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    D—甘露糖電化學(xué)阻抗生物傳感器的研究

    2014-07-05 11:31:56鄒蕊馬貴
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年5期

    鄒蕊 馬貴

    摘要:糖類的研究已經(jīng)成為生物及化學(xué)領(lǐng)域一個(gè)新的熱點(diǎn)。凝集素與糖類之間的作用是生命活動(dòng)中一個(gè)重要的部分。試驗(yàn)設(shè)計(jì)了一種比較簡(jiǎn)單的D-甘露糖電化學(xué)阻抗傳感器,以刀豆凝集素為分子識(shí)別物質(zhì),共價(jià)鍵合法將刀豆凝集素固定到金圓盤電極的表面,用電化學(xué)阻抗法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明,以

    [Fe(CN)6]3-/4-氧化還原電對(duì)作為探針,電子轉(zhuǎn)移阻抗變化值與D-甘露糖的濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

    關(guān)鍵詞:電化學(xué)傳感器;阻抗;刀豆凝集素;D-甘露糖

    中圖分類號(hào):TP212.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):0439-8114(2014)05-1136-03

    細(xì)胞表面的糖化合物不僅在正常細(xì)胞的識(shí)別、細(xì)胞黏附和細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)等方面具有重要作用,而且在細(xì)胞病變、病原感染等研究方面亦有重要意義。因此,研究生物體內(nèi)糖類物質(zhì)的變化是一個(gè)非常重要的問題。近幾年來(lái),凝集素與糖類物質(zhì)之間特異性的相互作用引起了人們廣泛的關(guān)注。利用凝集素結(jié)合特性可以提供糖鏈末端結(jié)構(gòu)的信息,且具有特異、敏感、快速的特點(diǎn)[1]。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了以刀豆凝集素為分子識(shí)別物質(zhì),測(cè)定D-甘露糖的電化學(xué)交流阻抗生物傳感器。電化學(xué)交流阻抗技術(shù)是一種對(duì)電極界面性質(zhì)變化十分敏感而便捷的檢測(cè)技術(shù),能夠提供有關(guān)電極界面電子傳遞電阻,雙電層電容等多種界面參數(shù)的大量信息,而且是一種非標(biāo)記的技術(shù),具有簡(jiǎn)單且無(wú)需標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)[2]。試驗(yàn)利用刀豆凝集素與甘露糖的特異性相互作用,將半胱氨酸固定到電極表面之后,在N-(3-二甲氨基)-N-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的作用下,將半胱氨酸的羧基轉(zhuǎn)化為酰基[3],然后與刀豆凝集素的氨基形成酰氨鍵,從而將刀豆凝集素固定到電極表面,以檢測(cè)甘露糖。該傳感器電子轉(zhuǎn)移阻抗改變值與D-甘露糖的濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,為D-甘露糖的檢測(cè)提供了新思路。

    1 材料與方法

    1.1 試劑與儀器

    刀豆凝集素A(Concanavalin A,ConA)、N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基碳二亞胺鹽酸鹽[N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC]購(gòu)自Sigma公司;D-甘露糖 (C6H12O6)、半胱氨酸(Cysteine,CS)購(gòu)自Alfa Aesar公司。N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccimide,NHS)購(gòu)自上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)有限公司。緩沖液為0.10 mol/L磷酸緩沖溶液(PBS,pH 7.40)-10 mmol/L KCl。用0.10 mol/L PBS(pH 7.40)來(lái)配制5 mmol/L K3[Fe(CN)6]-5 mmol/L K4[Fe(CN)6]檢測(cè)溶液。

    NHS和EDC均使用0.10 mol/L PBS-10 mol/L KCl (pH 7.40)配制。其他試劑均為分析純,試驗(yàn)所用溶液均用超純水配制。

    刀豆凝集素的活化[4]:刀豆凝集素使用前用0.1 mmol/ L的Ca2+、Mn2+活化6 h。

    電化學(xué)分析系統(tǒng):CHI 660電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)。電極為三電極系統(tǒng),工作電極為金圓盤電極(Φ=2.0 mm),對(duì)極為鉑絲,參比電極為銀/氯化銀電極(Ag/AgCl 飽和KCl)。

    1.2 金圓盤電極預(yù)處理

    將金電極用0.03 ?滋m Al2O3溶膠研磨,然后用水沖洗;再將沖洗后的金電極在0.10 mol /L H2SO4溶液中在電位范圍0~1.6 V,循環(huán)伏安掃描直到得到標(biāo)準(zhǔn)金的還原峰,用二次水沖洗干凈備用[5]。

