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    人參皂苷Rb1經(jīng)ERK1/2對(duì)H2O2誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用1)

    2014-07-05 08:24:26任建勛吳紅金王玉祥
    關(guān)鍵詞:乳鼠花青素皂苷

    楊 翠,任建勛,吳紅金,王玉祥

    生理狀態(tài)下,心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生與清除處于穩(wěn)態(tài)平衡。氧化應(yīng)激時(shí),ROS在細(xì)胞內(nèi)過(guò)量蓄積,產(chǎn)生細(xì)胞毒性,造成細(xì)胞功能障礙,最終導(dǎo)致其壞死和凋亡[1]。過(guò)度氧化應(yīng)激導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡明顯增加,在冠心病、心肌梗死、心力衰竭、心肌缺血再灌注損傷等心血管病理過(guò)程中扮演重要角色。抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞壞死和凋亡是防治缺血缺氧性心臟病的有效策略,成為許多中藥活性成分心肌保護(hù)作用研究的切入點(diǎn)[2,3]。人參皂苷Rb1(Ginsenoside Rb1,Gs-Rb1)是從人參中提取出來(lái)的主要活性成分,大量研究表明 Gs-Rb1能減輕心肌缺血再灌注損傷[4,5],然而 Gs-Rb1抗氧化保護(hù)心肌細(xì)胞的確切的分子機(jī)制尚未完全闡明。本研究采用H2O2誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞造成氧化性損傷,探索Gs-Rb1對(duì)氧化應(yīng)激所致細(xì)胞損傷的直接保護(hù)作用,并對(duì)其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 出生24h的SD大鼠乳鼠,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,合格證號(hào):SCXK(京)2012-0001。

    1.1.2 主要試劑 人參皂苷Rb1購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)于Hyclone公司;胰蛋白酶購(gòu)于Amresco公司;膠原酶Ⅱ購(gòu)于Worthington Biochemical公司;MTT購(gòu)于Sigma公司;TUNEL試劑盒購(gòu)于Roche公司;Phospho-p44/p42ERK1/2Antibody購(gòu)于 Cell Signaling Technology公司;H2O2購(gòu)于北京宏盛苑化工有限公司;原花青素購(gòu)自上??稻呕び邢薰?。

    1.1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自SANYO公司;505酶標(biāo)儀購(gòu)自BIO-RAD公司;熒光顯微鏡購(gòu)自O(shè)LYMPUS公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 原代心肌細(xì)胞培養(yǎng) 出生24h內(nèi)的SD大鼠乳鼠,無(wú)菌操作下取心臟并修剪。磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次,在50 mL的離心管中將其剪碎成1mm3~2mm3大小的組織碎塊。隨后用含0.25%胰蛋白酶和0.05%膠原酶Ⅱ的PBS輕柔吹打消化8min,靜置后1min后收集細(xì)胞懸液,放入含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中終止消化;以上過(guò)程反復(fù)進(jìn)行,直至組織塊完全消化。細(xì)胞懸液經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾去除未消化的組織,在4℃時(shí)以1 000r/min離心8min,棄上清,并用10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液重懸。臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞數(shù)至5×106/L。接種到25mL培養(yǎng)瓶中,置37℃培養(yǎng)箱(含95%空氣+5%CO2)中培養(yǎng)1.5h以純化心肌細(xì)胞(差速貼壁法)。接種到12孔或96孔培養(yǎng)板中,每24h觀察細(xì)胞貼壁及生長(zhǎng)情況,并更換培養(yǎng)液。待72h細(xì)胞融合出現(xiàn)搏動(dòng)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.2.2 原代心肌細(xì)胞H2O2損傷模型的建立及分組 上述原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞隨機(jī)分為6組。空白對(duì)照組:37℃孵箱常規(guī)培養(yǎng);模型組:加入終濃度為100μmol/L H2O2,37℃孵箱培養(yǎng);陽(yáng)性對(duì)照組:在加入終濃度為100μmol/L原花青素2h后,加入與模型組等量的 H2O2,37℃孵箱培養(yǎng);Gs-Rb1低、中、高劑量組分別在加入50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L Gs-Rb1 2h后,加入與模型組等量的H2O2,37℃孵箱培養(yǎng)。

