• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    人參皂苷Rb1經(jīng)ERK1/2對(duì)H2O2誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用1)

    2014-07-05 08:24:26任建勛吳紅金王玉祥
    關(guān)鍵詞:乳鼠花青素皂苷

    楊 翠,任建勛,吳紅金,王玉祥

    生理狀態(tài)下,心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生與清除處于穩(wěn)態(tài)平衡。氧化應(yīng)激時(shí),ROS在細(xì)胞內(nèi)過(guò)量蓄積,產(chǎn)生細(xì)胞毒性,造成細(xì)胞功能障礙,最終導(dǎo)致其壞死和凋亡[1]。過(guò)度氧化應(yīng)激導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡明顯增加,在冠心病、心肌梗死、心力衰竭、心肌缺血再灌注損傷等心血管病理過(guò)程中扮演重要角色。抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞壞死和凋亡是防治缺血缺氧性心臟病的有效策略,成為許多中藥活性成分心肌保護(hù)作用研究的切入點(diǎn)[2,3]。人參皂苷Rb1(Ginsenoside Rb1,Gs-Rb1)是從人參中提取出來(lái)的主要活性成分,大量研究表明 Gs-Rb1能減輕心肌缺血再灌注損傷[4,5],然而 Gs-Rb1抗氧化保護(hù)心肌細(xì)胞的確切的分子機(jī)制尚未完全闡明。本研究采用H2O2誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞造成氧化性損傷,探索Gs-Rb1對(duì)氧化應(yīng)激所致細(xì)胞損傷的直接保護(hù)作用,并對(duì)其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 出生24h的SD大鼠乳鼠,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,合格證號(hào):SCXK(京)2012-0001。

    1.1.2 主要試劑 人參皂苷Rb1購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)于Hyclone公司;胰蛋白酶購(gòu)于Amresco公司;膠原酶Ⅱ購(gòu)于Worthington Biochemical公司;MTT購(gòu)于Sigma公司;TUNEL試劑盒購(gòu)于Roche公司;Phospho-p44/p42ERK1/2Antibody購(gòu)于 Cell Signaling Technology公司;H2O2購(gòu)于北京宏盛苑化工有限公司;原花青素購(gòu)自上??稻呕び邢薰?。

    1.1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自SANYO公司;505酶標(biāo)儀購(gòu)自BIO-RAD公司;熒光顯微鏡購(gòu)自O(shè)LYMPUS公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 原代心肌細(xì)胞培養(yǎng) 出生24h內(nèi)的SD大鼠乳鼠,無(wú)菌操作下取心臟并修剪。磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次,在50 mL的離心管中將其剪碎成1mm3~2mm3大小的組織碎塊。隨后用含0.25%胰蛋白酶和0.05%膠原酶Ⅱ的PBS輕柔吹打消化8min,靜置后1min后收集細(xì)胞懸液,放入含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中終止消化;以上過(guò)程反復(fù)進(jìn)行,直至組織塊完全消化。細(xì)胞懸液經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾去除未消化的組織,在4℃時(shí)以1 000r/min離心8min,棄上清,并用10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液重懸。臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞數(shù)至5×106/L。接種到25mL培養(yǎng)瓶中,置37℃培養(yǎng)箱(含95%空氣+5%CO2)中培養(yǎng)1.5h以純化心肌細(xì)胞(差速貼壁法)。接種到12孔或96孔培養(yǎng)板中,每24h觀察細(xì)胞貼壁及生長(zhǎng)情況,并更換培養(yǎng)液。待72h細(xì)胞融合出現(xiàn)搏動(dòng)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.2.2 原代心肌細(xì)胞H2O2損傷模型的建立及分組 上述原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞隨機(jī)分為6組。空白對(duì)照組:37℃孵箱常規(guī)培養(yǎng);模型組:加入終濃度為100μmol/L H2O2,37℃孵箱培養(yǎng);陽(yáng)性對(duì)照組:在加入終濃度為100μmol/L原花青素2h后,加入與模型組等量的 H2O2,37℃孵箱培養(yǎng);Gs-Rb1低、中、高劑量組分別在加入50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L Gs-Rb1 2h后,加入與模型組等量的H2O2,37℃孵箱培養(yǎng)。

