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    普洱茶沖泡過程中細(xì)菌的安全性分析

    2014-07-05 10:45:00趙振軍劉勤晉
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年5期
    關(guān)鍵詞:安全性

    趙振軍 劉勤晉

    摘要:以市售普洱茶為研究對(duì)象,采用國家標(biāo)準(zhǔn)方法,分別檢測(cè)普洱茶茶葉和沖泡后各批次茶湯中細(xì)菌總數(shù),并采用形態(tài)觀察與生化試驗(yàn)對(duì)從普洱茶湯中分離的細(xì)菌進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明,普洱熟茶細(xì)菌菌落數(shù)多于普洱生茶茶樣,同時(shí)散茶中細(xì)菌菌落數(shù)高于緊壓茶;普洱茶第一泡茶湯中細(xì)菌菌落數(shù)超過GB/T 19296-2003小于或等于100 CFU/mL的規(guī)定值,且從第一泡茶湯中能檢測(cè)出致病菌,而其他沖泡批次茶湯中細(xì)菌的菌落數(shù)與種類都符合安全標(biāo)準(zhǔn),適合飲用。

    關(guān)鍵詞:普洱茶;細(xì)菌;分離;安全性

    中圖分類號(hào):TS272.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):0439-8114(2014)05-1032-04

    普洱茶因具有減肥、降血壓、抗氧化[1]、抑制脂肪酸合成酶基因表達(dá)[2],清除自由基 [3],降低總的膽固醇[4]等多重功效,深受大眾喜愛,已經(jīng)成為人們?nèi)粘o嬈分?。普洱茶是一種后發(fā)酵茶,后發(fā)酵的本質(zhì)是微生物參與普洱茶品質(zhì)的形成,普洱成品茶會(huì)不可避免含有一定量微生物。為安全飲用普洱茶起見,與其他茶類的沖泡相比,通常會(huì)采用沸水殺菌,并增加一道洗茶工序,進(jìn)一步去除微生物[5,6]。但關(guān)于沸水沖泡是否會(huì)減少普洱茶茶湯中微生物種群數(shù)量、經(jīng)沸水沖泡后普洱茶茶湯中是否含有有害菌等的研究鮮見報(bào)道。因此,通過對(duì)普洱茶沸水沖泡過程中細(xì)菌數(shù)量變化進(jìn)行分析,并采用形態(tài)觀察與生化反應(yīng)的方式對(duì)茶湯中殘留的細(xì)菌進(jìn)行鑒定,為普洱茶的安全飲用提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    選擇當(dāng)年產(chǎn)普洱生、熟茶茶樣6個(gè),購自云南昆明。檸檬酸三鈉、硫代硫酸鈉、甘露醇、瓊脂粉等為北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司分析純產(chǎn)品。

    營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基:稱取本品45 g加入1 000 mL去離子水中,高壓滅菌備用。各種染色液、溶液、培養(yǎng)基按照GB/T 4789.28-2003 《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 染色法、培養(yǎng)基和試劑》說明配制[7]。相關(guān)試驗(yàn)操作參見《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》[8]。兔血漿的制備參見《食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)原理與技術(shù)》[9]。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 茶湯的制備 稱取茶葉2.50 g加入250 mL沸水,10 s后傾出茶湯,定容250 mL,即為第1泡茶湯;再加入250 mL沸水于原錐形瓶中,30 s后倒盡茶湯,定容至250 mL,為第2 泡茶湯;依此類推共泡6次,2~6次沖泡時(shí)間均為30 s,分取6泡茶湯進(jìn)行細(xì)菌群落分析。

    1.2.2 細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù) 茶樣及茶湯中細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)采用平板稀釋法,參照GB/T4789.2-2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[10]進(jìn)行。6個(gè)茶樣沖泡茶湯菌落數(shù)取平均值。

    1.2.3 細(xì)菌形態(tài)鑒定 菌落形態(tài)觀察:觀察記錄菌落在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的大小、顏色、質(zhì)地等。菌體形態(tài)觀察:革蘭氏染色,將細(xì)菌均勻涂布在載玻片上,鏡下觀察并記錄細(xì)菌形態(tài)。

    1.2.4 細(xì)菌生理生化鑒定 根據(jù)形態(tài)觀察結(jié)果,對(duì)菌種進(jìn)行大致分類(無芽孢桿菌、芽孢桿菌、球菌、弧菌),查閱《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[11],確定所要鑒定的各菌種的各項(xiàng)生理生化試驗(yàn):吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、枸櫞酸鹽試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、尿酶試驗(yàn)、糖(葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖)發(fā)酵試驗(yàn)、血漿凝固酶試驗(yàn)等。具體試驗(yàn)操作參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》[8]進(jìn)行。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 普洱茶茶樣中細(xì)菌菌落數(shù)

