馬氏珠母貝Nrf2基因的克隆及其在不同免疫刺激和營養(yǎng)條件下的表達變化

蔡彩霞，廖永山，楊創(chuàng)業(yè),,3*，鄭哲,,3，鄧岳文,,3，王慶恒,,3

(1.廣東海洋大學 水產(chǎn)學院，廣東 湛江 524088；2.廣東省珍珠養(yǎng)殖與加工工程技術研究中心，廣東 湛江 524088；3.廣東省海水養(yǎng)殖生物育種工程實驗室，廣東 湛江 524088)

核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2)屬于CNC亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄激活因子(CNC-basic leucine zipper, CNC-bZIP)家族，Nrf2受Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)的調(diào)控，并調(diào)節(jié)其下游的靶基因表達，參與機體氧化應激、炎癥反應、神經(jīng)性疾病、腫瘤及線粒體功能等免疫調(diào)節(jié)反應[1-3]。近年來，研究人員已鑒定出200多個Nrf2靶基因[4]。在水產(chǎn)動物中，敲除Nrf2基因的斑馬魚Daniorerio細胞對金屬或其他氧化源表現(xiàn)出更高的敏感度[5]；注射Nrf2激動劑叔丁基對苯二酚可明顯干擾長牡蠣Crassostreagigas和洛氏鱥Rhynchocyprislagowskii的抗氧化能力[6-7]；重金屬和PAHs混合暴露會引起厚殼貽貝MytiluscoruscusNrf2表達水平顯著升高[8]。此外，氨基酸營養(yǎng)代謝會影響Nrf2-Keap1信號通路，例如，飼料中缺乏色氨酸、煙酸、膽堿、泛酸和葉酸等營養(yǎng)物質(zhì)，會導致草魚CtenopharyngodonidellaNrf2的表達下降，而飼料中適宜的精氨酸水平可使團頭魴Megalobramaamblycephala幼魚腸道Nrf2基因表達水平上調(diào)，且Mn-SOD、GPx等抗氧化酶基因的相對表達水平與Nrf2基因相對表達水平呈正相關[9-10]。由此可見，Nrf2基因參與了動物體的營養(yǎng)代謝和免疫調(diào)節(jié)等生理活動[11]。

馬氏珠母貝Pinctadafucatamartensii是中國重要的經(jīng)濟貝類，同時也是培育海水珍珠的重要貝種[12-13]。近年來，氣候變化、環(huán)境污染等問題給珍珠養(yǎng)殖業(yè)帶來較大沖擊[14]。因此，深入了解馬氏珠母貝的免疫調(diào)節(jié)機制對貝類健康養(yǎng)殖具有重要理論與實踐意義。鑒于Nrf2基因在免疫應激與營養(yǎng)免疫調(diào)節(jié)中的重要作用，本研究中通過克隆獲得馬氏珠母貝Nrf2基因完整的CDS序列，分析其序列特征，利用熒光定量PCR檢測該基因在不同組織、不同免疫刺激和營養(yǎng)條件下的表達水平，以期為深入研究其作用機理提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗貝均取自廣東省徐聞縣大井村海區(qū)，選取同批規(guī)格一致、健康的2齡馬氏珠母貝個體(殼長62.73 mm±6.46 mm)作為全組織qPCR的材料。隨機選取10只馬氏珠母貝，解剖并剪取腸道、足、外套膜、閉殼肌、鰓、肝胰腺和性腺組織，經(jīng)液氮速凍后于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA 的合成 使用Trizol 法分別提取腸道、足、性腺、外套膜、鰓、閉殼肌和肝胰腺的總RNA，先利用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳方法驗證其完整性和污染情況，運用核酸分析儀測定總RNA的濃度和純度，用于制備Real-time Quantitaty PCR(qRT-PCR)分析所需要的cDNA，制備方法參考Revert Aid Premium Reverse Transcriptase合成試劑盒操作指南。根據(jù)本課題組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中獲得的Nrf2基因序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設計特異性引物，用于基因CDS片段的擴增和qRT-PCR(表1)。