    1.2.3 MMT法檢測(cè)細(xì)胞活性 各組加入H2O2后18h采用MMT法檢測(cè)細(xì)胞活力。棄去細(xì)胞培養(yǎng)液,PBS沖洗后每孔加入 MTT 20μL(0.5mg/mL),置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h,吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后,加入DMSO 150μL/孔,將培養(yǎng)板置于微孔板震蕩器上振蕩10min,充分溶解,酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔吸光度值(OD)。

    1.2.4 心肌細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 各組加入H2O2后18h,吸取培養(yǎng)基,PBS沖洗3次,4%多聚甲醛固定。經(jīng)0.2%Triton-X-100液通透處理,加rTdT酶、核苷混合物的混合液37℃避光孵育1 h后終止反應(yīng),PBS沖洗后在熒光顯微鏡下采用綠色熒光進(jìn)行觀察和分析,對(duì)同一片取5個(gè)不同視野計(jì)數(shù)所有細(xì)胞和凋亡細(xì)胞,計(jì)算凋亡率。凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

    1.2.5 心肌細(xì)胞ERK1/2磷酸化水平檢測(cè) 各組加入H2O220min后,采用 Western blot進(jìn)行ERK1/2蛋白磷酸化檢測(cè)。棄去培養(yǎng)基后預(yù)冷的PBS沖洗3次,加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液于冰上充分裂解,提取總蛋白并用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。所有不同組蛋白樣本分別加入上樣緩沖液后煮沸5min變性,蛋白進(jìn)行12%SDS-PAGE凝膠電泳分離后采用濕法轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%牛血清白蛋白室溫封閉1h,加入磷酸化特異性單克隆ERK1/2抗體孵育、4℃過(guò)夜、TBST洗滌3次(每次10 min)后加入二抗孵育,室溫孵育2h;TBST洗滌3次(每次10 min)后加入ECL處理、X線膠片曝光、顯影及定影。采用IPP 6.0進(jìn)行灰度分析,以p-ERK1/2蛋白條帶灰度值與t-ERK1/2蛋白條帶灰度值比值反映ERK1/2磷酸化的程度。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,采用One-Way ANOVA(單因素方差分析)方法,方差齊性應(yīng)用Student-Newman-Keuls檢驗(yàn),方差不齊采用Tamhane’sT2檢驗(yàn)。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 各組心肌細(xì)胞活性的比較 與空白對(duì)照組比較,模型組心肌細(xì)胞活力明顯下降(P<0.05);與模型組比較,原花青素組以及Gs-Rb1低、中、高劑量組心肌細(xì)胞活力明顯提高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。詳見(jiàn)表1。

    2.2 各組心肌細(xì)胞凋亡率的比較 與空白對(duì)照組比較,模型組心肌細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.01);與模型組比較,原花青素組以及Gs-Rb1低、中、高劑量組心肌細(xì)胞凋亡率明顯下降,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。詳見(jiàn)表1。

    表1 各組乳鼠心肌細(xì)胞活力和凋亡率變化(x±s)

    2.3 各組心肌細(xì)胞ERK1/2蛋白磷酸化水平的比較 與空白對(duì)照組比較,模型組心肌細(xì)胞p-ERK1/2表達(dá)明顯減少(P<0.01);與模型組比較,原花青素組以及Gs-Rb1高劑量組心肌細(xì)胞p-ERK1/2表達(dá)則顯著增加(P<0.05)。詳見(jiàn)圖1、表2。

    圖1 Gs-Rb1對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響

    表2 各組乳鼠心肌細(xì)胞p-ERK1/2蛋白表達(dá)的變化(x±s)

    3 討 論

    細(xì)胞凋亡,又稱程序性細(xì)胞死亡,是一種嚴(yán)格受基因調(diào)控的細(xì)胞自主性死亡,參與著機(jī)體多種病理生理過(guò)程。氧化應(yīng)激是心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡的重要介導(dǎo)因素,心肌缺血、缺氧時(shí),大量?jī)?nèi)源性ROS在心肌細(xì)胞內(nèi)發(fā)生蓄積,通過(guò)特殊的信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[1,6]。本研究采用H2O2作為外源性ROS作用于心肌細(xì)胞,MTT法和TUNEL法檢測(cè)結(jié)果顯示,H2O2成功造成心肌細(xì)胞氧化損傷,誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