    將普洱茶樣品采用無菌生理鹽水稀釋后,采用平板計(jì)數(shù)法,對(duì)從市場(chǎng)上選取的當(dāng)年產(chǎn)普洱茶中細(xì)菌菌落數(shù)量進(jìn)行了統(tǒng)計(jì),普洱茶茶樣中細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)結(jié)果如表1所示。表 1 可知,普洱熟茶細(xì)菌菌落數(shù)為0.64×102~2.01×104 CFU/g,普洱生茶細(xì)菌菌落數(shù)為0.50×102~6.73×103 CFU/g,相較而言普洱熟茶細(xì)菌菌落數(shù)多于普洱生茶,同時(shí)散茶中細(xì)菌菌落數(shù)高于緊壓茶,如普洱熟散茶中細(xì)菌菌落數(shù)最大為2.01×104 CFU/g,而熟磚和熟沱兩種緊壓茶中細(xì)菌菌落數(shù)分別為1.59×102和0.64×102 CFU/g,可能與緊壓茶壓制過程中有一個(gè)高溫蒸軟的過程有關(guān),另從普洱茶樣品含水量可以看出,含水量高低與細(xì)菌菌落數(shù)存在一定的正相關(guān),可能是因?yàn)楹吭降偷牟铇有枰姹焊L的時(shí)間,可以殺死更多的細(xì)菌。

    2.2 不同沖泡次數(shù)茶湯中細(xì)菌菌落數(shù)

    對(duì)選定的普洱熟茶茶樣采用沸水進(jìn)行沖泡,分次沖泡所得茶湯中細(xì)菌菌落數(shù)統(tǒng)計(jì),結(jié)果如圖1所示。由圖1可知,隨沖泡次數(shù)增加,普洱茶茶湯中細(xì)菌菌落數(shù)逐漸減少,第一次沖泡10 s,茶湯中細(xì)菌菌落數(shù)為3.12×102 CFU/mL,超過GB/T 19296-2003規(guī)定茶飲料中微生物種群數(shù)量應(yīng)小于或等于100 CFU/mL的標(biāo)準(zhǔn)[12],而二泡之后,茶湯中細(xì)菌菌落數(shù)為0.97×102 CFU/mL,菌落數(shù)已經(jīng)降低至茶飲料中微生物種群數(shù)量最低標(biāo)準(zhǔn),但是否可以安全飲用,仍取決于菌落中是否含有致病菌。

    2.2 不同沖泡次數(shù)茶湯中細(xì)菌的形態(tài)觀察

    采用平板劃線法,對(duì)分次沖泡所得茶湯中含有的細(xì)菌進(jìn)行分離純化,首先通過肉眼或放大鏡進(jìn)行形態(tài)觀察,根據(jù)菌落的大小、顏色、質(zhì)地等,初步篩選出13株不同的細(xì)菌,然后進(jìn)一步對(duì)菌種進(jìn)行革蘭氏染色和顯微形態(tài)觀察。細(xì)菌形態(tài)描述及顯微形態(tài)結(jié)果見表2。從顯微形態(tài)可以看出,茶湯中細(xì)菌總體來說屬于兩類:桿菌與球菌。根據(jù)不同沖泡次數(shù)細(xì)菌的分離與形態(tài)鑒定結(jié)果可知,隨沖泡次數(shù)增加,不僅菌落數(shù)減少,而且細(xì)菌種類也明顯減少。如第一泡茶湯中含有細(xì)菌9種,其中桿菌6種、球菌3種(表2中菌株1~3,5~7,11~13),第二泡茶湯含細(xì)菌4種,其中桿菌3種、球菌1種(表2中菌株2,3,12);第三泡茶湯含細(xì)菌2種(1種桿菌,1種球菌,表2中菌株4,9);第四至第六泡茶湯中含細(xì)菌種類均為1種(分別為表2中菌株6,10)。