    1.2.3 MMT法檢測(cè)細(xì)胞活性 各組加入H2O2后18h采用MMT法檢測(cè)細(xì)胞活力。棄去細(xì)胞培養(yǎng)液,PBS沖洗后每孔加入 MTT 20μL(0.5mg/mL),置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h,吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后,加入DMSO 150μL/孔,將培養(yǎng)板置于微孔板震蕩器上振蕩10min,充分溶解,酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔吸光度值(OD)。

    1.2.4 心肌細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 各組加入H2O2后18h,吸取培養(yǎng)基,PBS沖洗3次,4%多聚甲醛固定。經(jīng)0.2%Triton-X-100液通透處理,加rTdT酶、核苷混合物的混合液37℃避光孵育1 h后終止反應(yīng),PBS沖洗后在熒光顯微鏡下采用綠色熒光進(jìn)行觀察和分析,對(duì)同一片取5個(gè)不同視野計(jì)數(shù)所有細(xì)胞和凋亡細(xì)胞,計(jì)算凋亡率。凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

    1.2.5 心肌細(xì)胞ERK1/2磷酸化水平檢測(cè) 各組加入H2O220min后,采用 Western blot進(jìn)行ERK1/2蛋白磷酸化檢測(cè)。棄去培養(yǎng)基后預(yù)冷的PBS沖洗3次,加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液于冰上充分裂解,提取總蛋白并用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。所有不同組蛋白樣本分別加入上樣緩沖液后煮沸5min變性,蛋白進(jìn)行12%SDS-PAGE凝膠電泳分離后采用濕法轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%牛血清白蛋白室溫封閉1h,加入磷酸化特異性單克隆ERK1/2抗體孵育、4℃過(guò)夜、TBST洗滌3次(每次10 min)后加入二抗孵育,室溫孵育2h;TBST洗滌3次(每次10 min)后加入ECL處理、X線膠片曝光、顯影及定影。采用IPP 6.0進(jìn)行灰度分析,以p-ERK1/2蛋白條帶灰度值與t-ERK1/2蛋白條帶灰度值比值反映ERK1/2磷酸化的程度。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,采用One-Way ANOVA(單因素方差分析)方法,方差齊性應(yīng)用Student-Newman-Keuls檢驗(yàn),方差不齊采用Tamhane’sT2檢驗(yàn)。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 各組心肌細(xì)胞活性的比較 與空白對(duì)照組比較,模型組心肌細(xì)胞活力明顯下降(P<0.05);與模型組比較,原花青素組以及Gs-Rb1低、中、高劑量組心肌細(xì)胞活力明顯提高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。詳見(jiàn)表1。

    2.2 各組心肌細(xì)胞凋亡率的比較 與空白對(duì)照組比較,模型組心肌細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.01);與模型組比較,原花青素組以及Gs-Rb1低、中、高劑量組心肌細(xì)胞凋亡率明顯下降,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。詳見(jiàn)表1。

    表1 各組乳鼠心肌細(xì)胞活力和凋亡率變化(x±s)

    2.3 各組心肌細(xì)胞ERK1/2蛋白磷酸化水平的比較 與空白對(duì)照組比較,模型組心肌細(xì)胞p-ERK1/2表達(dá)明顯減少(P<0.01);與模型組比較,原花青素組以及Gs-Rb1高劑量組心肌細(xì)胞p-ERK1/2表達(dá)則顯著增加(P<0.05)。詳見(jiàn)圖1、表2。

    圖1 Gs-Rb1對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響

    表2 各組乳鼠心肌細(xì)胞p-ERK1/2蛋白表達(dá)的變化(x±s)