表1 試驗用引物序列

1.2.2 馬氏珠母貝Nrf2基因CDS片段克隆 利用已設計出的特異性引物對馬氏珠母貝Nrf2基因進行PCR擴增，使用10 g/L瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物，并連接到PMD19-T vector上，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細胞(北京全式金生物技術有限公司)，對陽性克隆菌落進行PCR檢測，委托生工生物(上海)股份有限公司進行測序。

1.2.3 馬氏珠母貝Nrf2基因的序列分析 采用DNAMAN 7.0拼接克隆所獲片段，采用NCBI-ORF Finder在線預測Nrf2基因的開放閱讀框并翻譯出相應氨基酸序列；采用Signal P 4.1預測Nrf2氨基酸序列的信號肽，采用ExPASy-ProtScale分析蛋白的理化性質(zhì)，采用ExPASy-ProtParam在線分析蛋白的疏水性；采用SMART軟件分析蛋白的結構域，采用TMHMM Server 2.0預測氨基酸序列的跨膜結構域；采用SOPMA預測蛋白的二級結構，采用SWISS-MODEL分別預測馬氏珠母貝和長牡蠣的Nrf2蛋白的三維結構；通過BLASTX在線同源性搜索比對查找多個物種的Nrf2氨基酸序列，采用DNAMAN 8.0 和Clustal W(http://www.genome.jp/tools/clustalw/)進行同源比對分析；采用MEGA 7.0軟件構建系統(tǒng)進化樹，自展法(bootstrap)重復檢驗設置1 000次。

1.2.4Nrf2基因的組織表達分布 采用qRT-PCR 方法檢測Nrf2在貝體腸道、足、性腺、外套膜、鰓、閉殼肌和肝胰腺中的表達，每個樣品設置3個重復。反應體系參照北京全式金生物有限公司SYBR?Select Master Mix說明書。采用2-ΔΔCt法計算該基因的相對表達量。

1.2.5 脂多糖(LPS)、肽聚糖(PGN)和聚肌胞苷酸(Poly I：C)刺激后馬氏珠母貝鰓中Nrf2的表達變化 挑選200只健康的馬氏珠母貝隨機分為4組，每組50只貝，其中對照組每只貝注射100 μL 10 μg/mL的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，另外3組為試驗組，每只貝分別注射100 μL 10 μg/mL LPS、PGN、Poly I：C進行刺激。注射后分別于0、6、12、24、48 h隨機從各組中取10只貝的鰓組織進行qRT-PCR檢測，并計算Nrf2的相對表達量。

1.2.6 5種不同蛋白源飼料投喂后馬氏珠母貝鰓中Nrf2的表達變化 分別以小球藻粉、螺旋藻粉、酵母粉、豆粕和玉米蛋白粉為主要蛋白源配制的等氮等脂的5種配合飼料進行喂養(yǎng)試驗，其中，飼料的粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量分別為35%和10%，飼料配方信息詳見文獻[15]。選取50只體質(zhì)量為(2.87±0.23)g的馬氏珠母貝隨機分配到5個試驗組，在試驗桶中暫養(yǎng)7 d后進行正式養(yǎng)殖試驗，水體溶解氧基本保持在5.0 mg/L，水溫為20.5～22.5 ℃，鹽度為30。試驗期間每天換水一次，每6 h投喂一次，每次投喂量為3 g，投喂45 d后，對馬氏珠母貝的鰓組織進行取樣。以β-actin作為內(nèi)參基因(表1)，使用qRT-PCR方法檢測各試驗組馬氏珠母貝鰓組織中Nrf2基因的表達量，并計算Nrf2的相對表達量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0 軟件對基因相對表達量進行單因素方差分析，用Duncan法進行組間比較，顯著性水平設為0.05。

2 結果與分析

2.1 馬氏珠母貝Nrf2基因的克隆與序列分析

以馬氏珠母貝肝胰腺總RNA為模板，克隆獲得Nrf2基因的開放閱讀框長度為2 652 bp，編碼883個氨基酸(圖1)；BLASTX比對顯示，馬氏珠母貝Nrf2氨基酸序列與長牡蠣、蝦夷扇貝Patinopectenyessoensis和櫛孔扇貝Chlamysfarreri等的Nrf2氨基酸序列具有較高同源性(表2)。

