NAC調(diào)控HIF-1α抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長的作用研究

謝江濤 蘇永永 吳鵬昌 向毅 王世峰 武興興 姜海濤

(1咸陽市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 咸陽 712000; 2西安交通大學(xué)一附院神經(jīng)外科，陜西 西安 710061)

·論著·

NAC調(diào)控HIF-1α抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長的作用研究

謝江濤1*蘇永永1吳鵬昌1向毅1王世峰1武興興1姜海濤2

(1咸陽市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 咸陽 712000;2西安交通大學(xué)一附院神經(jīng)外科，陜西 西安 710061)

目的研究N-乙酰半胱氨酸(NAC)通過抑制低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)表達，進而抑制SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長的作用研究。方法對照組為常規(guī)培養(yǎng)的SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞，NAC組為常規(guī)培養(yǎng)基礎(chǔ)上加入N-乙酰半胱氨酸，兩組培養(yǎng)48 h后實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶聯(lián)反應(yīng)(RT-PCR)檢測HIF-1αmRNA的表達，四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)檢測SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞儀檢測SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果NAC組HIF-1α mRNA的表達水平明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。MTT檢測SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖情況，NAC組明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。NAC組早期凋亡率、晚期凋亡及壞死率均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。結(jié)論N-乙酰半胱氨酸具有下調(diào)低氧誘導(dǎo)因子-1α表達，進而抑制SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長，加速凋亡的作用。

N-乙酰半胱氨酸; 膠質(zhì)瘤; 低氧誘導(dǎo)因子-1α

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，膠質(zhì)瘤預(yù)后較差及高復(fù)發(fā)率至今仍是困擾神經(jīng)外科的難題，因此積極探索針對膠質(zhì)瘤的治療靶點具有重要的理論及實際意義。膠質(zhì)瘤瘤體的快速增殖使其處于一種相對低氧的狀態(tài)，在這種條件下低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)表達增高，從目前的研究得知HIF-1α可誘導(dǎo)激活多種靶基因表達相應(yīng)的下游產(chǎn)物從而使膠質(zhì)瘤細(xì)胞適應(yīng)低氧應(yīng)激反應(yīng)[1,2]。因此抑制HIF-1α的表達降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞適應(yīng)微環(huán)境從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長有可能成為輔助治療的一個新靶點。N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)是一種典型的外源性抗氧化劑，NAC的作用機制主要是通過細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層進入細(xì)胞質(zhì)后進行乙?；磻?yīng)，具有拮抗氧化應(yīng)激的作用，且研究指出NAC可下調(diào)HIF-1α的表達[3]。本次試驗擬研究NAC通過抑制HIF-1α表達，進而抑制SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長的作用，為研究膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為及治療靶點提供新的思路和理論依據(jù)。

材料與方法

一、主要材料與儀器

膠質(zhì)瘤SHG-44瘤株購于中科院上海細(xì)胞研究所，N-乙酰半胱氨酸購于SIGMA公司，細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于健康元生物醫(yī)藥有限公司，實時熒光定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)試劑盒購于Fermentas公司。流式細(xì)胞分析儀(美國BD FACSCalibur，型號：DICKIN SON)，多重實時熒光定量PCR儀(型號：Bio-Rad iQTM5)等。

二、細(xì)胞系的培養(yǎng)與實驗分組

SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞株采用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液在 37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對照組：常規(guī)培養(yǎng)SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞。NAC組：常規(guī)培養(yǎng)SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞+N-乙酰半胱氨酸(濃度為10 mmol/L，培養(yǎng)48 h)。

三、實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶聯(lián)反應(yīng)(real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測HIF-1α的mRNA表達

兩組到達培養(yǎng)時間后，RNA提取試劑盒(RNAfast200)快速抽提RNA。設(shè)定反應(yīng)條件后置于多重實時熒光定量PCR儀中進行反應(yīng)，反應(yīng)中止后采集實驗數(shù)據(jù)(實時PCR iQTM5專用軟件)，擴增曲線及溶解曲線分析。