    3 討 論

    細(xì)胞凋亡,又稱程序性細(xì)胞死亡,是一種嚴(yán)格受基因調(diào)控的細(xì)胞自主性死亡,參與著機(jī)體多種病理生理過(guò)程。氧化應(yīng)激是心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡的重要介導(dǎo)因素,心肌缺血、缺氧時(shí),大量?jī)?nèi)源性ROS在心肌細(xì)胞內(nèi)發(fā)生蓄積,通過(guò)特殊的信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[1,6]。本研究采用H2O2作為外源性ROS作用于心肌細(xì)胞,MTT法和TUNEL法檢測(cè)結(jié)果顯示,H2O2成功造成心肌細(xì)胞氧化損傷,誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

    一些特定的信號(hào)通路參與氧化應(yīng)激所致的心肌細(xì)胞損傷與凋亡,絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號(hào)通路是其中重要的一條,而細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)是 MAPK家族的重要組成部分,精細(xì)調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、存活及凋亡[7]。目前認(rèn)為對(duì)于ERK磷酸化的調(diào)節(jié)是干預(yù)心肌細(xì)胞在缺血缺氧條件下凋亡的重要途徑。研究發(fā)現(xiàn),中藥成分丹參素對(duì)缺氧所致的心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用,其機(jī)制可能與激活ERK1/2途徑而抑制心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)[8]。α-硫辛酸能增加ERK1/2磷酸化水平對(duì)葡萄糖/葡萄糖氧化酶誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷有保護(hù)作用,而使用ERK1/2抑制劑后,該保護(hù)作用消失[9]。此外,瘦素可能通過(guò)活化ERK1/2通路抑制H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡[10]。

    現(xiàn)代藥理研究表明人參多種活性成分具有抗心肌細(xì)胞凋亡、清除氧自由基、改善心肌能量代謝和增加心肌收縮力等廣泛的心血管調(diào)節(jié)作用。前期研究發(fā)現(xiàn)[11,12],人參皂苷Re和人參皂苷Rg1均能抑制60Co照射誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡,ERK、JNK和p38MAPK通路可能參與介導(dǎo)這種心肌細(xì)胞保護(hù)作用。Gs-Rb1作為人參的又一主要活性成分,研究顯示其具有顯著的抗心肌缺血再灌注損傷作用,可能與其上調(diào)eNOS表達(dá),抑制自由基對(duì)心肌組織的氧化損傷有關(guān)[4]。同時(shí),Gs-Rb1可能通過(guò)抗脂質(zhì)過(guò)氧化與減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載抑制H2O2誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡[13]。還有研究發(fā)現(xiàn)Gs-Rb1通過(guò)穩(wěn)定線粒體膜電位而發(fā)揮抗心肌細(xì)胞凋亡作用[14]。另有實(shí)驗(yàn)證明[15],Gs-Rb1能清除ROS,抑制ROS誘導(dǎo)的JNK通路的激活,從而產(chǎn)生心肌細(xì)胞保護(hù)作用。然而,Gs-Rb1是否通過(guò)ERK1/2途徑而減輕氧化應(yīng)激對(duì)心肌細(xì)胞的損傷還不得而知,本研究主要以ERK途徑為切入點(diǎn),細(xì)胞、分子兩個(gè)層面來(lái)探討Gs-Rb1對(duì)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。原花青素作為一種強(qiáng)抗氧化劑,具有較強(qiáng)的清除氧自由基作用,被我們選用作為陽(yáng)性藥物對(duì)照組。本研究結(jié)果表明,原花青素及低、中、高劑量的Gs-Rb1均可抑制H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷和凋亡。進(jìn)一步研究顯示,與空白對(duì)照組相比,H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷組心肌細(xì)胞的p-ERK1/2表達(dá)下調(diào),原花青素組和高劑量Gs-Rb1可通過(guò)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞p-ERK1/2表達(dá)增加的途徑對(duì)抗H2O2引起的細(xì)胞氧化損傷和凋亡。

    綜上所述,H2O2可誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞損傷和凋亡,而Gs-Rb1能減輕這種細(xì)胞損傷而具有心肌細(xì)胞保護(hù)作用,其作用機(jī)制可能與激活ERK信號(hào)通路相關(guān)。然而,Gs-Rb1介導(dǎo)的這種心肌保護(hù)作用是否與其他信號(hào)通路相關(guān),其確切的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究證明。

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