    2.3 茶湯中細(xì)菌的生化鑒定

    根據(jù)其形態(tài)特征,初步將篩選出的13株細(xì)菌判定為桿菌與球菌,而桿菌中的大腸桿菌,球菌類的金黃色葡萄球菌等都屬于致病性細(xì)菌,要評(píng)價(jià)茶湯中細(xì)菌的安全性,需要通過相關(guān)的生化試驗(yàn),以確定其致病性。參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[11],對(duì)菌株1~7開展葡萄糖、蔗糖、乳糖、三糖鐵斜面等生化試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)枸櫞酸鹽試驗(yàn)呈陰性,顯示桿菌1~7不屬于克雷伯菌屬、沙門菌屬,菌株1~4,6發(fā)酵乳糖呈陰性,說明菌株1~4,6不屬于大腸桿菌,進(jìn)一步VP試驗(yàn)與甲基紅試驗(yàn)呈陰性,說明菌株1~4,6可能屬于沙門、志賀、變形、枸櫞酸桿菌等,而菌株5在乳糖發(fā)酵、VP試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)均呈陽性說明菌株5是大腸桿菌,而其他桿菌1~4,6均不具有致病性。對(duì)菌株8~13開展觸酶試驗(yàn),菌株8~12均呈陽性,說明菌株8~12可能是葡萄球菌;通過血漿凝固酶試驗(yàn),菌株12呈陽性,由此判斷菌株12具有致病性,可能是金黃色葡萄球菌;血漿凝固酶試驗(yàn)、膽汁溶菌酶試驗(yàn)菌株13呈陰性,可以排除菌株13屬于肺炎鏈球菌的可能。通過生化試驗(yàn),可鑒定從普洱茶茶湯中分離的菌株5屬于大腸桿菌,菌株12可能屬于金黃色葡萄球菌,具有致病性,而其他菌株屬于非致病性的桿菌和球菌(表3)。而致病菌均來自普洱茶第一次沖泡的茶湯,可能初次沖泡10 s時(shí)間太短,高溫沸水尚未將致病菌殺死。

    3 結(jié)論

    普洱茶中含有一定量的細(xì)菌,采用沸水沖泡有助于殺滅細(xì)菌。普洱茶第一次沖泡的茶湯細(xì)菌菌落數(shù)超過GB/T 19296-2003規(guī)定茶飲料中微生物種群數(shù)量應(yīng)小于或等于100 CFU/mL的標(biāo)準(zhǔn),而且第一泡中由于沸水作用時(shí)間短,普洱茶中的致病菌可能仍然具有活性,所以從安全方面考慮,普洱茶第二泡及后面沖泡的茶水更適合飲用。

    參考文獻(xiàn):

    [1] CHIANG C T, WENG M S, LIN-SHIAU S Y, et al. Pu-erh tea supplementation suppresses fatty acid synthase expression in the rat liver through down regulating Akt and JNK signalings as demonstrated in human hepatoma HepG2 cells[J].Oncology Research,2006,16(3):119-128.

    [2] DUH P D,YEN G C,YEN W J,et al. Effects of pu-erh tea on oxidative damage and nitric oxide scavenging[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2004,52(26):8169-8176.

    [3] JIE G L, LIN Z, ZHANG L Z, et al. Free radical scavenging effect of Pu-erh tea extracts and their protective effect on oxidative damage in human fibroblast cells[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2006,54(21):8058-8064.

    [4] KUO K L, WENG M S, CHIANG C T, et al. Comparative studies on the hypolipidemic and growth suppressive effects of oolong, black, pu-erh, and green tea leaves in rats[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2005,53(2):480-489.

    [5] 劉勤晉,周才瓊,許鴻亮,等.普洱茶的渥堆作用[J].茶葉科學(xué),1986,6(2):55-56.

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    [7] GB/T 4789.28-2003,食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 染色法、培養(yǎng)基和試劑[S].

    [8] 陳崢宏.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].上海:第二軍醫(yī)大學(xué)出版社,2008.

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    [11] 布坎南 R E,吉本斯 N E.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M].第八版. 中國科學(xué)院微生物研究所《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》翻譯組,譯.北京:科學(xué)出版社,1984.

    [12] GB/T 19296-2003,茶飲料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[S].