四、四甲基偶氮唑鹽比色法(4-dimethylthiahiazo,MTT)檢測細(xì)胞增殖

兩組到達培養(yǎng)時間后，接種于96孔板，每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，孵育4 h，使MTT還原為藍色結(jié)晶物Formazan，吸棄上清加入二甲亞楓(dimethyl sulfoxide,DMSO)150 μl，產(chǎn)物完全溶解，MK3酶標(biāo)儀(波長：492 nm)檢測每孔吸光度(optical density,OD值)并計算各組相對抑制率。

五、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

兩組到達培養(yǎng)時間后，轉(zhuǎn)入10 ml離心管中離心，棄上清后再離心一次并棄上清，每孔加入500 μl的BindingBuffer，加入5 μl細(xì)胞凋亡檢測試劑(Annexin V-FITC)，再加入10 μl Propidium lodide，輕輕混勻后轉(zhuǎn)入1.5 ml EP管中，室溫下避光反應(yīng)15 min。隨后使用流式細(xì)胞儀(488 nm激發(fā)波長530 nm發(fā)射波長)檢測細(xì)胞凋亡。

六、數(shù)據(jù)統(tǒng)計

結(jié) 果

一、RT-PCR檢測HIF-1α的mRNA表達情況

實驗原始數(shù)據(jù)采用比較Ct法2-△△CT(2-△△CT=2-(實驗組目的基因-實驗組參照基因)-(對照組目的基因-對照組參照基因))進行統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)分析NAC組1.07±0.36與對照組0.22±0.06，HIF-1a及β-actin的溶解曲線和擴增曲線(圖1)。對照組及NAC之間進行t檢驗，存在統(tǒng)計學(xué)差異(Plt;0.05)。NAC組HIF-1a的mRNA表達明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。

二、MTT法檢測SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖情況

數(shù)據(jù)采用t檢驗的統(tǒng)計方法分析，Plt;0.05表示存在統(tǒng)計學(xué)差異。NAC組較對照組細(xì)胞的吸光度(OD值)明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。NAC組較對照組相對抑制率明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)(表1)。

三、流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率

數(shù)據(jù)采用流式軟件分析后的原始數(shù)據(jù)表示，數(shù)據(jù)采用χ2檢驗的統(tǒng)計方法分析，Plt;0.05表示存在統(tǒng)計學(xué)差異。對照組及NAC組早期凋亡率、晚期凋亡及壞死率如下表示(表2、圖2)，對照組早期凋亡率、晚期凋亡及壞死率均低于NAC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。

GroupOpticaldensity(mmol/L)Relativeinhibitionrate Controlgroup1．09±0．20?0．14 NACgroup0．89±0．08b0．18c

bPlt;0.05,vscontrol group;cPlt;0.05,vscontrol group.

表2 流式細(xì)胞儀檢測對照組及NAC組細(xì)胞凋亡率
Tab 2 Apoptosis rate between the control group and NAC group detected by flow cytometry

GroupEarlyapoptosisrate(%)Apoptosisandnecrosisrate(%) Controlgroup3．22d16．00e NACgroup9．6618．72

dPlt;0.05,vsNAC group;ePlt;0.05,vsNAC group.

圖1 實時熒光定量PCR的溶解曲線和擴增曲線
Fig 1 Dissolution curve and amplification curve of RT-PCR
A:Amplification curve of HIF-1α; B:Dissolution curve of HIF-1α; C:Amplification curve of β-actin; D:Dissolution curve of β-actin.

圖2 對照組及NAC組的早期凋亡、晚期凋亡及壞死率
Fig 2 The early apoptosis rate,apoptosis and necrosis rate in control group and NAC group
A:Control group; B:NAC group.

