紫外分光光度法對催情助孕液中總黃酮含量的測定

王東升，張世棟（等）

摘要：采用紫外分光光度法測定催情助孕液中總黃酮的含量。以淫羊藿苷為對照品，甲醇作空白對照，在270 nm處測定其吸光度，計算總黃酮含量。結(jié)果表明，淫羊藿苷在1.68～10.08 ？滋g/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 5，總黃酮平均回收率為99.29%，RSD為1.20%。催情助孕液中總黃酮含量為1.317 9%。采用紫外分光光度法測定催情助孕液中總黃酮的含量，操作快速、簡便、準(zhǔn)確，適用于催情助孕液中總黃酮含量的測定。

關(guān)鍵詞：催情助孕液；總黃酮；含量；紫外分光光度法

中圖分類號：O657.32；S853.73 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）07-1660-03

Determining the Content of Total Flavonoids in Cuiqingzhuyun Solution with Ultraviolet Spectrometry

WANG Dong-sheng， ZHANG Shi-dong， MIAO Xiao-lou， DONG Shu-wei，YAN Zuo-ting

（Key Laboratory of Veterinary Pharmaceutical Development， Ministry of Agriculture/Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Sciences of CAAS/ Engineering & Technology Research Center of Traditional Chinese Veterinary Medicine of Gansu Province/Key Laboratory of New Animal Drug Project of Gansu Province， Lanzhou 730050， China）

Abstract： To determine the content of total flavonoids in Cuiqingzhuyun solution，icariin was used as standard solution and methanol was used as blank solution to measure the absorbance of the sample solution at 270 nm with UV spectophotometry. The results showed that the linear range for the content of icariin was 1.68～10.08 ？滋g/mL with the correlation coefficient of 0.999 5. The average recovery of total flavonoids was 99.29% and RSD was 1.20%. The content of total flavonids of Cuiqingzhuyun solution was 1.317 9%. It is indicated that method of determining of total flavonoids in Cuiqingzhuyun solution with UV spectrophotometry was rapid， accurate， convenient and practical.

Key words： Cuiqingzhuyun liquid； total flavonoids； content； UV spectrophotometry

催情助孕液是由淫羊藿、陽起石、丹參等中藥制成的純中藥子宮灌注劑，臨床上主要用于治療奶牛卵巢靜止和持久黃體。據(jù)報道，催情助孕液治療奶牛卵巢靜止和持久黃體的總有效率達(dá)100%，治愈率達(dá)94%，治療奶牛持久黃體、卵巢靜止和卵巢囊腫后，平均發(fā)情率為99.4%，受孕率為81.5%[1，2]。有研究已對該制劑進(jìn)行了工藝優(yōu)化，并對淫羊藿苷含量測定等方面進(jìn)行了報道，但方法較為復(fù)雜[3-4]。淫羊藿苷為催情助孕液的主藥，總黃酮是淫羊藿苷的主要活性成分，對總黃酮進(jìn)行含量測定可以更好地控制催情助孕液的質(zhì)量。為此，本試驗建立了催情助孕液中總黃酮含量的測定方法，并對制劑中的總黃酮含量進(jìn)行了測定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UV-BlueStar Plus型紫外-可見分光光度計（北京萊伯泰科儀器有限公司）；AUW120D型分析天平（日本島津公司）；LD550型多管架自動平衡離心機（湘儀離心機儀器有限公司）；Eppendorf移液器（德國Eppendorf公司）；KQ-250型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。甲醇（分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）。淫羊藿苷對照品（批號：110737-200414，中國藥品生物制品檢定所）。催情助孕液（實驗室配制）、去離子水。

1.2 方法

1.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取淫羊藿苷對照品0.42 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，即得16.8 ？滋g/mL淫羊藿苷對照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備 精密吸取催情助孕液2 mL，置50 mL量瓶中，加60%乙醇至刻度，超聲處理15 min，精密吸取0.5 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 ？滋m微孔濾膜濾過，即得。

1.2.3 測定波長的選擇 吸取淫羊藿苷對照品溶液，以甲醇作空白對照，在190～400 nm內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液1、2、3、4、5、6 mL，分別置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，以甲醇作空白對照，在270 nm處測定吸光度。以吸光度A對淫羊藿苷濃度C（μg/mL）進(jìn)行線性回歸分析。

1.2.5 精密度試驗 精密吸取對照品溶液3 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，以甲醇作空白對照，在270 nm處測定吸光度，連續(xù)測定5次，計算平均吸光度及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取催情助孕液2 mL，按“1.2.2”方法制成供試品溶液，以甲醇作空白對照，在270 nm處測定吸光度，每小時測一次，連續(xù)測定9次，記錄測定結(jié)果，計算平均吸光度及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.7 重復(fù)性試驗 精密吸取同批催情助孕液5份，每份2 mL，按“1.2.2”方法制成供試品溶液，以甲醇作空白對照，在270 nm處測定吸光度，計算樣品的平均含量及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.8 加樣回收率試驗 精密吸取5份總黃酮含量為1.319 0%的催情助孕液0.2 mL，各加入一定量的淫羊藿苷，置5 mL容量瓶中，加60%乙醇至刻度，超聲處理15 min，精密吸取0.5 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 ？滋m微孔濾膜濾過，以甲醇作空白對照，在270 nm處測定吸光度，計算回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.9 樣品總黃酮含量測定 精密吸取不同批次的催情助孕液5份，每份2 mL，按“1.2.2”方法制備樣品供試液，以甲醇作空白對照，在270 nm處測定吸光度，計算樣品中總黃酮含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 測定波長

