重組Lv—SWD蛋白的表達(dá)、純化與細(xì)菌結(jié)合試驗(yàn)

杜志強(qiáng)　林濤

摘要：通過重組Lv-SWD蛋白的表達(dá)與純化，進(jìn)行多克隆抗體的制備與細(xì)菌結(jié)合試驗(yàn)，研究凡納對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）重組SWD蛋白在先天免疫系統(tǒng)中的功能。結(jié)果表明，Lv-SWD的預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為12.9 ku，實(shí)際大小與理論值相符合。重組Lv-SWD蛋白作為抗原制備的多克隆抗體，可以較好地識(shí)別蛋白質(zhì)本身，且可以直接結(jié)合巨大芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）以及弧菌（Vibrio）4種細(xì)菌。

關(guān)鍵詞：凡納對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）；SWD抗菌肽；多克隆抗體制備；細(xì)菌結(jié)合試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）05-1189-02

目前，對(duì)于抗菌肽分子在先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮作用的機(jī)理還不是十分清楚，根據(jù)目前的研究結(jié)果來(lái)看，抗菌肽分子在發(fā)揮抑菌功能的過程中主要存在兩種模式，一種是直接與細(xì)菌作用將其瓦解，另一種是發(fā)揮蛋白酶活性抑制劑作用來(lái)將細(xì)菌除掉[1]。本研究以凡納對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）重組Lv-SWD蛋白作為研究對(duì)象，通過蛋白質(zhì)表達(dá)純化以及多克隆抗體的制備，利用細(xì)菌結(jié)合試驗(yàn)來(lái)研究Lv-SWD的細(xì)菌結(jié)合作用，進(jìn)一步豐富無(wú)脊椎動(dòng)物先天免疫系統(tǒng)關(guān)于抗菌肽的基本理論。

1 材料與方法

1.1 材料

表達(dá)菌株是含有pET-28a-Lv-SWD重組子的大腸桿菌表達(dá)菌株。細(xì)菌結(jié)合試驗(yàn)的目標(biāo)菌株分別是2種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌（金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、巨大芽孢桿菌Bacillus subtilis）和2種革蘭氏陰性細(xì)菌（綠膿桿菌Pseudomonas aeruginosa和弧菌Vibrio）。制備多克隆抗體需要的家兔為包頭市花苑小動(dòng)物市場(chǎng)購(gòu)買的普通長(zhǎng)耳白兔。

1.2 方法

1.2.1 目的蛋白的表達(dá)純化 對(duì)構(gòu)建的重組Lv-SWD蛋白的重組表達(dá)菌株進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體進(jìn)行超聲波破碎，并且通過蛋白質(zhì)電泳試驗(yàn)分析破碎后的上清液與包涵體沉淀中目的蛋白質(zhì)的存在情況。對(duì)于存在于破碎后上清液中的目的蛋白質(zhì)，可以直接利用His-tag鎳柱進(jìn)行親和純化；對(duì)于存在于包涵體中的目的蛋白質(zhì)，要進(jìn)行變性后的透析處理，才能進(jìn)行親和純化[2]。

1.2.2 多克隆抗體的制備與檢測(cè) 將親和純化后的目的重組蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE試驗(yàn)，檢測(cè)蛋白質(zhì)的純度，利用Bradford法檢測(cè)目的重組蛋白的濃度；之后將目的蛋白質(zhì)作為抗原免疫家兔，進(jìn)行多克隆抗體的制備；家兔免疫共需要4～5次，每次注射間隔7～10 d，并且按照皮下多點(diǎn)注射的原則每次至少注射200 ？滋g重組蛋白。首次免疫將蛋白質(zhì)抗原與弗氏完全佐劑按1∶1（V∶V，下同）進(jìn)行充分混合后注射，第二、第三次注射與弗氏不完全佐劑進(jìn)行充分混合后注射，從第四次免疫開始直接注射蛋白質(zhì)溶液[3]。利用Western Blot方法進(jìn)行多克隆抗體的檢測(cè)。