討 論

人腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，盡管對于膠質(zhì)瘤的治療采取了積極的手術(shù)切除及術(shù)后放療和化療等綜合治療方法，但膠質(zhì)瘤預(yù)后較差及高復(fù)發(fā)率仍是困擾神經(jīng)外科的難題，因此積極探索針對膠質(zhì)瘤的治療靶點具有重要的理論及實際意義。

膠質(zhì)瘤與其他實體性腫瘤相類似，瘤細(xì)胞因生長失控使其增殖、代謝異常旺盛，其內(nèi)部瘤細(xì)胞總是處于一種相對低氧的狀態(tài)，在這種低氧條件下低氧誘導(dǎo)性因子-1α(HIF-1α)表達明顯增高。HIF-1α在應(yīng)對低氧微環(huán)境時，能調(diào)節(jié)多種涉及低氧應(yīng)激下細(xì)胞適應(yīng)和存活的靶基因，增加其轉(zhuǎn)錄活性并表達相應(yīng)的產(chǎn)物以適應(yīng)低氧應(yīng)激反應(yīng)，從而維持腫瘤的生長、代謝及其侵襲性，使其適應(yīng)缺氧微環(huán)境，因此對HIF-1α的調(diào)控必然成為膠質(zhì)瘤適應(yīng)低氧微環(huán)境的核心點[4]。

腫瘤組織因生長失控，局部的血管系統(tǒng)已經(jīng)不能為快速生長的腫瘤組織提供足夠的氧氣，其內(nèi)部組織細(xì)胞總是處于一種相對低氧的狀態(tài)，腫瘤細(xì)胞在低氧情況下以糖酵解的代謝方式為主，通過抑制線粒體呼吸鏈、降低線粒體的膜電位，因此線粒體有氧呼吸電子轉(zhuǎn)運鏈有可能因受阻而產(chǎn)生活性氧[5]。

活性氧[6]是線粒體的電子轉(zhuǎn)運鏈在運氧過程中電子遺漏，基態(tài)氧通過轉(zhuǎn)運鏈時接受漏出的電子轉(zhuǎn)變的一種氧化應(yīng)激物。腫瘤細(xì)胞在低氧情況下以糖酵解的代謝方式為主，因此線粒體有氧呼吸電子轉(zhuǎn)運鏈有可能因受阻而產(chǎn)生活性氧，已有研究證實NAC可顯著拮抗活性氧氧化應(yīng)激的作用[7]。

NAC是一種典型的外源性抗氧化劑[8]，其作用機制主要是通過N-乙酰半胱氨酸中的巰基基團， 穿過細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層進入細(xì)胞質(zhì)后進行乙酰化反應(yīng)并由N-乙酰半胱氨酸轉(zhuǎn)變成半胱氨酸，而半胱氨酸上的巰基基團是NAC抗氧化作用的活性基團，巰基基團到達作用位點后可結(jié)合活性氧中的超氧陰離子自由基(O2·-)，進而拮抗活性氧氧化應(yīng)激的作用。有研究認(rèn)為NAC可通過拮抗活性氧進而調(diào)控HIF-1α[9,10]。本次實驗中也發(fā)現(xiàn)NAC作用后HIF-1α mRNA的表達水平明顯低于對照組，進一步驗證了這一觀點。

通過本實驗的研究明確NAC具有下調(diào)HIF-1α表達，進而抑制SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長，加速凋亡的作用。提示抑制HIF-1α的表達降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞適應(yīng)微環(huán)境從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長有可能成為輔助治療的一個新靶點。本實驗為抗氧化劑NAC輔助治療膠質(zhì)瘤提供了新的思路和理論依據(jù)，為進一步研究抗氧化劑在膠質(zhì)瘤的輔助治療中的應(yīng)用打下了一定的基礎(chǔ)。

1Huimin Lu,Yan Li,M Shu,et al. Hypoxia-inducible factor-1a blocks differentiation of malignant gliomas [J]. J FEBS,2009,276(24):7291-7304.

