?；撬岷嫌镁S生素C上調(diào)KATP通道m(xù)RNA表達(dá)對長期飲酒大鼠腦損傷的保護(hù)作用

李怡欣，王 凱，陳 敏，李 潔，張明升，趙 青，張軒萍

長期大量飲酒會出現(xiàn)軀體或心理癥狀，不僅造成全身多器官損害，對腦損傷尤其嚴(yán)重［1］，尸檢發(fā)現(xiàn)27%長期飲酒者顯示小腦變形［2］。酒精中毒后會引起腦血管自身的病變而減少腦血流，造成缺血缺氧改變，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)和自由基損害組織和細(xì)胞［3］。

腦組織如海馬、黑質(zhì)、紋狀體、蒼白球和小腦等部位均有高密度的ATP敏感性鉀通道（ATP－sensitive K＋channels，KATP通道）存在，這些腦區(qū)的神經(jīng)元對缺血缺氧損傷十分敏感［4］。缺氧、代謝毒物均可使KATP活化［5］，通過保持細(xì)胞內(nèi)外鉀離子的濃度平衡、減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載、擴(kuò)張血管、減少ATP消耗等作用對大腦起保護(hù)作用［6］。KATP通道在酒精性腦損傷中的作用如何，抗氧化治療能否通過KATP通道發(fā)揮保護(hù)腦組織的作用未見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬建立大鼠長期飲酒模型，觀察抗氧化治療對腦組織的保護(hù)作用是否有KATP通道參與，為防治酒精性腦損傷提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 維生素C（Vitamin C），太原市振興制藥有限公司，批號：20100919。?；撬幔═aurine），南京制藥廠，批號：980923。50度北京二鍋頭酒由北京皇家京都酒業(yè)有限公司生產(chǎn)；無水乙醇由天津市大茂化學(xué)試劑廠生產(chǎn)。超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－Px）試劑盒購自南京建成科技有限公司；E.Z.N.A.Tussue RNA Kit總RNA抽提試劑盒（OMEGA BIO－TEK）。RT－PCR二步法試劑盒（寶生物工程大連有限公司，－20℃保存）。

1.2 儀器與設(shè)備 721可見分光光度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司）；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；JY 600電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；天能凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；MJ Research PTC 100 Thermal Cycler（Waltham，MA，USA）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物 Sprague－Dawley（SD）雄性大鼠50只，體重200g～220g，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（豫）2005－0001。所有大鼠23℃～25℃室內(nèi)飼養(yǎng)，自由飲水或飲酒，自由攝食。動物隨機(jī)分為5組，分別為空白對照組（C組）、酒精組（A組）、維生素C組（V組）、?；撬峤M（T組）、維生素C＋牛磺酸組（V＋T組），每組10只。C組大鼠自由飲水；其余各組大鼠自由飲用白酒［10%（V／V）酒精1周，之后給予20%（V／V）酒精19周，共20周］；V組大鼠在飲酒同時(shí)加0.05%維生素C；T組大鼠在飲酒同時(shí)加2%?；撬?；V＋T組大鼠在飲酒同時(shí)加0.05%維生素C和2%?；撬?。

1.4 大鼠腦組織生化指標(biāo)測定 模型建立20周后，按4mL／kg 25%氨基甲酸乙酯溶液以腹腔注射對大鼠進(jìn)行麻醉，斷頭處死大鼠，取前腦，沿矢狀縫切開，左側(cè)大腦留作分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)用，－80℃保存?zhèn)溆?；右?cè)腦組織用生理鹽水制成10%的組織勻漿，4 000r／min離心，取上清液，用試劑盒檢測腦組織中SOD、MDA、GSH－Px含量。