    一些特定的信號(hào)通路參與氧化應(yīng)激所致的心肌細(xì)胞損傷與凋亡,絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號(hào)通路是其中重要的一條,而細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)是 MAPK家族的重要組成部分,精細(xì)調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、存活及凋亡[7]。目前認(rèn)為對(duì)于ERK磷酸化的調(diào)節(jié)是干預(yù)心肌細(xì)胞在缺血缺氧條件下凋亡的重要途徑。研究發(fā)現(xiàn),中藥成分丹參素對(duì)缺氧所致的心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用,其機(jī)制可能與激活ERK1/2途徑而抑制心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)[8]。α-硫辛酸能增加ERK1/2磷酸化水平對(duì)葡萄糖/葡萄糖氧化酶誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷有保護(hù)作用,而使用ERK1/2抑制劑后,該保護(hù)作用消失[9]。此外,瘦素可能通過(guò)活化ERK1/2通路抑制H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡[10]。

    現(xiàn)代藥理研究表明人參多種活性成分具有抗心肌細(xì)胞凋亡、清除氧自由基、改善心肌能量代謝和增加心肌收縮力等廣泛的心血管調(diào)節(jié)作用。前期研究發(fā)現(xiàn)[11,12],人參皂苷Re和人參皂苷Rg1均能抑制60Co照射誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡,ERK、JNK和p38MAPK通路可能參與介導(dǎo)這種心肌細(xì)胞保護(hù)作用。Gs-Rb1作為人參的又一主要活性成分,研究顯示其具有顯著的抗心肌缺血再灌注損傷作用,可能與其上調(diào)eNOS表達(dá),抑制自由基對(duì)心肌組織的氧化損傷有關(guān)[4]。同時(shí),Gs-Rb1可能通過(guò)抗脂質(zhì)過(guò)氧化與減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載抑制H2O2誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡[13]。還有研究發(fā)現(xiàn)Gs-Rb1通過(guò)穩(wěn)定線粒體膜電位而發(fā)揮抗心肌細(xì)胞凋亡作用[14]。另有實(shí)驗(yàn)證明[15],Gs-Rb1能清除ROS,抑制ROS誘導(dǎo)的JNK通路的激活,從而產(chǎn)生心肌細(xì)胞保護(hù)作用。然而,Gs-Rb1是否通過(guò)ERK1/2途徑而減輕氧化應(yīng)激對(duì)心肌細(xì)胞的損傷還不得而知,本研究主要以ERK途徑為切入點(diǎn),細(xì)胞、分子兩個(gè)層面來(lái)探討Gs-Rb1對(duì)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。原花青素作為一種強(qiáng)抗氧化劑,具有較強(qiáng)的清除氧自由基作用,被我們選用作為陽(yáng)性藥物對(duì)照組。本研究結(jié)果表明,原花青素及低、中、高劑量的Gs-Rb1均可抑制H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷和凋亡。進(jìn)一步研究顯示,與空白對(duì)照組相比,H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷組心肌細(xì)胞的p-ERK1/2表達(dá)下調(diào),原花青素組和高劑量Gs-Rb1可通過(guò)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞p-ERK1/2表達(dá)增加的途徑對(duì)抗H2O2引起的細(xì)胞氧化損傷和凋亡。

    綜上所述,H2O2可誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞損傷和凋亡,而Gs-Rb1能減輕這種細(xì)胞損傷而具有心肌細(xì)胞保護(hù)作用,其作用機(jī)制可能與激活ERK信號(hào)通路相關(guān)。然而,Gs-Rb1介導(dǎo)的這種心肌保護(hù)作用是否與其他信號(hào)通路相關(guān),其確切的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究證明。

    [1] Giordano FJ.Oxygen,oxidative stress,hypoxia,and heart failure[J].J Clin Invest,2005,115(3):500-508.

    [2] Zhu XY,Zhang ZL,Li P,et al.Shenyuan,an extract of American Ginseng and Corydalis Tuber formula,attenuates cardiomyocyte apoptosis via inhibition of endoplasmic reticulum stress and oxidative stress in a porcine model of acute myocardial infarction[J].J Ethnopharmacol,2013,150(2):672-681.

