母系遺傳耳聾家系核心成員MTO1基因的突變篩查

耿雪俠，張 立，張海軍，單祥年

（1.淮北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 淮北 235000；2.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009）

A1555G突變是最早發(fā)現(xiàn)、最常見(jiàn)的與母系遺傳非綜合征耳聾相關(guān)的人類線粒體DNA突變［1-2］.大量證據(jù)表明，A1555G突變攜帶者具有臨床表型上的異質(zhì)性，而臨床表型的差異可用閾值模式來(lái)解釋，即當(dāng)環(huán)境因素、核修飾基因突變和線粒體基因突變3 者協(xié)同作用的結(jié)果達(dá)到或超過(guò)閾值時(shí)則表現(xiàn)出耳聾癥狀，反之則表型正常［1］.雖然，已有學(xué)者在尋找核修飾基因方面做了許多有益的工作，但目前仍未找到一個(gè)可確證的核修飾基因［3-8］.

2002年，Li和Guan等根據(jù)酵母的Mto1基因（mitochondrial translation optimization 1 homolog，MTO1）克隆并鑒定了人類的MTO1 基因.通過(guò)生化功能分析，他們認(rèn)為MTO1 基因可能是影響線粒體12S rRNA A1555G突變的核修飾基因［9-10］.但他人在西班牙、芬蘭等A1555G突變相關(guān)母系遺傳耳聾家系的研究中并未找到與耳聾表型相關(guān)的序列變化［11-12］.

江蘇省淮陰市方氏母系遺傳非綜合征耳聾大家系是目前世界范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)的最大遺傳性耳聾家系之一［13-14］.前期的研究表明認(rèn)為線粒體DNA上1 555位點(diǎn)A→G的突變是該家系母系成員耳聾的重要原因之一［15-17］.但在該家系中A1555G突變致聾的高外顯率（57%）問(wèn)題上仍無(wú)法得到圓滿的解釋［17］.鑒于淮陰母系遺傳非綜合征耳聾大家系與國(guó)內(nèi)外其他家系A(chǔ)1555G 突變的來(lái)源不同及非綜合征耳聾的高度異質(zhì)性［18］，我們對(duì)淮陰母系遺傳非綜合征耳聾大家系10例母系成員（5例聽(tīng)力正常，5例具有嚴(yán)重耳聾癥狀）的MTO1基因進(jìn)行研究，以期確認(rèn)MTO1基因是否可以作為該家系的核修飾基因.

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇該大家系中成員齊全、臨床資料詳盡、外顯率最高的一分支家系為研究對(duì)象（見(jiàn)圖1）.根據(jù)純音聽(tīng)閾、聲導(dǎo)抗及聽(tīng)性腦干反應(yīng)的檢測(cè)結(jié)果，選擇母系成員中5 例具有嚴(yán)重耳聾癥狀的個(gè)體（II4、III1、III5、III13和IV11，他們的PTA＞90 dB）和5 例聽(tīng)力正常個(gè)體（IV6、IV10、IV13、IV14和V1，他們的PTA＜20 dB）作為研究對(duì)象.用藥史調(diào)查顯示他們均未曾口服或肌肉注射過(guò)慶大霉素或鏈霉素等氨基糖甙類藥物.

圖1 核心家系圖■ 男性耳聾患者；● 女性耳聾患者；□ 男性聽(tīng)力正常個(gè)體；○ 女性聽(tīng)力正常個(gè)體；* 氨基糖甙類藥物后耳聾患者Fig.1 Nuclear pedigree of the Chinese extensive family with hearing loss■ male hearing loss；● female hearing loss；□ male normal hearing；○ female normal hearing；* exposure to aminoglycosides

1.2 MTO1基因突變的篩查

人類MTO1基因全長(zhǎng)40 439 bp，包括12個(gè)外顯子和11個(gè)內(nèi)含子，外顯子長(zhǎng)度從118-522 bp不等，最短的內(nèi)含子僅有92 bp，而最長(zhǎng)的內(nèi)含子可達(dá)9 614 bp.根據(jù)MTO1 基因序列（Genbank Accession No.NM_133645）及有關(guān)文獻(xiàn)［10-11］，用Oligo6軟件設(shè)計(jì)并合成了8對(duì)引物，用于擴(kuò)增MTO1基因的12個(gè)外顯子及外顯子與內(nèi)含子交界區(qū).引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度見(jiàn)表1.PCR反應(yīng)體系：10×PCR 緩沖液5.0 μL，25 mmol/L dNTPs 0.4 μL，25 mmol/L MgCl24.0 μL，25 mmol/L 上、下游引物各0.6 μL，DNA模板2.0 μL，補(bǔ)滅菌雙蒸水至總體積 50.0 μL.PCR 反應(yīng)條件：采用熱啟動(dòng)并Touchdown 程序.94 ℃預(yù)變性4 min 后，加入高保真Taq DNA 聚合酶（TaKaRa公司）0.4 μL（2U），94 ℃ 50 sec，63 ℃ 50 sec，－0.5 ℃/循環(huán)，72 ℃ 1 min，12個(gè)循環(huán)；94 ℃ 50 sec，56 ℃ 50 sec，72 ℃ 1-1.5 min，25 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存.1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，純化后PCR產(chǎn)物送上海生工生物科技測(cè)序.

