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    ?;撬岷嫌镁S生素C上調(diào)KATP通道m(xù)RNA表達(dá)對長期飲酒大鼠腦損傷的保護(hù)作用

    2014-07-05 08:24:26李怡欣張明升張軒萍
    關(guān)鍵詞:?;撬?/a>腦損傷飲酒

    李怡欣,王 凱,陳 敏,李 潔,張明升,趙 青,張軒萍

    長期大量飲酒會出現(xiàn)軀體或心理癥狀,不僅造成全身多器官損害,對腦損傷尤其嚴(yán)重[1],尸檢發(fā)現(xiàn)27%長期飲酒者顯示小腦變形[2]。酒精中毒后會引起腦血管自身的病變而減少腦血流,造成缺血缺氧改變,導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)和自由基損害組織和細(xì)胞[3]。

    腦組織如海馬、黑質(zhì)、紋狀體、蒼白球和小腦等部位均有高密度的ATP敏感性鉀通道(ATP-sensitive K+channels,KATP通道)存在,這些腦區(qū)的神經(jīng)元對缺血缺氧損傷十分敏感[4]。缺氧、代謝毒物均可使KATP活化[5],通過保持細(xì)胞內(nèi)外鉀離子的濃度平衡、減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載、擴(kuò)張血管、減少ATP消耗等作用對大腦起保護(hù)作用[6]。KATP通道在酒精性腦損傷中的作用如何,抗氧化治療能否通過KATP通道發(fā)揮保護(hù)腦組織的作用未見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬建立大鼠長期飲酒模型,觀察抗氧化治療對腦組織的保護(hù)作用是否有KATP通道參與,為防治酒精性腦損傷提供實(shí)驗(yàn)參考。

    1 材料與方法

    1.1 藥品與試劑 維生素C(Vitamin C),太原市振興制藥有限公司,批號:20100919。?;撬幔═aurine),南京制藥廠,批號:980923。50度北京二鍋頭酒由北京皇家京都酒業(yè)有限公司生產(chǎn);無水乙醇由天津市大茂化學(xué)試劑廠生產(chǎn)。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒購自南京建成科技有限公司;E.Z.N.A.Tussue RNA Kit總RNA抽提試劑盒(OMEGA BIO-TEK)。RT-PCR二步法試劑盒(寶生物工程大連有限公司,-20℃保存)。

    1.2 儀器與設(shè)備 721可見分光光度計(jì)(上海佑科儀器儀表有限公司);超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司);JY 600電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司);天能凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司);MJ Research PTC 100 Thermal Cycler(Waltham,MA,USA)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)動物 Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠50只,體重200g~220g,由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(豫)2005-0001。所有大鼠23℃~25℃室內(nèi)飼養(yǎng),自由飲水或飲酒,自由攝食。動物隨機(jī)分為5組,分別為空白對照組(C組)、酒精組(A組)、維生素C組(V組)、?;撬峤M(T組)、維生素C+牛磺酸組(V+T組),每組10只。C組大鼠自由飲水;其余各組大鼠自由飲用白酒[10%(V/V)酒精1周,之后給予20%(V/V)酒精19周,共20周];V組大鼠在飲酒同時(shí)加0.05%維生素C;T組大鼠在飲酒同時(shí)加2%?;撬?;V+T組大鼠在飲酒同時(shí)加0.05%維生素C和2%?;撬?。

    1.4 大鼠腦組織生化指標(biāo)測定 模型建立20周后,按4mL/kg 25%氨基甲酸乙酯溶液以腹腔注射對大鼠進(jìn)行麻醉,斷頭處死大鼠,取前腦,沿矢狀縫切開,左側(cè)大腦留作分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)用,-80℃保存?zhèn)溆?;右?cè)腦組織用生理鹽水制成10%的組織勻漿,4 000r/min離心,取上清液,用試劑盒檢測腦組織中SOD、MDA、GSH-Px含量。