    [3] Wang XL,Wang X,Xiong LL,et al.Salidroside improves doxorubicin-induced cardiac dysfunction by suppression of excessive oxidative stress and cardiomyocyte apoptosis:Doxorubicin cardiotoxicity inhibited by salidroside[J].J Cardiovasc Pharmacol,2013,62(6):512-523.

    [4] 陳紅霞.人參皂苷Rb1對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].湖北科技學(xué)院學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2012,26(6):465-467.

    [5] Wang Z,Li M,Wu WK,et al.Ginsenoside Rb1preconditioning protects against myocardial infarction after regional ischemia and reperfusion by activation of phosphatidylinositol-3-kinase signal transduction[J].Cardiovasc Drugs Ther,2008,22(6):443-452.

    [6] von Harsdorf R,Li PF,Dietz R.Signaling pathways in reactive oxygen species-induced cardiomyocyte apoptosis[J].Circulation,1999,99(22):2934-2941.

    [7] Yoon S,Seger R.The extracellular signal-regulated kinase:multiple substrates regulate diverse cellular functions[J].Growth Factors,2006,24(1):21-44.

    [8] Yin Y,Guan Y,Duan J,et al.Cardioprotective effect of Danshensu against myocardial ischemia/reperfusion injury and inhibits apoptosis of H9c2cardiomyocytes via Akt and ERK1/2phosphorylation[J].Eur J Pharmacol,2013,699(1-3):219-226.

    [9] 張陽(yáng)陽(yáng),姚玉珍,李榮榮,等.α-硫辛酸通過(guò)激活ERK1/2減輕葡萄糖/葡萄糖氧化酶所致心肌細(xì)胞損傷[J].實(shí)用老年醫(yī)學(xué),2013,27(7):547-550.

    [10] 潘喆,李曉博,孫愛(ài)麗,等.瘦素抑制H2O2誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡[J].中國(guó)病理生理雜志,2010,26(9):1704-1707.

    [11] 吳紅金,劉宇娜.人參皂甙Re對(duì)60Co照射誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2008,6(8):923-924.

    [12] 吳紅金,劉宇娜.人參皂甙Rg1抑制60Co照射誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡[J].醫(yī)學(xué)綜述,2008,14(21):3332-3334.

    [13] 許浩,葛亞坤,鄧同樂(lè),等.人參皂苷Rb1對(duì)H2O2誘導(dǎo)新生大鼠心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2005,21(7):803-806.

    [14] 文飛,張帆,冷沁.人參皂苷Rb1對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用[J].湖北中醫(yī)雜志,2010,32(7):5-7.

    [15] Li J,Shao ZH,Xie JT,et al.The effects of ginsenoside Rb1on JNK in oxidative injury in cardiomyocytes[J].Arch Pharm Res,2012,35(7):1259-1267.