表2 馬氏珠母貝與其他物種Nrf2氨基酸序列的同源性對比

灰色陰影表示BRLZ結構域；* 表示終止密碼子。

通過SignalP 4.1和TMHMM Server 2.0在線預測，馬氏珠母貝Nrf2氨基酸序列未發(fā)現(xiàn)信號肽和跨膜結構域。應用SOPMA預測的Nrf2蛋白二級結構顯示，無規(guī)則卷曲占54.81%，α-螺旋結構占34.54%，延伸鏈和β轉(zhuǎn)角分別占7.13%和3.51%。SMART分析顯示，Nrf2蛋白屬于CNC亮氨酸拉鏈蛋白家族，其氨基酸序列靠近C端含有一個由65個氨基酸組成的BRLZ結構域(760 aa～824 aa)(圖2)。

圖2 馬氏珠母貝Nrf2蛋白的結構域預測

2.2 馬氏珠母貝Nrf2蛋白的理化性質(zhì)分析

馬氏珠母貝Nrf2蛋白的理論等電點為5.51，相對分子質(zhì)量為100 150，該蛋白由20種氨基酸組成，其中，含量最高的氨基酸是天冬酰胺(Asn)，占9.7%，半胱氨酸(Cys)含量最低，占0.5%。Nrf2蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為60.22，被劃分為不穩(wěn)定蛋白；Nrf2蛋白在第14位達到最高疏水性，疏水指數(shù)為2.500，在第245和246位達到最高親水性，親水指數(shù)為-3.833;該蛋白的脂溶指數(shù)與親水性平均系數(shù)分別為66.70和-0.923，屬于親水性蛋白。

2.3 馬氏珠母貝Nrf2同源性和系統(tǒng)進化分析

采用DNAMAN 8.0軟件將長牡蠣、櫛孔扇貝、蝦夷扇貝和褶紋冠蚌CristariaplicataNrf2與馬氏珠母貝的Nrf2氨基酸序列進行多重序列比對，結果如圖3所示，不同貝類物種間的BRLZ結構域具有較高的保守性，為83.69%，且馬氏珠母貝與長牡蠣的Nrf2氨基酸序列同源性最高。

藍色為一致氨基酸; 粉色為相似度大于 75%; 青綠色為相似度大于 50%; 黑色方框為BRLZ結構域。

利用NCBI查找與馬氏珠母貝Nrf2氨基酸序列同源性較高的15個物種的Nrf2氨基酸序列(表2)，使用NJ法在 MEGA 7.0上構建系統(tǒng)進化樹。結果顯示，進化樹分成兩大支：馬氏珠母貝Nrf2與長牡蠣的親緣關系最近，其余物種Nrf2氨基酸序列聚為一支(圖4)。

圖4 基于NJ法構建的Nrf2氨基酸序列系統(tǒng)進化樹

2.4 馬氏珠母貝Nrf2蛋白三級結構預測

經(jīng)過數(shù)據(jù)庫搜索和模板選擇，對馬氏珠母貝Nrf2和長牡蠣Nrf2進行蛋白分子三級結構分析。結果顯示，二者的結構主要以不規(guī)則卷曲為主，其次是α-螺旋，對比發(fā)現(xiàn),馬氏珠母貝Nrf2蛋白的空間結構保守性較高(圖5)。

圖5 馬氏珠母貝和長牡蠣Nrf2蛋白保守域的三維結構

2.5 馬氏珠母貝Nrf2基因的組織表達分析

Nrf2基因在馬氏珠母貝7 個組織中的表達結果如圖6所示，Nrf2在馬氏珠母貝腸道、足、外套膜、閉殼肌、鰓、肝胰腺、性腺中均有表達，其中閉殼肌中的表達水平最低，在閉殼肌、外套膜、足、性腺間不存在顯著性差異(P>0.05)，在肝胰腺組織中表達量最高，且顯著高于其他組織(P<0.05)。