    2.3 茶湯中細(xì)菌的生化鑒定

    根據(jù)其形態(tài)特征,初步將篩選出的13株細(xì)菌判定為桿菌與球菌,而桿菌中的大腸桿菌,球菌類的金黃色葡萄球菌等都屬于致病性細(xì)菌,要評(píng)價(jià)茶湯中細(xì)菌的安全性,需要通過相關(guān)的生化試驗(yàn),以確定其致病性。參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[11],對(duì)菌株1~7開展葡萄糖、蔗糖、乳糖、三糖鐵斜面等生化試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)枸櫞酸鹽試驗(yàn)呈陰性,顯示桿菌1~7不屬于克雷伯菌屬、沙門菌屬,菌株1~4,6發(fā)酵乳糖呈陰性,說明菌株1~4,6不屬于大腸桿菌,進(jìn)一步VP試驗(yàn)與甲基紅試驗(yàn)呈陰性,說明菌株1~4,6可能屬于沙門、志賀、變形、枸櫞酸桿菌等,而菌株5在乳糖發(fā)酵、VP試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)均呈陽性說明菌株5是大腸桿菌,而其他桿菌1~4,6均不具有致病性。對(duì)菌株8~13開展觸酶試驗(yàn),菌株8~12均呈陽性,說明菌株8~12可能是葡萄球菌;通過血漿凝固酶試驗(yàn),菌株12呈陽性,由此判斷菌株12具有致病性,可能是金黃色葡萄球菌;血漿凝固酶試驗(yàn)、膽汁溶菌酶試驗(yàn)菌株13呈陰性,可以排除菌株13屬于肺炎鏈球菌的可能。通過生化試驗(yàn),可鑒定從普洱茶茶湯中分離的菌株5屬于大腸桿菌,菌株12可能屬于金黃色葡萄球菌,具有致病性,而其他菌株屬于非致病性的桿菌和球菌(表3)。而致病菌均來自普洱茶第一次沖泡的茶湯,可能初次沖泡10 s時(shí)間太短,高溫沸水尚未將致病菌殺死。

    3 結(jié)論

    普洱茶中含有一定量的細(xì)菌,采用沸水沖泡有助于殺滅細(xì)菌。普洱茶第一次沖泡的茶湯細(xì)菌菌落數(shù)超過GB/T 19296-2003規(guī)定茶飲料中微生物種群數(shù)量應(yīng)小于或等于100 CFU/mL的標(biāo)準(zhǔn),而且第一泡中由于沸水作用時(shí)間短,普洱茶中的致病菌可能仍然具有活性,所以從安全方面考慮,普洱茶第二泡及后面沖泡的茶水更適合飲用。

    參考文獻(xiàn):

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    2.3 茶湯中細(xì)菌的生化鑒定

    根據(jù)其形態(tài)特征,初步將篩選出的13株細(xì)菌判定為桿菌與球菌,而桿菌中的大腸桿菌,球菌類的金黃色葡萄球菌等都屬于致病性細(xì)菌,要評(píng)價(jià)茶湯中細(xì)菌的安全性,需要通過相關(guān)的生化試驗(yàn),以確定其致病性。參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[11],對(duì)菌株1~7開展葡萄糖、蔗糖、乳糖、三糖鐵斜面等生化試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)枸櫞酸鹽試驗(yàn)呈陰性,顯示桿菌1~7不屬于克雷伯菌屬、沙門菌屬,菌株1~4,6發(fā)酵乳糖呈陰性,說明菌株1~4,6不屬于大腸桿菌,進(jìn)一步VP試驗(yàn)與甲基紅試驗(yàn)呈陰性,說明菌株1~4,6可能屬于沙門、志賀、變形、枸櫞酸桿菌等,而菌株5在乳糖發(fā)酵、VP試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)均呈陽性說明菌株5是大腸桿菌,而其他桿菌1~4,6均不具有致病性。對(duì)菌株8~13開展觸酶試驗(yàn),菌株8~12均呈陽性,說明菌株8~12可能是葡萄球菌;通過血漿凝固酶試驗(yàn),菌株12呈陽性,由此判斷菌株12具有致病性,可能是金黃色葡萄球菌;血漿凝固酶試驗(yàn)、膽汁溶菌酶試驗(yàn)菌株13呈陰性,可以排除菌株13屬于肺炎鏈球菌的可能。通過生化試驗(yàn),可鑒定從普洱茶茶湯中分離的菌株5屬于大腸桿菌,菌株12可能屬于金黃色葡萄球菌,具有致病性,而其他菌株屬于非致病性的桿菌和球菌(表3)。而致病菌均來自普洱茶第一次沖泡的茶湯,可能初次沖泡10 s時(shí)間太短,高溫沸水尚未將致病菌殺死。

    3 結(jié)論

    普洱茶中含有一定量的細(xì)菌,采用沸水沖泡有助于殺滅細(xì)菌。普洱茶第一次沖泡的茶湯細(xì)菌菌落數(shù)超過GB/T 19296-2003規(guī)定茶飲料中微生物種群數(shù)量應(yīng)小于或等于100 CFU/mL的標(biāo)準(zhǔn),而且第一泡中由于沸水作用時(shí)間短,普洱茶中的致病菌可能仍然具有活性,所以從安全方面考慮,普洱茶第二泡及后面沖泡的茶水更適合飲用。

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