表1 擴(kuò)增MTO1基因引物Table 1 Primers used to PCR amplify the MTO1 gene

2 結(jié)果

2.1 MTO1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

PCR 產(chǎn)物電泳后顯示擴(kuò)增片段大小與預(yù)測(cè)結(jié)果一致，空白對(duì)照無(wú)相應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物，排除了外源DNA的污染（見(jiàn)圖2）.

圖2 MTO1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果M，DL2000 marker；A-H為8對(duì)引物序號(hào)；a 陽(yáng)性對(duì)照；b 陰性對(duì)照Fig.2 Gel image of PCR product for MTO1 geneM，DL2000 marker；A-H，8 pairs of PCR primers；a positive control；b negative control

2.2 測(cè)序結(jié)果

測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAstar 軟件中的Seqman 程序處理后，并與標(biāo)準(zhǔn)序列（Genbank Accession No.NM_133645）比對(duì)，發(fā)現(xiàn)5例具有嚴(yán)重耳聾癥狀患者的MTO1基因與5例聽(tīng)力正常個(gè)體的MTO1基因相應(yīng)序列完全一致；且與MTO1標(biāo)準(zhǔn)序列相比，無(wú)任何序列變化.

3 討論

人類MTO1基因是酵母Mto1基因的同源基因，為編碼線粒體蛋白的核基因.在酵母細(xì)胞中，單獨(dú)的線粒體15S rRNA上的PR454突變（C1477G）無(wú)明顯異常的表型，只有當(dāng)突變的核Mto1基因和突變的線粒體15S rRNA 上的PR454 突變（C1477G）同時(shí)存在時(shí)，酵母細(xì)胞才表現(xiàn)為呼吸功能缺陷.而15S rRNA 上的PR454突變（C1477G）與人類的12S rRNA上的A1555G突變相對(duì)應(yīng).同時(shí)，人類的MTO1基因cDNA可以補(bǔ)償帶有PR454突變（C1477G）和Mto1基因突變酵母細(xì)胞的呼吸功能缺陷.另外，雖然人類的MTO1基因在多種組織中都有表達(dá)，但在包括耳蝸在內(nèi)的高耗能組織中表達(dá)量明顯升高，且有多種不同的剪接方式.因此，他們認(rèn)為人類的MTO1基因可能是影響12S rRNA A1555G突變的核修飾基因［9-10］.

2003年，F(xiàn)innila等對(duì)一芬蘭A1555G突變相關(guān)耳聾家系成員的MTO1基因進(jìn)行了研究，結(jié)果僅在外顯子5和外顯子6間的內(nèi)含子區(qū)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)A→G的同質(zhì)型替換，且該序列變化在所有的家系成員中都存在，并不與耳聾表型共分離.因此，他們認(rèn)為，人類的MTO1基因可能不是線粒體A1555G突變的核修飾基因［11］.2004 年，Bykhovskaya 等在MTO1 基因兩側(cè)各選擇了一個(gè)STR（D6S280、D6S1596）對(duì)西班牙、意大利和阿拉伯－以色列的31個(gè)A1555G 突變相關(guān)非綜合征耳聾家系中的214 個(gè)個(gè)體進(jìn)行了兩點(diǎn)或多點(diǎn)非參數(shù)分析及連鎖不平衡檢驗(yàn)，結(jié)果顯示MTO1基因與耳聾表型可能存在連鎖關(guān)系（最高LOD值為2.84）；結(jié)合MTO1基因參與線粒體RNA修飾及其存在不同剪接體等性質(zhì)，Bykhovskaya等認(rèn)為MTO1基因可能參與了線粒體A1555G突變的表型修飾.但遺憾的是他們并未找到與耳聾癥狀相關(guān)的突變或序列變化［12］.

在本實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)來(lái)自淮陰線粒體A1555G 突變相關(guān)耳聾家系中的5例正常母系成員和5 例耳聾患者的MTO1基因進(jìn)行了研究，但在MTO1基因的編碼區(qū)及內(nèi)含子與外顯子交接區(qū)均未發(fā)現(xiàn)任何序列變化，推測(cè)MTO1基因可能不對(duì)該家系A(chǔ)1555G突變具有核修飾效應(yīng).

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