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    略陽(yáng)烏雞酪氨酸酶基因(TYR)遺傳變異分析

    2014-07-05 11:27:42路宏朝張濤江海李麗霞樊鵬輝
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年5期
    關(guān)鍵詞:遺傳變異

    路宏朝 張濤 江海 李麗霞 樊鵬輝

    摘要:試驗(yàn)通過(guò)PCR-SSCP技術(shù)檢測(cè)略陽(yáng)烏雞酪氨酸酶基因(TYR)部分啟動(dòng)子區(qū)、全部外顯子和部分內(nèi)含子的遺傳多樣性,并對(duì)不同基因型進(jìn)行了測(cè)序和比對(duì)分析。結(jié)果表明,略陽(yáng)雞群體在TYR位點(diǎn)具有較為豐富的遺傳變異,在所檢測(cè)的啟動(dòng)子區(qū)有2個(gè)單核苷酸多態(tài)(SNP)位點(diǎn);外顯子1有2個(gè)SNP位點(diǎn),外顯子2、3、4沒(méi)有檢測(cè)到變異位點(diǎn),外顯子5存在5個(gè)SNP位點(diǎn);檢測(cè)的部分內(nèi)含子2中發(fā)現(xiàn)2個(gè)SNP位點(diǎn)。mRNA上的7個(gè)變異位點(diǎn)有3個(gè)發(fā)生在編碼區(qū),但都是同義突變,沒(méi)有造成氨基酸變異。表明略陽(yáng)烏雞和普通雞的酪氨酸酶沒(méi)有氨基酸序列差異,TYR基因在雞的遺傳上是高度保守的。啟動(dòng)子區(qū)和內(nèi)含子區(qū)的遺傳變異是否與酪氨酸酶的轉(zhuǎn)錄剪接和表達(dá)量有關(guān),進(jìn)而影響烏雞黑色素的沉積還有待進(jìn)一步研究。

    關(guān)鍵詞:略陽(yáng)烏雞;酪氨酸酶基因(TYR);遺傳變異

    中圖分類(lèi)號(hào):S831;S813.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):0439-8114(2014)05-1123-05

    略陽(yáng)烏雞又稱(chēng)黑河烏雞,具有“六端烏”(烏皮、烏喙、烏腿、烏趾、烏舌、烏冠),體形大,生長(zhǎng)快、產(chǎn)肉多、肉質(zhì)細(xì)嫩鮮香,營(yíng)養(yǎng)豐富,兼有藥用價(jià)值,屬優(yōu)良肉用型地方雞種,其羽色復(fù)雜,有黑羽、麻羽、白羽等,是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期選育形成的寶貴資源,主要分布于秦嶺以南略陽(yáng)縣的黑河壩、觀音寺、仙臺(tái)壩、兩河口等地,是陜西省惟一的家禽保護(hù)品種,農(nóng)業(yè)部專(zhuān)家組來(lái)略陽(yáng)調(diào)研時(shí),將其與泰和烏雞、鄖陽(yáng)烏雞、江山烏雞共同列為中國(guó)四大烏雞品種,2008年被確立為“中國(guó)地理標(biāo)志產(chǎn)品” [1-4]。

    烏雞的滋補(bǔ)、藥用價(jià)值主要是與其體內(nèi)豐富的黑色素有關(guān), 黑色素具有延緩衰老、清除自由基、抗氧化、抗誘變、抗紫外線(xiàn)、抑制流感病毒等多種生理功能[5-10]。動(dòng)物黑色素可分為兩類(lèi), 一是真黑色素(Eumelanin), 不含硫原子, 呈棕色或黑色; 二是脫黑色素(Pheomelanin),含硫原子, 呈黃色或微紅棕色,烏骨雞黑色素屬于真黑色素,主要分布于烏雞的羽毛、皮膚、骨骼和肌肉中[11,12]。黑色素沉著決定于其所含真黑色素與脫黑色素的相對(duì)數(shù)量,而黑色素細(xì)胞中酪氨酸酶活性和表達(dá)量與兩種黑色素合成量比例呈正相關(guān)[11,13]。