    1.3 生物傳感器的制備

    將預(yù)處理好的金電極浸入0.02 mol/L半胱胺酸溶液中浸泡16 h,然后用水沖洗,使金電極表面形成帶正電的自組裝膜[1](CS/Au),再將100 μL 40 mmol/L的EDC和10 mmol/ L的NHS的混合溶液滴加在CS/金電極上,使金電極表面的半胱胺酸得到活化,室溫下靜置1 h[6],然后用水沖洗(EDC-NHS/CS/ Au);再將活化后的CS/金電極在ConA溶液中浸泡1 h,利用活化后的CS與帶氨基的ConA共價(jià)鍵合結(jié)合,將ConA共價(jià)鍵合法固定在電極表面制備成傳感器(ConA/EDC-NHS/CS/ Au),如圖1所示。待用。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 循環(huán)伏安法表征

    圖2為傳感器制備過(guò)程中,不同修飾電極在5 mmol /L K3[Fe(CN)6]-5 mmol/L K4[Fe(CN)6]中的循環(huán)伏安圖。從圖2中可以看出,裸金電極的氧化還原峰電位差△E=0.083 1 V,當(dāng)在金電極自組裝了CS后,EDC+NHS/CS/Au上固定了刀豆凝集素之后,[Fe(CN)6]3-/4-平衡電對(duì)的氧化峰電流降低,原因是刀豆凝集素的等電點(diǎn)pI為4.5~5.0,在中性條件下(pH 7.40)會(huì)帶負(fù)電,因此,對(duì)荷負(fù)電的[Fe(CN)6]3-/4-平衡電對(duì)存在靜電排斥作用,使得氧化電流較固定有EDC+NHS/CS/Au的電極降低。當(dāng)加入D-甘露糖之后,[Fe(CN)6]3-/4-平衡電對(duì)的氧化峰電流繼續(xù)降低。這可能是由于刀豆凝集素結(jié)合D-甘露糖之后,空間位阻變大,導(dǎo)致[Fe(CN)6]3-/4-平衡電對(duì)在電極上的電子轉(zhuǎn)移受到阻礙。

    2.2 交流阻抗法表征

    圖3為傳感器制備過(guò)程中,不同修飾電極在5 mmol/L K3[Fe(CN)6]-5 mmol/L K4[Fe(CN)6]中的復(fù)平面阻抗圖。從圖3可以看出,EDC+NHS/CS/Au的阻抗譜幾乎為一直線,表明在此情況下,反應(yīng)是受擴(kuò)散控制的過(guò)程,平衡電對(duì)非常容易到達(dá)電極的表面發(fā)生反應(yīng),電極上不存在阻擋電子傳遞的物質(zhì)。這說(shuō)明羧基?;髱д?,吸引電子,阻抗值變小。而當(dāng)結(jié)合ConA之后,Nyquist圖上高頻區(qū)半圓增大。這一現(xiàn)象歸因于ConA本身分子比較大,電極表面的空間位阻就會(huì)變大,阻礙平衡電對(duì)向電極表面?zhèn)鬟f,使表面電子傳遞電阻Ret增大。

    從不同電極的循環(huán)伏安圖及交流阻抗圖中可以看出,在ConA固定到電極的過(guò)程中,電極表面的阻抗增大,電子傳遞速度變慢,而不同濃度的甘露糖結(jié)合到電極上之后,也會(huì)引起阻抗值的變化,這表明本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的D-甘露糖電化學(xué)交流阻抗傳感器能用于甘露糖的檢測(cè)。

    2.3 傳感器的線性范圍

    利用共價(jià)鍵合法制備電化學(xué)傳感器對(duì)不同濃度的D-甘露糖進(jìn)行測(cè)定。圖4為EDC+NHS/ConA/CS/金電極對(duì)不同濃度的D-甘露糖在5 mmol/L K3[Fe(CN)6]-5 mmol/LK4[Fe(CN)6]中的交流阻抗圖,內(nèi)插圖為阻抗差值與D-甘露糖濃度對(duì)數(shù)值之間的線性關(guān)系圖。從圖4中可見,EDC加NHS共價(jià)鍵和來(lái)固定刀豆凝集素的方法在甘露糖為5×10-9 mol/L至1×10-6 mol/L之間呈良好的線性關(guān)系。阻抗差值(y)與D-甘露糖的濃度(x,mol/L)在5×10-9 mol/L至1×10-6 mol/L之間也呈良好的線性關(guān)系,其線性回歸方程為y=521.5x+4 486.7,線性相關(guān)系數(shù)為0.975 7。