1.2.3 重組蛋白質(zhì)的細(xì)菌結(jié)合試驗(yàn) 將進(jìn)行細(xì)菌結(jié)合試驗(yàn)的目的細(xì)菌菌株進(jìn)行過夜培養(yǎng)，第二天低速離心收集細(xì)菌菌體，用500 ？滋L 1×PBS緩沖液懸起，加入經(jīng)過1×PBS緩沖液透析的500 ？滋L目的蛋白質(zhì)溶液（1 mg/mL），室溫條件下?lián)u床孵育1 h；低速離心后用500 ？滋L 1×PBS緩沖液洗滌5次。之后用7% SDS溶液200 ？滋L孵育菌體，沉淀10 min，離心后收集最后的菌體沉淀和7%的SDS洗脫液。將第五次的1×PBS洗脫液、7%的SDS洗脫液、最后的菌體沉淀作為樣品進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜后利用Western Blot方法檢測(cè)結(jié)合試驗(yàn)的效果，使用的抗體是重組Lv-SWD蛋白制備的多克隆抗體[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組Lv-SWD蛋白的純化與多克隆抗體的檢測(cè)結(jié)果

大腸桿菌表達(dá)菌株經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)能夠正確表達(dá)重組Lv-SWD蛋白，理論分子量為12.9 ku，由圖1可見，純化后蛋白條帶的大小接近14.3 ku，說明重組蛋白的大小與理論預(yù)測(cè)值相符。Western Blot分析結(jié)果（圖1）表明，重組Lv-SWD蛋白刺激家兔產(chǎn)生的多克隆抗體能夠較好的識(shí)別蛋白質(zhì)本身。

2.2 細(xì)菌結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果

細(xì)菌結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果（圖2）表明，利用重組Lv-SWD蛋白制備的多克隆抗體識(shí)別醋酸纖維素薄膜后，4種細(xì)菌的菌體沉淀處都有明顯的條帶出現(xiàn)，說明巨大芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌以及弧菌都能較好的結(jié)合重組Lv-SWD蛋白。

3 小結(jié)與討論

目前，對(duì)于抗菌肽分子的研究比較深入，尤其是在甲殼類動(dòng)物中的研究成果較多。在中國(guó)明對(duì)蝦、淡水小龍蝦、克氏原鰲蝦、南美白對(duì)蝦、斑節(jié)對(duì)蝦等動(dòng)物中分別發(fā)現(xiàn)了甲殼肽、溶菌酶、抗脂多糖因子、對(duì)蝦素等免疫效應(yīng)分子[5]，這些分子多數(shù)具有一定的先天免疫相關(guān)功能，包括抗菌活性、結(jié)合細(xì)菌活性、蛋白酶活性抑制作用等。通過研究這些分子的結(jié)構(gòu)特征發(fā)現(xiàn)，一般情況下無(wú)脊椎動(dòng)物先天免疫相關(guān)的抗菌肽分子具有廣泛的多樣性，包括結(jié)構(gòu)多樣性與功能多樣性[6]。在結(jié)構(gòu)方面，抗菌肽分子一般都包括一個(gè)典型的結(jié)構(gòu)域，例如WAP結(jié)構(gòu)域、對(duì)蝦素結(jié)構(gòu)域、溶菌酶結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域的最重要特點(diǎn)就是具有成對(duì)出現(xiàn)的半胱氨酸殘基，數(shù)目一般在8個(gè)以上[7]。

為了進(jìn)一步研究抗菌肽分子的結(jié)構(gòu)與功能之間的聯(lián)系，本研究選擇了凡納對(duì)蝦的SWD分子進(jìn)行了系統(tǒng)研究。凡納對(duì)蝦的SWD分子中存在一個(gè)單獨(dú)的WAP結(jié)構(gòu)域，這個(gè)結(jié)構(gòu)域主要由8個(gè)半胱氨酸殘基組成。通過結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，這8個(gè)半胱氨酸殘基可以形成4對(duì)二硫鍵，本研究在整個(gè)分子中形成一個(gè)球狀的實(shí)體結(jié)構(gòu)和一個(gè)疏水的空穴。通過大腸桿菌原核表達(dá)，利用重組蛋白作為抗原，制備了多克隆抗體。從而對(duì)分子的細(xì)菌結(jié)合功能進(jìn)行了研究，結(jié)合此前進(jìn)行的蛋白酶活性抑制試驗(yàn)，筆者發(fā)現(xiàn)重組的Lv-SWD蛋白具有抑制分泌型蛋白酶活性的作用，也存在直接結(jié)合細(xì)菌的功能，因此，推測(cè)在先天免疫系統(tǒng)中，Lv-SWD蛋白是一個(gè)重要的免疫效應(yīng)分子，在對(duì)抗細(xì)菌的入侵過程中應(yīng)該發(fā)揮著重要的功能。

參考文獻(xiàn)：

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