    酪氨酸酶是控制黑色素生成的限速酶,酪氨酸在酪氨酸酶催化下生成3, 4-二羥基丙苯氨酸(多巴), 多巴進(jìn)一步氧化生成多巴醌, 多巴醌經(jīng)多聚化反應(yīng)與氧化反應(yīng)生成多巴色素, 在多巴色素異構(gòu)酶作用下, 多巴色素羥化為5, 6-二羥基吲哚羧酸( DHICA) , 脫羧成5, 6-二羥基吲哚, 再在酪氨酸酶催化下氧化成5, 6-吲哚醌, 最后與其他中間產(chǎn)物結(jié)合形成真黑色素。脫黑色素合成前期(酪氨酸到多巴醌)與真黑色素一致, 但在以后反應(yīng)中有半胱氨酸(Cys) 參加, 產(chǎn)生Cys-多巴和Cys-多巴醌, 然后通過(guò)關(guān)環(huán)、脫羧、最終形成脫黑色素[13]。家禽中真黑色素的合成目前多遵循經(jīng)典的Mason-Raper途徑,雞的酪氨酸酶基因(TYR)定位在1號(hào)染色體的長(zhǎng)臂4區(qū)4帶[12,14]。

    本研究以略陽(yáng)普通雞、略陽(yáng)麻羽烏雞與略陽(yáng)黑羽烏雞3個(gè)群體為對(duì)象,通過(guò)PCR和測(cè)序技術(shù)檢測(cè)略陽(yáng)雞TYR基因的SNP,分析略陽(yáng)雞TYR基因的遺傳變異對(duì)黑色素形成的影響,探討略陽(yáng)烏雞黑色素形成過(guò)程中TYR的分子作用機(jī)制,為開(kāi)發(fā)利用這一寶貴資源提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    從陜西漢中黑鳳烏雞產(chǎn)業(yè)園采集21只略陽(yáng)黑羽烏雞(LYHY)的血液,漢中農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)采集略陽(yáng)普通雞(LYPT)和略陽(yáng)麻羽烏雞(LYMY)各1只的血液,加ACD抗凝,置于-70 ℃低溫冰箱中保存, 根據(jù)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[15],采用酚-氯仿抽提法提取基因組DNA,溶于TE中,4 ℃保存。

    1.2 引用序列及引物序列

    從GenBank查得雞的TYR基因序列(GenBank登錄號(hào):L46805 和NC006088), TYR外顯子1及上游序列引物引自文獻(xiàn)[16],采用Primer5.0自行設(shè)計(jì)TYR外顯子2-5的引物,引物由上海桑尼生物科技有限公司合成(表1)。

    1.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及程序

    PCR反應(yīng)總體系為25 μL:10×PCR緩沖液

    2.5 μL, dNTP(10 mmol/L)0.5 μL,上下游引物

    (10 pmol/L)各1.2 μL,Taq DNA聚合酶(5 U/μL)

    0.2 μL ,DNA模板(50 ng/μL)1.2 μL,超純水18.2 μL。

    PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,55~60 ℃(表1)退火30 s,72 ℃延伸1 min,進(jìn)行34個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min;12 ℃保存。

    1.4 SSCP檢測(cè)

    取2 μLPCR產(chǎn)物與8 μL上樣緩沖液(95%甲酰胺, 0.25%二甲苯青,0.25%溴酚藍(lán), 20 mmol/L EDTA)混勻,放入沸水煮沸10 min,立即取出冰浴30 min,取混合物于12%的聚丙烯酰胺凝膠180 V電泳18 h后進(jìn)行銀染[17]。