    1.5 大鼠腦組織KATPmRNA表達(dá)的檢測 取100mg左右腦組織按步驟抽提RNA,測RNA濃度后取3μg行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA,引物按Genebank所提供的基因序列設(shè)計(jì),由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。SUR2A/B前引物:5′-gCAAgAgCgTggAAgAgAC-3′, 后 引 物 5′-TgCCCCAT-gAgAAgTATCC-3′,產(chǎn)物為501bp。內(nèi)參 GAPDH 前引物5′-TCCTgCACCACCAACTgCTTAg-3′,后引物5′-gATgACCTT-gCCCACAgCCTTg-3′,產(chǎn)物為208bp。SUR2A/B的擴(kuò)增條件:95℃2min,然后 94℃30s,54 ℃ 30s,72 ℃ 40s(30個(gè)循環(huán)),72℃延伸10min。內(nèi)參GAPDH的擴(kuò)增條件:94℃2 min,然后94℃ 45s,59℃,45s,72 ℃ 45s(30個(gè)循環(huán)),72℃延伸10min。產(chǎn)物進(jìn)行電泳和拍照。用天能凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并掃描保存,進(jìn)行PCR條帶灰度掃描,以GAPDH作為內(nèi)參,作半定量分析。SUR2A/B mRNA相對量=SUR2A/B條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

    2 結(jié) 果

    2.1 各組大鼠腦組織SOD、MDA、GSH-Px含量比較 長期大量飲酒大鼠腦組織MDA含量較對照組顯著升高,SOD和GSH-Px含量則顯著降低(P<0.01)。在飲酒同時(shí)加服2%牛磺酸,可使大鼠腦組織中MDA含量降低(P<0.05),升高SOD(P<0.05)及GSH-Px活性(P<0.01),但單獨(dú)應(yīng)用0.05%維生素C則無顯著改變。0.05%維生素C與2%?;撬岷嫌?,增強(qiáng)牛磺酸的抗氧化作用(P<0.01)。詳見表1。

    表1 各組大鼠腦組織SOD、MDA、GSH-Px含量比較(x±s)

    2.2 各組大鼠腦組織中SUR2A/B mRNA表達(dá) 長期大量飲酒大鼠腦組織中SUR2A/B mRNA表達(dá)量較對照組顯著減少(P<0.01);與長期飲酒的大鼠相比,飲酒時(shí)加服2%?;撬峄?.05%維生素C和2%?;撬岷嫌?,可使大鼠腦組織中SUR2A/B mRNA表達(dá)量顯著增加(P<0.01)。詳見圖1。

    圖1 維生素C合用?;撬釋﹂L期飲酒大鼠腦組織中SUR2A/B mRNA表達(dá)的影響

    3 討 論

    長期大量飲酒腦內(nèi)大量自由基和活性氧(reactive oxygen species,ROS)的生成和堆積,增強(qiáng)氧化應(yīng)激反應(yīng),引起的自由基損害,是造成神經(jīng)系統(tǒng)受損的主要原因[7]。本實(shí)驗(yàn)觀察到長期飲酒使大鼠腦組織MDA含量升高,而SOD和GSH-Px含量降低,表明在長期大量酒精的慢性刺激下,大鼠腦細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng),而細(xì)胞內(nèi)的抗氧化反應(yīng)降低。牛磺酸與維生素C合用增加SOD與GSH-Px含量,降低MDA水平,說明抗氧化劑能通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)而減輕酒精對大鼠腦的損傷作用。

    KATP通道是一類由磺酰脲類受體(Sulfonylurea receptor,SUR)亞家族亞基與內(nèi)向整流鉀通道(inwardly rectified potassium channel,Kir)亞基組成的異源性多聚體,由4個(gè)內(nèi)向整流鉀通道(Kir6.1或Kir6.2)亞單位和4個(gè)調(diào)節(jié)性磺脲類受體(SUR1,SUR2A 或 SUR2B)組成[8]。研究證明[9],KATP通道開放能使細(xì)胞膜超極化,降低神經(jīng)元興奮性,從而防止神經(jīng)細(xì)胞的興奮毒作用氧自由基級聯(lián)反應(yīng)所引起的脂質(zhì)過氧化損傷。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),長期大量飲酒使大鼠腦組織中SUR2A/B mRNA表達(dá)量顯著減少,這表明酒精慢性攝入抑制了KATP通道的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)中使用?;撬嵋约昂嫌镁S生素C能使長期飲酒大鼠腦組織SUR2A/B mRNA表達(dá)量顯著增加,表明其抗氧化作用可能有KATP通道的作用參與。

    綜上所述,?;撬峒捌浜嫌镁S生素C對長期飲酒大鼠腦損傷有積極的保護(hù)作用,該作用與其抗氧化及上調(diào)KATP通道m(xù)RNA表達(dá)有關(guān)。

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