    猜你喜歡
    乳鼠花青素皂苷
    漢防己甲素對(duì)先天性巨結(jié)腸乳鼠炎癥的改善作用及對(duì)JAK2/STAT3通路的影響
    改良無(wú)血清法培養(yǎng)新生SD乳鼠原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞
    原花青素B2通過(guò)Akt/FoxO4通路拮抗內(nèi)皮細(xì)胞衰老的實(shí)驗(yàn)研究
    HPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定三七花總皂苷中2種成分
    中成藥(2018年9期)2018-10-09 07:19:04
    HPLC法測(cè)定大鼠皮膚中三七皂苷R1和人參皂苷Rb1
    中成藥(2017年9期)2017-12-19 13:34:40
    花青素對(duì)非小細(xì)胞肺癌組織細(xì)胞GST-π表達(dá)的影響
    中成藥(2017年5期)2017-06-13 13:01:12
    HPLC法同時(shí)測(cè)定熟三七散中13種皂苷
    中成藥(2017年6期)2017-06-13 07:30:34
    山楸梅漿果中花青素提取方法的優(yōu)化和測(cè)定
    中成藥(2016年8期)2016-05-17 06:08:41
    苦參素對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷乳鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響
    原花青素對(duì)腦缺血再灌注損傷后腸道功能的保護(hù)作用
    欧美一区二区国产精品久久精品 | 日本五十路高清| aaaaa片日本免费| 国内揄拍国产精品人妻在线| 91老司机精品| 亚洲精华国产精华精| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 欧美一级毛片孕妇| 国产av在哪里看| 日韩欧美在线乱码| 亚洲第一电影网av| 久热爱精品视频在线9| 不卡av一区二区三区| 男男h啪啪无遮挡| 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚洲午夜理论影院| 欧美成人免费av一区二区三区| 日韩有码中文字幕| 久久九九热精品免费| 亚洲精品久久国产高清桃花| 十八禁人妻一区二区| 91国产中文字幕| 国产av又大| 啦啦啦韩国在线观看视频| 少妇被粗大的猛进出69影院| 亚洲激情在线av| 国产成人系列免费观看| 国产野战对白在线观看| 久久久久亚洲av毛片大全| 国产男靠女视频免费网站| 亚洲电影在线观看av| 国产99白浆流出| 少妇粗大呻吟视频| 亚洲专区国产一区二区| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 日本熟妇午夜| 久久 成人 亚洲| 欧美最黄视频在线播放免费| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 99久久国产精品久久久| 国产亚洲av嫩草精品影院| 精品久久久久久久末码| 亚洲一码二码三码区别大吗| 狠狠狠狠99中文字幕| 一夜夜www| 久久久久久久精品吃奶| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 一区福利在线观看| 亚洲美女视频黄频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 一级毛片精品| 午夜久久久久精精品| 欧美中文综合在线视频| 亚洲成av人片免费观看| 国产精品电影一区二区三区| 欧美成狂野欧美在线观看| videosex国产| 国产又色又爽无遮挡免费看| 此物有八面人人有两片| 久久婷婷成人综合色麻豆| 国产精品免费视频内射| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 午夜日韩欧美国产| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲 欧美一区二区三区| 99热这里只有是精品50| 高清在线国产一区| 首页视频小说图片口味搜索| a在线观看视频网站| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 丰满人妻一区二区三区视频av | 哪里可以看免费的av片| 搞女人的毛片| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲av成人一区二区三| 九色国产91popny在线| 久久久久性生活片| 国产成人aa在线观看| 麻豆av在线久日| 久久久国产精品麻豆| 亚洲18禁久久av| 亚洲激情在线av| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产亚洲精品第一综合不卡| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 人人妻人人澡欧美一区二区| 999久久久国产精品视频| 亚洲一区二区三区色噜噜| 亚洲精品在线美女| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 国产精品1区2区在线观看.| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲人成网站高清观看| 操出白浆在线播放| av片东京热男人的天堂| 性欧美人与动物交配| 无人区码免费观看不卡| 香蕉国产在线看| 大型av网站在线播放| 日韩欧美免费精品| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 久久久国产精品麻豆| av在线天堂中文字幕| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 中文字幕熟女人妻在线| 香蕉丝袜av| av视频在线观看入口| 一本久久中文字幕| 在线观看日韩欧美| 又爽又黄无遮挡网站| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 久久国产精品人妻蜜桃| 窝窝影院91人妻| 不卡av一区二区三区| 亚洲成人免费电影在线观看| 97碰自拍视频| 成人三级黄色视频| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 亚洲国产欧美人成| 欧美黑人巨大hd| x7x7x7水蜜桃| 正在播放国产对白刺激| 欧美日韩国产亚洲二区| 成人欧美大片| www日本在线高清视频| 久久婷婷成人综合色麻豆| 国产不卡一卡二| 男女床上黄色一级片免费看| 日韩欧美免费精品| 最近在线观看免费完整版| 欧美3d第一页| 黄色a级毛片大全视频| 国产高清videossex| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 国内精品久久久久精免费| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 男女那种视频在线观看| 精品国产乱子伦一区二区三区| 国产精品亚洲美女久久久| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 日韩欧美在线乱码| 一级毛片精品| 亚洲 欧美一区二区三区| 成人一区二区视频在线观看| 成人一区二区视频在线观看| 老司机深夜福利视频在线观看| 国产精品国产高清国产av| 精品福利观看| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 免费在线观看影片大全网站| 少妇人妻一区二区三区视频| 色噜噜av男人的天堂激情| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产一区二区激情短视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 国产精品爽爽va在线观看网站| 免费观看人在逋| 免费人成视频x8x8入口观看| 色播亚洲综合网| 午夜免费激情av| 日韩有码中文字幕| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 在线播放国产精品三级| 可以在线观看毛片的网站| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 一级黄色大片毛片| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 99久久精品热视频| 男女床上黄色一级片免费看| av在线天堂中文字幕| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 欧美成狂野欧美在线观看| 欧美中文日本在线观看视频| 婷婷精品国产亚洲av| 国内揄拍国产精品人妻在线| 黄片大片在线免费观看| 欧美最黄视频在线播放免费| 午夜免费成人在线视频| 国产成人精品久久二区二区91| 亚洲欧美精品综合久久99| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 88av欧美| 在线看三级毛片| 青草久久国产| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 久久久久久免费高清国产稀缺| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲专区国产一区二区| 久久婷婷成人综合色麻豆| 最好的美女福利视频网| 黄色女人牲交| 天天添夜夜摸| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国产伦一二天堂av在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 国产一级毛片七仙女欲春2| 国产午夜福利久久久久久| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲专区中文字幕在线| 亚洲熟女毛片儿| 午夜福利在线观看吧| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 99久久综合精品五月天人人| 日韩有码中文字幕| xxxwww97欧美| 日本一本二区三区精品| 亚洲av成人精品一区久久| 国内精品久久久久精免费| 搞女人的毛片| 亚洲片人在线观看| 欧美乱妇无乱码| 久久 成人 亚洲| 人人妻人人澡欧美一区二区| 欧美黑人巨大hd| 最近最新中文字幕大全电影3| 国产精品久久久久久久电影 | 欧美+亚洲+日韩+国产| 丝袜美腿诱惑在线| 黄色丝袜av网址大全| 日本黄大片高清| 国产一区二区在线av高清观看| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产伦一二天堂av在线观看| 99re在线观看精品视频| 黄频高清免费视频| 特大巨黑吊av在线直播| 一级黄色大片毛片| 久久久精品欧美日韩精品| 成年免费大片在线观看| 日韩精品中文字幕看吧| 国产精品免费一区二区三区在线| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 99国产精品一区二区三区| 国产又色又爽无遮挡免费看| 久99久视频精品免费| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 久久久国产欧美日韩av| 男女视频在线观看网站免费 | 国产黄a三级三级三级人| 午夜精品久久久久久毛片777| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 91九色精品人成在线观看| 无遮挡黄片免费观看| av超薄肉色丝袜交足视频| 午夜久久久久精精品| 一进一出抽搐gif免费好疼| 90打野战视频偷拍视频| 欧美中文日本在线观看视频| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 最好的美女福利视频网| 18美女黄网站色大片免费观看| 日韩欧美国产在线观看| 日本免费一区二区三区高清不卡| 最近最新中文字幕大全免费视频| 精品欧美一区二区三区在线| 天堂av国产一区二区熟女人妻 | av超薄肉色丝袜交足视频| 高清在线国产一区| 午夜福利在线在线| 老鸭窝网址在线观看| 伦理电影免费视频| 日韩免费av在线播放| 黄频高清免费视频| 午夜福利成人在线免费观看| 岛国在线观看网站| 午夜福利在线在线| 欧美zozozo另类| bbb黄色大片| 最新美女视频免费是黄的| av福利片在线观看| 国产三级黄色录像| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲av五月六月丁香网| 欧美久久黑人一区二区| 18禁国产床啪视频网站| 搞女人的毛片| 久热爱精品视频在线9| 亚洲国产欧美网| 国产乱人伦免费视频| 国产爱豆传媒在线观看 | 男插女下体视频免费在线播放| www.