    1.5 DNA測(cè)序與分析

    對(duì)SSCP技術(shù)檢測(cè)出的不同基因型的個(gè)體進(jìn)行擴(kuò)增,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,然后進(jìn)行比對(duì)和拼接,采用DNAMAN 5.0軟件對(duì)略陽(yáng)烏雞TYR基因序列和NCBI公布的雞TYR基因序列進(jìn)行比對(duì)分析。

    2 結(jié)果及分析

    2.1 不同類(lèi)型略陽(yáng)雞TYR基因SSCP檢測(cè)結(jié)果

    雞的TYR序列總長(zhǎng)49 778 bp(NC006088),有5個(gè)外顯子,mRNA全長(zhǎng)1 935 bp,編碼區(qū)為

    1 590 bp,編碼529個(gè)AA。通過(guò)SSCP檢測(cè)所研究群體的遺傳多樣性,發(fā)現(xiàn)在啟動(dòng)子區(qū)有2種基因型AA和BB型;外顯子1的5號(hào)引物檢測(cè)到AA、AB和BB 3種基因型;外顯子1的6號(hào)引物也存在AA、AB和BB 3種基因型。外顯子2、3、4沒(méi)有發(fā)現(xiàn)多態(tài)性,只檢測(cè)到一種基因型。外顯子5的1號(hào)引物有2種基因型(AA、AB型);2號(hào)引物檢測(cè)到3種基因型(AA、AB和 BB型);3號(hào)引物也檢測(cè)到3種基因型(AA、AB和BB型),各基因型在略陽(yáng)雞中的頻率見(jiàn)表2。

    2.2 略陽(yáng)雞群體TYR基因序列變異分析

    對(duì)不同的基因型進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)不同位點(diǎn)各基因型DNA水平的單核苷酸遺傳變異(圖1-9)。以NCBI公布紅色原雞TYR基因序列為參照,采用DNAMAN5.0 軟件對(duì)略陽(yáng)普通雞、略陽(yáng)麻羽烏雞和略陽(yáng)黑羽烏雞TYR部分啟動(dòng)子區(qū)、外顯子區(qū)和部分內(nèi)含子區(qū)進(jìn)行序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)略陽(yáng)烏雞群體中的多數(shù)個(gè)體啟動(dòng)子區(qū)-392和-409位點(diǎn)由G→A(圖1、圖2),外顯子1的第757位點(diǎn)C→T(圖3),第849位點(diǎn)C→T(圖4),外顯子5的第49351位點(diǎn)C→T(圖7),第49567位點(diǎn)A→G(圖8),第49663位點(diǎn)G→C,第49672位點(diǎn)T→A,第49692位點(diǎn)C→G(圖9)。對(duì)略陽(yáng)麻羽烏雞、略陽(yáng)普通雞、略陽(yáng)黑羽烏雞、紅色原雞TYR基因編碼區(qū)進(jìn)行翻譯和比對(duì),發(fā)現(xiàn)在編碼區(qū)第757位點(diǎn)、第849位點(diǎn)、第49351位點(diǎn)3個(gè)堿基存在遺傳變異,但是其中均為同義突變,并不導(dǎo)致氨基酸序列的改變。對(duì)于啟動(dòng)子區(qū)和內(nèi)含子區(qū)的堿基變異是否影響略陽(yáng)雞TYR基因的表達(dá)量,進(jìn)而影響黑色素的形成還有待進(jìn)一步研究。