    3 結(jié)論

    本試驗(yàn)通過(guò)共價(jià)鍵和的方式,將刀豆凝集素固定到金電極的表面,研制了一種簡(jiǎn)單、靈敏的測(cè)定D-甘露糖的電化學(xué)阻抗傳感器。該傳感器電子轉(zhuǎn)移阻抗改變值與D-甘露糖的濃度在5×10-9 mol/L至1×10-6 mol/L之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。試驗(yàn)結(jié)果表明,刀豆凝集素與甘露糖的特異性相互作用能夠應(yīng)用于對(duì)甘露糖的定量檢測(cè),并獲得了較高的靈敏度,為D-甘露糖的檢測(cè)提供了新思路。

    參考文獻(xiàn):

    [1] 黎振華,羊小海,王 青,等.伴刀豆球蛋白A/葡聚糖修飾的金納米顆粒自組裝膜增強(qiáng)信號(hào)的表面等離子體共振葡萄糖傳感器[J].化學(xué)傳感器,2002,27(1):23-27.

    [2] LI X X,SHEN L H,ZHANG C X,et al. Electrochemical impedance spectroscopy for study of aptamer-thrombin interfacial interactions[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2008, 23(11):1624-1630.

    [3] BELLE J T, GERLACH J Q, SVROVSKY S,et al. Label-free lmpedimetric detection of glycan lectin interactions[J]. Anal Chem,2007,79(18):6959-6964.

    [4] 李揚(yáng)眉,陳志春,呂德水,等.辣根過(guò)氧化物酶活性膜結(jié)構(gòu)及生物電催化性能[J].物理化學(xué)學(xué)報(bào),2003,19(5):474-477.

    [5] ZHANG C X,HARUYAMA T,AIZAWA M, et al.Evaluation of substituted-1,10-phenanthroline complexes of osmium as mediator for glucose oxidase of Aspergillus niger[J].Analytica Chimica Acta.,2000,408(1-2):225-232.

    [6] 郭萌萌,楊云慧,王志杰,等. 基于伴刀豆球蛋白固定過(guò)氧化物酶無(wú)介體新型生物傳感器的研制[J].分析化學(xué),2006,34(3):399-402.

    從不同電極的循環(huán)伏安圖及交流阻抗圖中可以看出,在ConA固定到電極的過(guò)程中,電極表面的阻抗增大,電子傳遞速度變慢,而不同濃度的甘露糖結(jié)合到電極上之后,也會(huì)引起阻抗值的變化,這表明本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的D-甘露糖電化學(xué)交流阻抗傳感器能用于甘露糖的檢測(cè)。

    2.3 傳感器的線性范圍

    利用共價(jià)鍵合法制備電化學(xué)傳感器對(duì)不同濃度的D-甘露糖進(jìn)行測(cè)定。圖4為EDC+NHS/ConA/CS/金電極對(duì)不同濃度的D-甘露糖在5 mmol/L K3[Fe(CN)6]-5 mmol/LK4[Fe(CN)6]中的交流阻抗圖,內(nèi)插圖為阻抗差值與D-甘露糖濃度對(duì)數(shù)值之間的線性關(guān)系圖。從圖4中可見,EDC加NHS共價(jià)鍵和來(lái)固定刀豆凝集素的方法在甘露糖為5×10-9 mol/L至1×10-6 mol/L之間呈良好的線性關(guān)系。阻抗差值(y)與D-甘露糖的濃度(x,mol/L)在5×10-9 mol/L至1×10-6 mol/L之間也呈良好的線性關(guān)系,其線性回歸方程為y=521.5x+4 486.7,線性相關(guān)系數(shù)為0.975 7。

    3 結(jié)論

    本試驗(yàn)通過(guò)共價(jià)鍵和的方式,將刀豆凝集素固定到金電極的表面,研制了一種簡(jiǎn)單、靈敏的測(cè)定D-甘露糖的電化學(xué)阻抗傳感器。該傳感器電子轉(zhuǎn)移阻抗改變值與D-甘露糖的濃度在5×10-9 mol/L至1×10-6 mol/L之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。試驗(yàn)結(jié)果表明,刀豆凝集素與甘露糖的特異性相互作用能夠應(yīng)用于對(duì)甘露糖的定量檢測(cè),并獲得了較高的靈敏度,為D-甘露糖的檢測(cè)提供了新思路。

    參考文獻(xiàn):

    [1] 黎振華,羊小海,王 青,等.伴刀豆球蛋白A/葡聚糖修飾的金納米顆粒自組裝膜增強(qiáng)信號(hào)的表面等離子體共振葡萄糖傳感器[J].化學(xué)傳感器,2002,27(1):23-27.

    [2] LI X X,SHEN L H,ZHANG C X,et al. Electrochemical impedance spectroscopy for study of aptamer-thrombin interfacial interactions[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2008, 23(11):1624-1630.