標有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同。

2.6 LPS、PGN、Poly I：C刺激后馬氏珠母貝鰓中Nrf2基因的表達變化

馬氏珠母貝Nrf2經(jīng)不同免疫刺激后48 h內(nèi)的時序表達結果如圖7所示，與PBS對照組相比，注射LPS、PGN、Poly I：C的各處理組在24 h內(nèi)Nrf2的表達量無顯著性差異(P>0.05)，而在48 h時各處理組Nrf2顯著上調(diào)(P<0.05)，且表達量達到最高，分別為0 h PBS對照組的3.8、2.8、3.1倍。由此可見，免疫刺激可以誘導馬氏珠母貝鰓中Nrf2表達。

*表示試驗組與PBS對照組存在顯著性差異(P<0.05)。

2.7 不同蛋白源飼料投喂后馬氏珠母貝鰓中Nrf2基因的表達變化

比較小球藻粉、螺旋藻粉、酵母粉、豆粕和玉米蛋白粉5種不同蛋白源飼料投喂的馬氏珠母貝鰓組織中Nrf2基因的表達，結果如圖8所示，螺旋藻粉、酵母粉和豆粕粉組Nrf2的表達量顯著高于小球藻和玉米蛋白粉組(P<0.05)。

圖8 不同蛋白源飼料投喂后馬氏珠母貝鰓中Nrf2基因的表達變化

3 討論

3.1 馬氏珠母貝Nrf2基因序列特征

Nrf2作為調(diào)節(jié)細胞氧化應激的重要轉(zhuǎn)錄因子[16]，具有特異性識別并結合多種防御酶基因上抗氧化元件ARE的功能，可以上調(diào)下游的一些抗氧化相關靶基因表達，并能與泛素或Keap1的Kelch 結構域相結合，引起Nrf2泛素依賴性降解[17-19]。本研究中，馬氏珠母貝Nrf2基因開放閱讀框長度為2 652 bp，可編碼883個氨基酸，該蛋白的二級結構是由無規(guī)則卷曲構成，其氨基酸序列無信號肽和跨膜結構域，且發(fā)現(xiàn)其不穩(wěn)定系數(shù)高達60.22，根據(jù)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的判斷標準[20]，推斷Nrf2蛋白在正常情況下不能在細胞中穩(wěn)定存在，這是驗證正常生理狀態(tài)下Keap1對Nrf2進行泛素化降解的負控作用的初步條件。經(jīng)多序列比對和系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，馬氏珠母貝Nrf2與長牡蠣的親緣關系最近，但與哺乳類相比存在較大的進化差異。

3.2 馬氏珠母貝Nrf2基因的組織表達

Nrf2是廣泛存在于哺乳類、昆蟲和魚類等動物中的一類免疫調(diào)節(jié)因子，在肝臟、腎、消化腺及鰓等組織中高表達[21-26]。本研究中發(fā)現(xiàn)，Nrf2在馬氏珠母貝各組織中廣泛分布，表明Nrf2在非刺激條件下存在，同時，Nrf2在馬氏珠母貝肝胰腺中呈現(xiàn)顯著高表達，其次是腸道和鰓。肝胰腺是主要的免疫、解毒器官[27]，Nrf2缺乏被證實會增加肝臟的脂質(zhì)過氧化，在肝臟損傷中發(fā)揮保護作用。腸道是機體從外界攝取食物后進行異生物質(zhì)代謝的場所，通常通過排毒系統(tǒng)將污染物代謝[28]。鰓是濾食器官，不斷與水體進行物質(zhì)交換，容易受到外界病原菌等刺激[29]。推測Nrf2在鰓與腸道中可能參與免疫調(diào)節(jié)反應。與脊椎動物不同的是，馬氏珠母貝等無脊椎動物缺乏適應性免疫[30]，因此，深入研究馬氏珠母貝Nrf2基因在非特異性免疫中的調(diào)控機制具有重要意義。