    3 小結(jié)與討論

    烏雞在表型性狀上與普通雞最明顯的差異是體內(nèi)含有大量黑色素,酪氨酸酶是黑色素合成的關(guān)鍵酶, 其表達(dá)和活性決定著黑色素生成的速度和產(chǎn)量[18]。另有研究發(fā)現(xiàn)黑色素的合成是由多個(gè)基因位點(diǎn)編碼產(chǎn)物共同參與與調(diào)控的級(jí)聯(lián)過(guò)程[19]。Levine[20]提出至少有4個(gè)TYR基因家族成員參與黑色素的合成,由于酪氨酸酶的重要性,編碼酪氨酸酶的基因也就成了研究黑色素性狀和白化病的熱點(diǎn)候選基因。雞的TYR位點(diǎn)是復(fù)等位基因位點(diǎn),雞的第1外顯子6個(gè)核苷酸的缺失導(dǎo)致白化,這些核苷酸編碼天冬氨酸和色氨酸,而這2個(gè)氨基酸從兩棲動(dòng)物到人都是保守的,可見(jiàn)這2個(gè)氨基酸在結(jié)構(gòu)和功能上都起著重要作用[21,22]。目前雞的TYR基因的全序列和控區(qū)序列均已完成測(cè)序,但在不同家禽品種上的研究相對(duì)較少,陳志強(qiáng)等[23]通過(guò)研究明星肉雞與絲羽烏雞的TYR基因5′調(diào)控區(qū)單鏈構(gòu)想多態(tài),發(fā)現(xiàn)調(diào)控區(qū)有3個(gè)SNP,并且這些SNP位點(diǎn)與雞的脛色和膚色顯著相關(guān)。張建勤等[24]、Zhang等[25]采用PCR-SSCP方法,對(duì)中國(guó)寧夏固原雞、海南文昌雞、西藏藏雞和引進(jìn)品種海賽克斯雞TYR基因5′側(cè)翼區(qū)及外顯子1的遺傳變異進(jìn)行了研究。結(jié)果表明中國(guó)地方雞品種的TYR基因蘊(yùn)藏豐富的變異資源。

    烏雞因其體內(nèi)豐富的黑色素沉積而具有很高的營(yíng)養(yǎng)保健功能和重要經(jīng)濟(jì)性狀。略陽(yáng)烏雞是中國(guó)四大烏雞品種之一,現(xiàn)已成功申報(bào)國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品,具有“六端烏”的特性,探索其黑色素形成機(jī)理為略陽(yáng)烏雞進(jìn)一步品系化培育和資源保護(hù)提供了較好的理論基礎(chǔ),也可為烏骨雞和禽類(lèi)黑色素的形成機(jī)制研究提供一定的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。本研究以略陽(yáng)普通雞和麻羽烏雞為對(duì)照,結(jié)合GenBank公布雞的TYR基因序列,分析了23只略陽(yáng)雞TYR基因編碼區(qū)的遺傳變異,分析不同SNP位點(diǎn)與雞的羽色和肉色的關(guān)系。略陽(yáng)普通雞的羽色為麻色,肉色為普通色,麻羽烏雞的羽色為雜色,肉色為黑色,略陽(yáng)黑羽烏雞所有性狀均為黑色。研究發(fā)現(xiàn)TYR基因編碼區(qū)3個(gè)突變位點(diǎn)在略陽(yáng)烏雞群體均有分布,但是突變位點(diǎn)均為同義突變,沒(méi)有造成氨基酸序列的變異,不影響酪氨酸酶的蛋白質(zhì)構(gòu)象和功能。這一結(jié)果與前人研究結(jié)果基本符合,因?yàn)槔野彼崦甘呛谏睾铣傻南匏倜?,一般是高度保守的,如果一些氨基酸序列的變異將影響其功能,可能?dǎo)致白化病等生理現(xiàn)象。由于本研究的略陽(yáng)雞是正常個(gè)體,毛色都有顏色,所以TYR的氨基酸序列沒(méi)有差異是正常的,說(shuō)明略陽(yáng)烏雞和普通雞的TYR基因是高度保守的,但是它們?cè)谀w色和毛色黑色素含量上的差異可能是由另外的基因造成的,也可能是由TYR基因表達(dá)量的差異引起的。本研究另外發(fā)現(xiàn)略陽(yáng)烏雞與普通雞的TYR基因在啟動(dòng)子區(qū)和內(nèi)含子區(qū)的DNA序列存在遺傳差異,這些差異是否與酪氨酸酶的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄剪接有關(guān),進(jìn)而影響烏雞黑色素的沉積還有待進(jìn)一步研究。

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