2唐彬秩,趙鳳艷,屈藝,等. 低氧誘導(dǎo)因子-1α:調(diào)節(jié)腫瘤生物學(xué)行為的關(guān)鍵因子 [J]. 生命的化學(xué),2009,29(2):184-188.

3Tajima M,Kurashima Y,Sugiyama K,et al. The redox state of glutathione regulates the hypoxic induction of HIF-1 [J]. Eur J Pharmacol,2009,606(1-3):45 -49.

4Yee Koh M,Spivak-Kroizman TR,Powis G,et al. HIF-1 regulation:not so easy come easy go [J]. Trends Biochem Sci,2008,33(11):526-534.

5Shen SC,Wu MS,Lin HY,et al. Reactive oxygen species-dependent nitric oxide production in reciprocal interactions of glioma and microglial cells [J]. J Cell Physiol,2014,229(12):2015-2026.

6Hamanaka RB,Chandel NS. Mitochondrial reactive oxygen species regulate hypoxic signaling [J]. Cell Biology,2009,21(15):894-899.

7Spagnuolo G,D'Anto V,Cosentino C,et al. Effect of N-acetyl-L-cysteine on ROS production and cell death caused by HEMA in human primary gingival broblasts [J]. Biomaterials,2006,12(7):1803-1809.

8Tajima M,Kurashima Y,Sugiyama K,et al. The redox state of glutathione regulates the hypoxic induction of HIF-1 [J]. Eur J Pharmacology,2009,606(1-3):45-49.

9Galanis A,Pappa A,Giannakakis A,et al. Reactive oxygen species and HIF-1 signalling in cancer [J]. Cancer Letter,2008,266(1):12-20.

10Ganguli A,Choudhury D,Datta S,et al. Inhibition of autophagy by chloroquine potentiates synergistically anti-cancer property of artemisinin by promoting ROS dependent apoptosis [J]. Biochimie,2014,107(Pt B):338-349.

NACregulatingHIF-1αinhibitsthegrowthofgliomacells

XIEJiangtao1,SUYongyong1,WUPengchang1,XIANGYi1,WANGShifeng1,WUXingxing1,JIANGHaitao2

1DepartmentofNeurosurgery,XianyangCentralHospital,Xianyang712000;2DepartmentofNeurosurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofXi'anJiaotongUniversity,Xi'an710061,China

ObjectiveThe N-acetyl-L-cysteine (NAC) inhibits the expression hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) and further inhibits the growth of SHG-44 glioma cells.MethodsSHG-44 glioma cells for conventional culture was control group. N-acetyl-L-cysteine was added in NAC group. The mRNA expressions of HIF-1α was detected by RT-PCR after 48 h; 4-dimethylthiahiazo (MTT) detection was used to test the proliferation of SHG-44 glioma cells and the apoptosis of SHG-44 glioma cells was detected by flow cytometry method.ResultsThe expression of HIF-1α mRNA in NAC group was significantly lower than that in the control group (Plt;0.05). The proliferation of SHG-44 glioma cells was detected by MTT assay,and the proliferation in the NAC group was significantly lower than that of the control group (Plt;0.05). The early apoptosis rate,apoptosis and necrosis rate in NAC group were significantly higher than those in control group (Plt;0.05).ConclusionNAC could down-regulate the expression of HIF-1α,which could accordingly inhibit the growth of SHG-44 glioma cells and accelerate the apoptosis.

N-acetyl-L-cysteine; Glioma; Hypoxia-inducible factor-1α

1671-2897(2016)15-321-04

R 739.41

A

謝江濤，碩士，主治醫(yī)師，E-mail：Jack.198376@163.com

*通訊作者：謝江濤，碩士，主治醫(yī)師，E-mail：Jack.198376@163.com

2015-07-20；

2016-01-10)