3.3 馬氏珠母貝Nrf2基因的免疫應答比較

LPS、PGN和Poly I：C作為炎癥介質(zhì)可誘導機體分泌出一系列因子來介導炎癥反應的發(fā)生，并產(chǎn)生大量的自由基，誘發(fā)氧化應激[31-34]。本實驗室前期研究中已證實Nrf2能夠誘導馬氏珠母貝NF-κB通路主要信號分子NF-κB誘導激酶(NF-κB-inducing kinase,NIK)和IKB激酶(IKB kinase,IKK)，以及下游炎癥相關基因的表達，包括腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor,TNFR)和脂多糖誘導的腫瘤壞死因子α因子(lipopolysaccharide-induced TNF-alpha factor,LITAF)等[35-36]。Gong等[37]還發(fā)現(xiàn)，敲除Nrf2可增加花生四乙烯(AA)對細胞的毒性，降低細胞內(nèi)GSH水平，增加ROS的產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化作用，而過表達Nrf2可增強細胞對AA毒性的抵抗力。進一步證明Nrf2參與機體免疫應答。為探究Nrf2在馬氏珠母貝免疫響應方面的作用，本研究中分別檢測了LPS、PGN和Poly I:C刺激后馬氏珠母貝Nrf2基因的時序表達情況，結果顯示，Nrf2在刺激后的48 h時顯著上調(diào)。在翡翠貽貝Pernaviridis和菲律賓蛤仔Ruditapesphilippinarum中分別進行的腹瀉性貝類毒素和多環(huán)芳烴暴露試驗均表明，Nrf2可通過調(diào)控一系列抗氧化基因的表達，介導機體抗氧化防御[4,38]。因此，推測馬氏珠母貝經(jīng)LPS、PGN、Poly I:C刺激出現(xiàn)炎癥反應后，Nrf2可以提高機體對免疫刺激的抵抗力，減弱刺激作用從而使細胞進行修復，并將損傷降至最低。本研究結果為Nrf2參與馬氏珠母貝天然免疫功能提供了證據(jù)，為進一步研究其在馬氏珠母貝免疫調(diào)控機制中的作用提供了基礎資料。

3.4 不同蛋白源飼料投喂后Nrf2基因表達變化

免疫系統(tǒng)和營養(yǎng)代謝間存在密切的聯(lián)系，當免疫系統(tǒng)被激活后，機體主要從營養(yǎng)物中獲得所需代謝底物和能量，并作為形成新免疫細胞、抗體、細胞因子和急性期蛋白等效應物和保護分子如谷胱甘肽合成的前體[39-40]。大量研究表明，維生素、礦物質(zhì)、脂肪酸、氨基酸等營養(yǎng)素對水產(chǎn)動物的免疫性能、抗病能力起到一定的作用[41]。飼料中較高的脂肪水平，可以通過ROS途徑調(diào)節(jié)凡納濱對蝦Litopenaeusvannamei的生長并增強免疫能力[42]；適量氨基酸水平也能改善草魚幼魚生長性能，減輕腸道炎癥反應，并對魚體的免疫功能和抗氧化功能產(chǎn)生影響[43]。本實驗室前期研究表明，適宜的 VD3添加水平的飼料能提高馬氏珠母貝的免疫力，降低插核手術后育珠貝的死亡率，且適宜的蛋白源飼料也可以增強馬氏珠母貝的抗氧化能力[44]。本研究中，Nrf2在以小球藻粉和玉米蛋白粉為蛋白源組中表達量較低，但在其他蛋白源飼料組中呈現(xiàn)顯著高表達，這與本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)的不同蛋白源飼料組中的抗氧化酶活性和抗氧化基因SOD、GPx、CAT等表達情況一致[15]，由此推測，Nrf2基因在馬氏珠母貝的營養(yǎng)代謝中可能發(fā)揮重要作用，其調(diào)控機理有待深入研究，這對于推進馬氏珠母貝的人工飼料優(yōu)化和優(yōu)質(zhì)品種培育具有重要意義。

4 結論

1)Nrf2基因在馬氏珠母貝的肝胰腺、鰓與腸道組織中高表達，推測該基因在這些器官中參與機體免疫調(diào)節(jié)反應。

2)在LPS、PGN和Poly I：C刺激48 h時馬氏珠母貝鰓中Nrf2基因顯著高表達，進一步說明Nrf2參與馬氏珠母貝的免疫防御功能，但是其具體調(diào)控機制需要進一步驗證。

3)不同蛋白源飼料投喂后馬氏珠母貝鰓中Nrf2的表達量不一，與本實驗室前期對不同蛋白源投喂后抗氧化酶活性與抗氧化基因表達的研究情況一致，提示該基因可能參與到馬氏珠母貝的營養(yǎng)代謝。