淫羊藿苷波長掃描結(jié)果見圖1，淫羊藿苷在270 nm處有最大吸收峰，從而確定測定波長為270 nm。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以淫羊藿苷對照品溶液濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸分析，得回歸方程為A = 0.036 5C -0.008 2，R2 = 0.999 5。說明淫羊藿苷在1.68～10.08 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，結(jié)果見圖2。

2.3 精密度試驗結(jié)果

5次測定的吸光度平均值為0.175 04，RSD為0.24%，表明儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

9次測定的吸光度平均值為0.184 74，RSD為1.09%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)性試驗結(jié)果

5份樣品的平均含量為1.319 3%，RSD為0.16%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 加樣回收率試驗結(jié)果

加樣回收率試驗結(jié)果見表1。由表1可見，平均回收率為99.29%，RSD為1.20%。表明該方法準(zhǔn)確性良好。

2.7 樣品總黃酮含量測定結(jié)果

催情助孕液中平均總黃酮含量為1.317 9%。結(jié)果見表2。

3 小結(jié)與討論

總黃酮是淫羊藿苷的主要有效成分，對免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)精神系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)等的疾病均有一定治療作用[5]，常將淫羊霍苷中總黃酮含量作為評價其質(zhì)量和提取分離工藝的指標(biāo)[6]。總黃酮為淫羊藿苷的主要有效成分[7]，淫羊藿苷中總黃酮含量的測定方法多采用紫外分光光度法，以淫羊藿苷為指標(biāo)測定總黃酮含量的方法操作簡便、快速、結(jié)果準(zhǔn)確，為2010版《中國藥典》所載方法[8]。本試驗將淫羊藿苷對照品的甲醇溶液在波長190～400 nm進(jìn)行掃描，結(jié)果在270 nm處檢測到有最大吸收峰。因此，選擇以淫羊藿苷為指標(biāo)性成分，在270 nm波長處進(jìn)行了催情助孕液中總黃酮的含量測定。結(jié)果表明，淫羊藿苷在1.68～10.08 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，試驗建立的方法操作快速、簡便、重復(fù)性和穩(wěn)定性好，測定結(jié)果準(zhǔn)確，適用于催情助孕液中總黃酮含量的測定。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王東才.中藥催情助孕液治療奶牛卵巢性不孕癥[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2004（3）：34-35.

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[7] 黃秀蘭，周亞偉，王 偉. 淫羊藿黃酮類化合物藥理研究進(jìn)展[J].中成藥，2005，27（6）：719-721.

[8] 王東升，張世棟，李世宏，等.淫羊藿總黃酮提取方法的比較研

究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)（科技版），2012（7）：75-77.

1.2.5 精密度試驗 精密吸取對照品溶液3 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，以甲醇作空白對照，在270 nm處測定吸光度，連續(xù)測定5次，計算平均吸光度及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取催情助孕液2 mL，按“1.2.2”方法制成供試品溶液，以甲醇作空白對照，在270 nm處測定吸光度，每小時測一次，連續(xù)測定9次，記錄測定結(jié)果，計算平均吸光度及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.7 重復(fù)性試驗 精密吸取同批催情助孕液5份，每份2 mL，按“1.2.2”方法制成供試品溶液，以甲醇作空白對照，在270 nm處測定吸光度，計算樣品的平均含量及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.8 加樣回收率試驗 精密吸取5份總黃酮含量為1.319 0%的催情助孕液0.2 mL，各加入一定量的淫羊藿苷，置5 mL容量瓶中，加60%乙醇至刻度，超聲處理15 min，精密吸取0.5 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 ？滋m微孔濾膜濾過，以甲醇作空白對照，在270 nm處測定吸光度，計算回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.9 樣品總黃酮含量測定 精密吸取不同批次的催情助孕液5份，每份2 mL，按“1.2.2”方法制備樣品供試液，以甲醇作空白對照，在270 nm處測定吸光度，計算樣品中總黃酮含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 測定波長

淫羊藿苷波長掃描結(jié)果見圖1，淫羊藿苷在270 nm處有最大吸收峰，從而確定測定波長為270 nm。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以淫羊藿苷對照品溶液濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸分析，得回歸方程為A = 0.036 5C -0.008 2，R2 = 0.999 5。說明淫羊藿苷在1.68～10.08 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，結(jié)果見圖2。

2.3 精密度試驗結(jié)果

5次測定的吸光度平均值為0.175 04，RSD為0.24%，表明儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

9次測定的吸光度平均值為0.184 74，RSD為1.09%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)性試驗結(jié)果

5份樣品的平均含量為1.319 3%，RSD為0.16%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 加樣回收率試驗結(jié)果