精华液| 可以在线观看毛片的网站| 国产一区二区三区视频了| 村上凉子中文字幕在线| 国产三级黄色录像| 三级毛片av免费| 中文字幕av在线有码专区| 好男人电影高清在线观看| 久久精品影院6| 久久精品成人免费网站| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产欧美日韩一区二区三| 久久久水蜜桃国产精品网| 欧美日韩黄片免| 亚洲片人在线观看| 一夜夜www| 91麻豆av在线| 国产成+人综合+亚洲专区| 日本免费一区二区三区高清不卡| 深夜精品福利| 久久久久国内视频| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 成人国产综合亚洲| 色在线成人网| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 99久久无色码亚洲精品果冻| 桃红色精品国产亚洲av| 老司机福利观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 国内精品一区二区在线观看| 欧美国产日韩亚洲一区| 日日爽夜夜爽网站| 精品不卡国产一区二区三区| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产亚洲精品av在线| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲色图av天堂| 日韩大码丰满熟妇| 午夜老司机福利片| 欧美色视频一区免费| 成人亚洲精品av一区二区| 久久久精品大字幕| 9191精品国产免费久久| 久久精品人妻少妇| 国产91精品成人一区二区三区| 不卡一级毛片| 黄色视频不卡| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 欧美日韩国产亚洲二区| 欧美+亚洲+日韩+国产| 色综合站精品国产| www.www免费av| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 全区人妻精品视频| 国产一级毛片七仙女欲春2| 免费在线观看完整版高清| 成人午夜高清在线视频| 人妻久久中文字幕网| 岛国在线观看网站| 精品人妻1区二区| 大型av网站在线播放| 美女扒开内裤让男人捅视频| 韩国av一区二区三区四区| 精品人妻1区二区| 黄频高清免费视频| 欧美一级毛片孕妇| 激情在线观看视频在线高清| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 九色成人免费人妻av| 精品无人区乱码1区二区| 国产亚洲精品av在线| 99re在线观看精品视频| 又大又爽又粗| 美女扒开内裤让男人捅视频| 亚洲一区中文字幕在线| 国产91精品成人一区二区三区| 欧美日韩福利视频一区二区| 香蕉久久夜色| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 青草久久国产| 国产成人精品久久二区二区免费| ponron亚洲| 日韩欧美免费精品| 高清在线国产一区| 999久久久国产精品视频| 我要搜黄色片| 国产人伦9x9x在线观看| 12—13女人毛片做爰片一| 丝袜美腿诱惑在线| 精品久久蜜臀av无| 成人永久免费在线观看视频| 色噜噜av男人的天堂激情| 一本久久中文字幕| 天堂√8在线中文| 色老头精品视频在线观看| 熟女电影av网| 国产男靠女视频免费网站| 久久中文字幕一级| 欧美一级毛片孕妇| 国产精品久久久久久久电影 | 国产成人欧美在线观看| 性欧美人与动物交配| 欧美乱色亚洲激情| 人人妻人人澡欧美一区二区| www日本黄色视频网| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产免费av片在线观看野外av| 99riav亚洲国产免费| 国产亚洲欧美98| 99国产综合亚洲精品| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 成人精品一区二区免费| 最好的美女福利视频网| 国产成人精品无人区| 欧美午夜高清在线| 色综合站精品国产| 99久久综合精品五月天人人| 在线国产一区二区在线| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 91在线观看av| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 午夜福利在线观看吧| 91在线观看av| 五月玫瑰六月丁香| 日本 欧美在线| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 黄色 视频免费看| 午夜a级毛片| 俺也久久电影网| 欧美日本视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产亚洲av嫩草精品影院| 日本三级黄在线观看| 丰满的人妻完整版| 日韩大码丰满熟妇| 脱女人内裤的视频| 99re在线观看精品视频| 久久午夜亚洲精品久久| 成人欧美大片| aaaaa片日本免费| 国产亚洲精品一区二区www| 久久久久性生活片| 亚洲午夜理论影院| 亚洲精品在线观看二区| 国产成人精品无人区| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲五月天丁香| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲欧美日韩无卡精品| 美女 人体艺术 gogo| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国产成人av教育| 