,電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,分別滴加一抗Shh(1∶300),Ptch (1∶300)、Smo(1∶300)、Gli1(1∶300)和β-actin(1∶400)4℃過(guò)夜,與二抗室溫下孵育1 h,ECL顯色。應(yīng)用FluorchemⅤ2.0系統(tǒng)進(jìn)行吸光度測(cè)定。

    1.3.3 結(jié)果判定 以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比結(jié)合染色強(qiáng)度計(jì)分做定性分析[4]。任意選取10個(gè)高倍視野,計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞。(1)計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比。0級(jí):0~5%;1級(jí):>5%~25%;2級(jí):>25%~50%;3級(jí):>50%。(2)根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的染色強(qiáng)度。0級(jí):陰性;1級(jí):淺黃色;2級(jí):棕色;3級(jí):深棕色。兩項(xiàng)評(píng)分結(jié)果相加。0分、1~2分、3~4分和5~6分分別對(duì)應(yīng)陰性、+(低表達(dá))、++(中度表達(dá))和+++(強(qiáng)表達(dá))。本研究將++/+++判定為異常表達(dá)。

    2 結(jié)果

    2.1 免疫組化染色結(jié)果 Shh、Ptch和Smo蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞的胞質(zhì)或胞膜,Gli1蛋白主要表達(dá)在胞核。Shh、Ptch、Smo和Gli1蛋白在RCCC組織中的異常表達(dá)率高于癌旁正常腎組織(P<0.05),見(jiàn)圖1、表1。

    Tab.1 Expression of Hedgehog signaling pathway in RCCC and normal kidney tissues表1 Hedgehog信號(hào)通路相關(guān)因子在腎透明細(xì)胞癌及正常腎組織中的表達(dá) 例(%)

    2.2 Hedgehog信號(hào)通路相關(guān)因子的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 不同年齡、性別、腫瘤大小RCCC患者的Shh、Ptch、Smo和Gli1蛋白異常表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,Ⅲ~Ⅳ期患者的Shh、Ptch、Smo、Gli1蛋白異常表達(dá)率高于Ⅰ~Ⅱ期者(P<0.05),見(jiàn)表2。

    2.3 Western Blotting結(jié)果 Shh、Ptch、Smo和Gli1在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)均明顯高于正常腎組織(P<0.05),見(jiàn)圖2。

    3 討論

    Hh信號(hào)通路是人類胚胎發(fā)育過(guò)程中調(diào)控細(xì)胞增殖和分化的重要信號(hào)通路。研究顯示,Hh基因過(guò)度表達(dá)或者靶基因突變,可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、阻斷細(xì)胞凋亡等參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[5]。此外,Hh信號(hào)通路在腫瘤干細(xì)胞自我更新、細(xì)胞持續(xù)分化以及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等方面同樣發(fā)揮重要作用。

    Hh信號(hào)通路主要包括配體Shh、跨膜蛋白受體Ptch和Smo組成的受體復(fù)合物以及下游轉(zhuǎn)錄因子Gli。Hh信號(hào)通路的效應(yīng)串聯(lián)始于靶細(xì)胞中配體Shh與Ptch的結(jié)合。在機(jī)體處于正常狀態(tài)時(shí),Ptch可以抑制Smo的活性。反之,當(dāng)Shh配體過(guò)度表達(dá),與Ptch結(jié)合,就可以使Ptch快速分解,解除其對(duì)Smo的抑制,釋放Smo進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)?;罨腟mo促使在細(xì)胞質(zhì)微管上附著的Hh復(fù)合物(HSC)發(fā)生超磷酸化,Gli與HSC脫離,進(jìn)入細(xì)胞核,導(dǎo)致其下游核轉(zhuǎn)錄因子Gli1激活,從而進(jìn)一步激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[6]。Gli蛋白家族是Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游末端的重要轉(zhuǎn)錄因子,其表達(dá)水平的高低是Hh通路激活程度的標(biāo)志[7]。

    國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道,經(jīng)典的Hh信號(hào)傳導(dǎo)通路與腫瘤有關(guān),如在胰腺癌、小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、肝癌、基底細(xì)胞癌、髓母細(xì)胞瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種腫瘤中均有異常表達(dá)[8]。本研究結(jié)果顯示,RCCC組織中的Shh、Ptch、Smo及Gli 1蛋白異常表達(dá)率分別為52.6%、63.2%、44.7%及60.5%,明顯高于正常腎組織,提示在RCCC中確實(shí)存在Hh信號(hào)通路的異常激活,推測(cè)Hh信號(hào)通路參與了RCCC的發(fā)生和發(fā)展。此外,結(jié)果表明Shh、Ptch、Smo和Gli1蛋白的表達(dá)與患者的年齡,性別和腫瘤大小無(wú)關(guān),與腫瘤臨床分期有關(guān),隨腫瘤的惡性程度加重,其表達(dá)率增加,提示Hh信號(hào)通路相關(guān)因子可能會(huì)作為一種診斷RCCC的生物學(xué)標(biāo)志物。Hh信號(hào)通路與許多調(diào)控細(xì)胞增殖分化的其他信號(hào)通路如Notch、Wnt、Ras/ ERK等都有交叉作用。因此當(dāng)Hh傳導(dǎo)通路被激活,可能與多基因、多信號(hào)系統(tǒng)、多因素共同作用,參與了腎細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展。