    [3] BELLE J T, GERLACH J Q, SVROVSKY S,et al. Label-free lmpedimetric detection of glycan lectin interactions[J]. Anal Chem,2007,79(18):6959-6964.

    [4] 李揚(yáng)眉,陳志春,呂德水,等.辣根過(guò)氧化物酶活性膜結(jié)構(gòu)及生物電催化性能[J].物理化學(xué)學(xué)報(bào),2003,19(5):474-477.

    [5] ZHANG C X,HARUYAMA T,AIZAWA M, et al.Evaluation of substituted-1,10-phenanthroline complexes of osmium as mediator for glucose oxidase of Aspergillus niger[J].Analytica Chimica Acta.,2000,408(1-2):225-232.

    [6] 郭萌萌,楊云慧,王志杰,等. 基于伴刀豆球蛋白固定過(guò)氧化物酶無(wú)介體新型生物傳感器的研制[J].分析化學(xué),2006,34(3):399-402.

    從不同電極的循環(huán)伏安圖及交流阻抗圖中可以看出,在ConA固定到電極的過(guò)程中,電極表面的阻抗增大,電子傳遞速度變慢,而不同濃度的甘露糖結(jié)合到電極上之后,也會(huì)引起阻抗值的變化,這表明本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的D-甘露糖電化學(xué)交流阻抗傳感器能用于甘露糖的檢測(cè)。

    2.3 傳感器的線性范圍

    利用共價(jià)鍵合法制備電化學(xué)傳感器對(duì)不同濃度的D-甘露糖進(jìn)行測(cè)定。圖4為EDC+NHS/ConA/CS/金電極對(duì)不同濃度的D-甘露糖在5 mmol/L K3[Fe(CN)6]-5 mmol/LK4[Fe(CN)6]中的交流阻抗圖,內(nèi)插圖為阻抗差值與D-甘露糖濃度對(duì)數(shù)值之間的線性關(guān)系圖。從圖4中可見,EDC加NHS共價(jià)鍵和來(lái)固定刀豆凝集素的方法在甘露糖為5×10-9 mol/L至1×10-6 mol/L之間呈良好的線性關(guān)系。阻抗差值(y)與D-甘露糖的濃度(x,mol/L)在5×10-9 mol/L至1×10-6 mol/L之間也呈良好的線性關(guān)系,其線性回歸方程為y=521.5x+4 486.7,線性相關(guān)系數(shù)為0.975 7。

    3 結(jié)論

    本試驗(yàn)通過(guò)共價(jià)鍵和的方式,將刀豆凝集素固定到金電極的表面,研制了一種簡(jiǎn)單、靈敏的測(cè)定D-甘露糖的電化學(xué)阻抗傳感器。該傳感器電子轉(zhuǎn)移阻抗改變值與D-甘露糖的濃度在5×10-9 mol/L至1×10-6 mol/L之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。試驗(yàn)結(jié)果表明,刀豆凝集素與甘露糖的特異性相互作用能夠應(yīng)用于對(duì)甘露糖的定量檢測(cè),并獲得了較高的靈敏度,為D-甘露糖的檢測(cè)提供了新思路。

    參考文獻(xiàn):

    [1] 黎振華,羊小海,王 青,等.伴刀豆球蛋白A/葡聚糖修飾的金納米顆粒自組裝膜增強(qiáng)信號(hào)的表面等離子體共振葡萄糖傳感器[J].化學(xué)傳感器,2002,27(1):23-27.

    [2] LI X X,SHEN L H,ZHANG C X,et al. Electrochemical impedance spectroscopy for study of aptamer-thrombin interfacial interactions[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2008, 23(11):1624-1630.

    [3] BELLE J T, GERLACH J Q, SVROVSKY S,et al. Label-free lmpedimetric detection of glycan lectin interactions[J]. Anal Chem,2007,79(18):6959-6964.

    [4] 李揚(yáng)眉,陳志春,呂德水,等.辣根過(guò)氧化物酶活性膜結(jié)構(gòu)及生物電催化性能[J].物理化學(xué)學(xué)報(bào),2003,19(5):474-477.

    [5] ZHANG C X,HARUYAMA T,AIZAWA M, et al.Evaluation of substituted-1,10-phenanthroline complexes of osmium as mediator for glucose oxidase of Aspergillus niger[J].Analytica Chimica Acta.,2000,408(1-2):225-232.

    [6] 郭萌萌,楊云慧,王志杰,等. 基于伴刀豆球蛋白固定過(guò)氧化物酶無(wú)介體新型生物傳感器的研制[J].分析化學(xué),2006,34(3):399-402.

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