1.5 大鼠腦組織KATPmRNA表達(dá)的檢測 取100mg左右腦組織按步驟抽提RNA，測RNA濃度后取3μg行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA，引物按Genebank所提供的基因序列設(shè)計(jì)，由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。SUR2A／B前引物：5′－gCAAgAgCgTggAAgAgAC－3′， 后 引 物 5′－TgCCCCAT－gAgAAgTATCC－3′，產(chǎn)物為501bp。內(nèi)參 GAPDH 前引物5′－TCCTgCACCACCAACTgCTTAg－3′，后引物5′－gATgACCTT－gCCCACAgCCTTg－3′，產(chǎn)物為208bp。SUR2A／B的擴(kuò)增條件：95℃2min，然后 94℃30s，54 ℃ 30s，72 ℃ 40s（30個(gè)循環(huán)），72℃延伸10min。內(nèi)參GAPDH的擴(kuò)增條件：94℃2 min，然后94℃ 45s，59℃，45s，72 ℃ 45s（30個(gè)循環(huán)），72℃延伸10min。產(chǎn)物進(jìn)行電泳和拍照。用天能凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并掃描保存，進(jìn)行PCR條帶灰度掃描，以GAPDH作為內(nèi)參，作半定量分析。SUR2A／B mRNA相對量＝SUR2A／B條帶灰度值／GAPDH條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腦組織SOD、MDA、GSH－Px含量比較 長期大量飲酒大鼠腦組織MDA含量較對照組顯著升高，SOD和GSH－Px含量則顯著降低（P＜0.01）。在飲酒同時(shí)加服2%牛磺酸，可使大鼠腦組織中MDA含量降低（P＜0.05），升高SOD（P＜0.05）及GSH－Px活性（P＜0.01），但單獨(dú)應(yīng)用0.05%維生素C則無顯著改變。0.05%維生素C與2%?；撬岷嫌?，增強(qiáng)牛磺酸的抗氧化作用（P＜0.01）。詳見表1。

表1 各組大鼠腦組織SOD、MDA、GSH－Px含量比較（x±s）

2.2 各組大鼠腦組織中SUR2A／B mRNA表達(dá) 長期大量飲酒大鼠腦組織中SUR2A／B mRNA表達(dá)量較對照組顯著減少（P＜0.01）；與長期飲酒的大鼠相比，飲酒時(shí)加服2%?；撬峄?.05%維生素C和2%?；撬岷嫌?，可使大鼠腦組織中SUR2A／B mRNA表達(dá)量顯著增加（P＜0.01）。詳見圖1。

圖1 維生素C合用?；撬釋﹂L期飲酒大鼠腦組織中SUR2A／B mRNA表達(dá)的影響

3 討 論

長期大量飲酒腦內(nèi)大量自由基和活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成和堆積，增強(qiáng)氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起的自由基損害，是造成神經(jīng)系統(tǒng)受損的主要原因［7］。本實(shí)驗(yàn)觀察到長期飲酒使大鼠腦組織MDA含量升高，而SOD和GSH－Px含量降低，表明在長期大量酒精的慢性刺激下，大鼠腦細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)，而細(xì)胞內(nèi)的抗氧化反應(yīng)降低。牛磺酸與維生素C合用增加SOD與GSH－Px含量，降低MDA水平，說明抗氧化劑能通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)而減輕酒精對大鼠腦的損傷作用。

KATP通道是一類由磺酰脲類受體（Sulfonylurea receptor，SUR）亞家族亞基與內(nèi)向整流鉀通道（inwardly rectified potassium channel，Kir）亞基組成的異源性多聚體，由4個(gè)內(nèi)向整流鉀通道（Kir6.1或Kir6.2）亞單位和4個(gè)調(diào)節(jié)性磺脲類受體（SUR1，SUR2A 或 SUR2B）組成［8］。研究證明［9］，KATP通道開放能使細(xì)胞膜超極化，降低神經(jīng)元興奮性，從而防止神經(jīng)細(xì)胞的興奮毒作用氧自由基級聯(lián)反應(yīng)所引起的脂質(zhì)過氧化損傷。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，長期大量飲酒使大鼠腦組織中SUR2A／B mRNA表達(dá)量顯著減少，這表明酒精慢性攝入抑制了KATP通道的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)中使用?；撬嵋约昂嫌镁S生素C能使長期飲酒大鼠腦組織SUR2A／B mRNA表達(dá)量顯著增加，表明其抗氧化作用可能有KATP通道的作用參與。

綜上所述，?；撬峒捌浜嫌镁S生素C對長期飲酒大鼠腦損傷有積極的保護(hù)作用，該作用與其抗氧化及上調(diào)KATP通道m(xù)RNA表達(dá)有關(guān)。

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