    Fig.1 Expression of Hedgehog signaling pathway in RCCC(×400)圖1 Hedgehog信號(hào)通路相關(guān)因子在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)(×400)

    Tab.2 Expression of Hedgehog signaling pathway in RCCC and their relationship with clinicaopathologic factors表2 Hedgehog信號(hào)通路在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

    Fig.2 Western blotting analysis of Shh,Ptch,Smo and Gli1 in RCCC圖2 Shh、Ptch、Smo和Gli1在腎透明細(xì)胞癌中的Western Blotting分析

    [1]Barakat MT,Humke EW,Scott MP.Learning from Jekyll to control Hyde:Hedgehog signaling in development and cancer[J].Trends Mol Med,2010,16(8):337-348.doi:10.1016/j.molmed.2010.05.003.

    [2]Marini KD,Payne BJ,Watkins DN,et al.Mechanisms of Hedgehog signalling in cancer[J].Growth Factors,2011,29(6):221-234.doi: 10.3109/08977194.2011.610756.

    [3]An SM,Ding QP,Li LS.Stem cell signaling as a target for novel drug discovery:recent progress in the WNT and Hedgehog pathways[J].Acta Pharmacol Sin,2013,34(6):777-783.doi:10.1038/aps.2013.64.

    [4]Liao X,Siu MK,Au CW,et al.Aberrant activation of hedgehog signaling pathway in ovarian cancers:effect on prognosis,cell invasion and differentiation[J].Carcinogenesis,2009,30(1):131-140.doi: 10.1093/carcin/bgn230.

    [5]Samarzija I,Beard P.Hedgehog pathway regulators influence cervical cancer cell proliferation,survival and migration[J].Biochem Biophys Res Commun,2012,425(1):64-69.doi:10.1016/j.bbrc.2012.07.051. [6]Atwood SX,Chang AL,Oro AE.Hedgehog pathway inhibition and the race against tumor evolution[J].J Cell Biol,2012,199(2):193-197.doi:10.1083/jcb.201207140.

    [7]Yu D,Shin HS,Lee YS,et al.Genistein attenuates cancer stem cell characteristics in gastric cancer through the downregulation of Gli1 [J].Oncol Rep,2014,31(2):673-678.doi:10.3892/or.2013.2893.

    [8]Szkandera J,Kiesslich T,Haybaeck J,et al.Hedgehog signaling pathway in ovarian cancer[J].Int J Mol Sci,2013,14(1):1179-1196. doi:10.3390/ijms14011179.

    (2014-06-02收稿 2014-07-25修回)

    (本文編輯 閆娟)

    Expression and Role of Hedgehog Signaling Pathway in Renal Clear Cell Carcinoma

    LI Xiaoming1,YANG Chunyu2,GUAN Youliang3
    1 Department of Histology and Embryology,Liaoning Medical College,Jinzhou 121001,China;2 Department of Pathology of the First Affiliated Hospital;3 Department of Urinary Surgery of the First Affiliated Hospital

    ObjectiveTo investigate the expression of Shh,Ptch,Smo and Gli1 proteins who belongs to components of Hedgehog signaling pathway,and to explore the relationship between the abnormal activated of Hedgehog signaling pathway with renal clear cell carcinoma(RCCC).MethodsProtein expressions were examined by immunohistochemistry in 76 cases of human RCCC and 12 pericarcinomatous tissues.And 10 fresh specimens from cancer tissues and pericarcinomatous tissues were used to examine expressions of Shh,Ptch,Smo and Gli1 by Western blotting.ResultsThe expressions of examined proteins were higher in RCCC than that in pericarcinomatous tissue.Shh(52.6%vs 8.3%),Ptch(63.2%vs 16.7%), Smo(44.7%vs 8.3%)and Gli1(60.5%vs 25.0%).The increased proteins levels were disassociated with age,gender,and tumorous size in RCCC.But it was significantly correlated with TNM stage of RCCC.The expressions were gradually increased with higher TNM stage of RCCC or more invasive malignancy.ConclusionHedgehog signaling pathway is highly activated in RCCC.It might be involved in initiation,progression of RCCC,and it might be used as the target for RCCC treatment.

    renal clear cell carcinoma;Hedgehog signaling pathway;immunohistochemistry;blotting,Western

    R737.11

    A

    10.3969/j.issn.0253-9896.2014.12.014

    遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20120141);遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計(jì)劃(LJQ2013092);遼寧醫(yī)學(xué)院博士啟動(dòng)(Y2011B02)

    1遼寧醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室(郵編121001);2遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理科,3泌尿外科

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