加樣回收率試驗結(jié)果見表1。由表1可見，平均回收率為99.29%，RSD為1.20%。表明該方法準(zhǔn)確性良好。

2.7 樣品總黃酮含量測定結(jié)果

催情助孕液中平均總黃酮含量為1.317 9%。結(jié)果見表2。

3 小結(jié)與討論

總黃酮是淫羊藿苷的主要有效成分，對免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)精神系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)等的疾病均有一定治療作用[5]，常將淫羊霍苷中總黃酮含量作為評價其質(zhì)量和提取分離工藝的指標(biāo)[6]。總黃酮為淫羊藿苷的主要有效成分[7]，淫羊藿苷中總黃酮含量的測定方法多采用紫外分光光度法，以淫羊藿苷為指標(biāo)測定總黃酮含量的方法操作簡便、快速、結(jié)果準(zhǔn)確，為2010版《中國藥典》所載方法[8]。本試驗將淫羊藿苷對照品的甲醇溶液在波長190～400 nm進(jìn)行掃描，結(jié)果在270 nm處檢測到有最大吸收峰。因此，選擇以淫羊藿苷為指標(biāo)性成分，在270 nm波長處進(jìn)行了催情助孕液中總黃酮的含量測定。結(jié)果表明，淫羊藿苷在1.68～10.08 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，試驗建立的方法操作快速、簡便、重復(fù)性和穩(wěn)定性好，測定結(jié)果準(zhǔn)確，適用于催情助孕液中總黃酮含量的測定。

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[8] 王東升，張世棟，李世宏，等.淫羊藿總黃酮提取方法的比較研

究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)（科技版），2012（7）：75-77.

1.2.5 精密度試驗 精密吸取對照品溶液3 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，以甲醇作空白對照，在270 nm處測定吸光度，連續(xù)測定5次，計算平均吸光度及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取催情助孕液2 mL，按“1.2.2”方法制成供試品溶液，以甲醇作空白對照，在270 nm處測定吸光度，每小時測一次，連續(xù)測定9次，記錄測定結(jié)果，計算平均吸光度及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.7 重復(fù)性試驗 精密吸取同批催情助孕液5份，每份2 mL，按“1.2.2”方法制成供試品溶液，以甲醇作空白對照，在270 nm處測定吸光度，計算樣品的平均含量及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.8 加樣回收率試驗 精密吸取5份總黃酮含量為1.319 0%的催情助孕液0.2 mL，各加入一定量的淫羊藿苷，置5 mL容量瓶中，加60%乙醇至刻度，超聲處理15 min，精密吸取0.5 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 ？滋m微孔濾膜濾過，以甲醇作空白對照，在270 nm處測定吸光度，計算回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.9 樣品總黃酮含量測定 精密吸取不同批次的催情助孕液5份，每份2 mL，按“1.2.2”方法制備樣品供試液，以甲醇作空白對照，在270 nm處測定吸光度，計算樣品中總黃酮含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 測定波長

淫羊藿苷波長掃描結(jié)果見圖1，淫羊藿苷在270 nm處有最大吸收峰，從而確定測定波長為270 nm。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以淫羊藿苷對照品溶液濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸分析，得回歸方程為A = 0.036 5C -0.008 2，R2 = 0.999 5。說明淫羊藿苷在1.68～10.08 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，結(jié)果見圖2。

2.3 精密度試驗結(jié)果

5次測定的吸光度平均值為0.175 04，RSD為0.24%，表明儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

9次測定的吸光度平均值為0.184 74，RSD為1.09%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)性試驗結(jié)果

5份樣品的平均含量為1.319 3%，RSD為0.16%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 加樣回收率試驗結(jié)果

加樣回收率試驗結(jié)果見表1。由表1可見，平均回收率為99.29%，RSD為1.20%。表明該方法準(zhǔn)確性良好。

2.7 樣品總黃酮含量測定結(jié)果

催情助孕液中平均總黃酮含量為1.317 9%。結(jié)果見表2。

3 小結(jié)與討論

總黃酮是淫羊藿苷的主要有效成分，對免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)精神系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)等的疾病均有一定治療作用[5]，常將淫羊霍苷中總黃酮含量作為評價其質(zhì)量和提取分離工藝的指標(biāo)[6]?？傸S酮為淫羊藿苷的主要有效成分[7]，淫羊藿苷中總黃酮含量的測定方法多采用紫外分光光度法，以淫羊藿苷為指標(biāo)測定總黃酮含量的方法操作簡便、快速、結(jié)果準(zhǔn)確，為2010版《中國藥典》所載方法[8]。本試驗將淫羊藿苷對照品的甲醇溶液在波長190～400 nm進(jìn)行掃描，結(jié)果在270 nm處檢測到有最大吸收峰。因此，選擇以淫羊藿苷為指標(biāo)性成分，在270 nm波長處進(jìn)行了催情助孕液中總黃酮的含量測定。結(jié)果表明，淫羊藿苷在1.68～10.08 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，試驗建立的方法操作快速、簡便、重復(fù)性和穩(wěn)定性好，測定結(jié)果準(zhǔn)確，適用于催情助孕液中總黃酮含量的測定。

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