成人av一区二区三区在线看| 成人av在线播放网站| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 麻豆成人午夜福利视频| 少妇粗大呻吟视频| 在线观看免费午夜福利视频| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲专区字幕在线| 最近最新中文字幕大全免费视频| 手机成人av网站| 男女视频在线观看网站免费 | 90打野战视频偷拍视频| 国产亚洲精品av在线| av有码第一页| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 欧美一区二区国产精品久久精品 | 亚洲激情在线av| 亚洲天堂国产精品一区在线| 亚洲片人在线观看| 精品一区二区三区四区五区乱码| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 国产av一区在线观看免费| 午夜福利高清视频| 午夜亚洲福利在线播放| 色尼玛亚洲综合影院| 波多野结衣高清无吗| 中国美女看黄片| 国产亚洲精品一区二区www| 亚洲欧美日韩无卡精品| 午夜福利免费观看在线| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 精品久久久久久久久久久久久| 亚洲欧美日韩东京热| 成人三级黄色视频| av福利片在线| 午夜两性在线视频| 成人午夜高清在线视频| 国产亚洲精品av在线| 88av欧美| 国产精品永久免费网站| 久久久国产欧美日韩av| 黄色片一级片一级黄色片| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 欧美成人性av电影在线观看| 亚洲成av人片在线播放无| 美女黄网站色视频| 国产激情久久老熟女| 人人妻人人澡欧美一区二区| 在线观看日韩欧美| 午夜两性在线视频| 欧美zozozo另类| 在线国产一区二区在线| 亚洲av成人av| 欧美另类亚洲清纯唯美| 2021天堂中文幕一二区在线观| 男人的好看免费观看在线视频 | av国产免费在线观看| 在线观看日韩欧美| 国产精品亚洲一级av第二区| 极品教师在线免费播放| 精品国内亚洲2022精品成人| 丰满的人妻完整版| 99久久综合精品五月天人人| 此物有八面人人有两片| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲一区中文字幕在线| 精品国产乱码久久久久久男人| 成人欧美大片| 午夜福利在线在线| 欧美乱妇无乱码| 51午夜福利影视在线观看| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 日韩欧美 国产精品| 日本a在线网址| 一级毛片女人18水好多| 草草在线视频免费看| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 黄片小视频在线播放| 色综合欧美亚洲国产小说| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 久久热在线av| 视频区欧美日本亚洲| 搞女人的毛片| 中国美女看黄片| 我的老师免费观看完整版| 精品无人区乱码1区二区| 少妇人妻一区二区三区视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 中文字幕高清在线视频| 狠狠狠狠99中文字幕| 麻豆成人av在线观看| 久9热在线精品视频| 午夜免费成人在线视频| 亚洲av电影不卡..在线观看| 宅男免费午夜| 丁香六月欧美| 国产黄色小视频在线观看| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 久久香蕉激情| 亚洲成人精品中文字幕电影| 高清在线国产一区| 国产黄a三级三级三级人| 国产午夜精品论理片| 久久亚洲真实| 老汉色∧v一级毛片| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国产成人系列免费观看| 日韩欧美国产在线观看| 久久久久久久午夜电影| 欧美精品啪啪一区二区三区| 男插女下体视频免费在线播放| 91字幕亚洲| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲av美国av| 在线观看舔阴道视频| 男女视频在线观看网站免费 | 国内精品久久久久久久电影| 亚洲国产看品久久| 久久久久久久久免费视频了| 中文字幕熟女人妻在线| 国产黄片美女视频| 久9热在线精品视频| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国产人伦9x9x在线观看| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 精品免费久久久久久久清纯| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲人成电影免费在线| 美女免费视频网站| 男女那种视频在线观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 欧美不卡视频在线免费观看 | 国产av在哪里看| 色尼玛亚洲综合影院| 变态另类丝袜制服| 日本熟妇午夜| 亚洲成av人片免费观看| 国产野战对白在线观看| 日本三级黄在线观看| 久久香蕉国产精品| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 免费看十八禁软件| 97碰自拍视频| 日本三级黄在线观看| 国产三级黄色录像| 手机成人av网站| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 男女午夜视频在线观看| 国产精品 欧美亚洲| 国产精品日韩av在线免费观看| 岛国在线观看网站| 99在线视频只有这里精品首页| 日韩欧美精品v在线| 黑人欧美特级aaaaaa片| 丝袜美腿诱惑在线| 熟女电影av网| 国产视频内射| 18禁国产床啪视频网站| 国产亚洲精品av在线| 丝袜人妻中文字幕| www.自偷自拍.com| 日本在线视频免费播放| 久久精品综合一区二区三区|