拮抗農業(yè)致病菌放線菌G5發(fā)酵條件的優(yōu)化

劉楊，王勇（等）

摘要：微生物的發(fā)酵過程十分復雜，培養(yǎng)基配方的組成以及培養(yǎng)條件的變化都會對菌體的代謝造成很大的影響。為了使抗生素的產量達到最大化，試驗運用了Plackett-Burman試驗設計、最陡爬坡試驗、Box-Behnken試驗設計對放線菌（Actinomycetes）G5進行了發(fā)酵條件優(yōu)化。利用Plackett-Burman試驗設計對影響放線菌G5發(fā)酵的諸多相關因素進行評估并篩選出3個主要因素，即碳源含量、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間；之后根據3個主要因素的作用大小和方向進行了最陡爬坡試驗；最后運用Box-Behnken試驗設計確定最優(yōu)值，得出其最優(yōu)培養(yǎng)條件為淀粉含量21.66 g/L、培養(yǎng)溫度27.70 ℃、培養(yǎng)時間7.75 d。在此條件下，抗生素對蘋果輪紋病菌的抑菌圈直徑為23.00 mm，與模型預測值基本一致。

關鍵詞：放線菌（Actinomycetes）G5；Plackett-Burman試驗設計；最陡爬坡試驗；Box-Behnken試驗設計；發(fā)酵條件優(yōu)化

中圖分類號：TQ458 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）07-1634-03

Optimization of Fermentation Conditions for Actinomycetes G5

LIU Yang， WANG Yong， KANG Jing-qin， ZHANG Liang

（University of Science and Technology Liaoning， Anshan 114044， Liaoning，China）

Abstract：Microbial fermentation process were very complex due to effects of culture medium composition and culture conditions on cell metabolism. Fermentation conditions for actinomycetes G5 were optimized with Plackett-Burman experimental design， steepest ascent experiments， and Box-Behnken design. Three main factors affecting the fermentation of actinomycetes G5 screened by Plackeet-Burman design were carbon content， temperature and culture days. Then the steepest ascent experiments were conducted based on the action degree and direction of the three main factors. The optimal conditions were finally determined by Box-Behnken design. The results showed that the optimal fermentation condition for actinomycetes G5 were starch content of 21.66 g/L， culture temperature of 27.70 ℃ and culture days of 7.75 d. Under these conditions， the bacterial inhibition diameter of the acquired antibiotics against physalospora piricola was 23.00 mm， equal to the model prediction.

Key words： Actinomycetes G5； Plackett-Burman design； steepest ascent experiment； Box-Behnken； optimization

放線菌（Actinomycetes）G5的次級代謝產物抗生素對蘋果輪紋病菌（Physalospora piricola）、黃瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）等多種農業(yè)致病菌有較強的抑制作用[1]。在對放線菌G5的發(fā)酵過程中，液體培養(yǎng)基的配方和培養(yǎng)條件對抗生素的產量都有明顯的影響[2]，因而發(fā)酵條件的優(yōu)化工作就顯得尤為重要。本試驗運用響應面法對放線菌G5的發(fā)酵條件進行全面優(yōu)化，以確?？股氐漠a量達到最大。響應面法是利用簡潔精確的試驗設計，采用多元二次回歸方程擬合因素和響應值之間的函數關系，通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)條件參數，解決多變量問題的統(tǒng)計方法[3]。本試驗運用響應面法中的Plackett-Burman設計、最陡爬坡試驗、Box-Behnken設計來優(yōu)化放線菌G5的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件。應用Design-Expert.V.8.0.6軟件對試驗數據進行處理，獲得了回歸方程，效果顯著[4]。

1 試驗材料與方法

1.1 供試材料

放線菌G5及蘋果輪紋病菌均為遼寧科技大學微生物實驗室保藏菌種。

1.2 試驗方法

1.2.1 Plackett-Burman試驗設計 本試驗考察高氏1號培養(yǎng)基中的碳源（淀粉）、氮源（KNO3）以及培養(yǎng)條件中的培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、接種量和裝液量對發(fā)酵液中抗生素產量的影響，各因素分別取“-1”、“1”兩個水平，具體見表1。以抗生素對蘋果輪紋病菌的抑菌圈大?。ㄖ睆?，mm）作為檢測指標（濾紙片法）[5]。最終得出對抗生素產量影響最大的3個主要因素[6]。

1.2.2 最陡爬坡試驗 根據“1.2.1”試驗的結果確定最陡爬坡試驗的爬坡方向和各因素效應值的大小，確定變化步長，快速逼近最優(yōu)區(qū)域[7]。

1.2.3 Box-Behnken試驗設計 對試驗數據采用多元二次方程來擬合因素和響應面值之間的函數關系，通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)提取條件，確定最優(yōu)值。

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗設計結果

表2為Design-Expert.V.8.0.6軟件設計的12組試驗，再利用濾紙片抑菌法得到響應值D。用SPSS軟件處理表2中的數據，得到各因素的主要效應及其顯著性（表3）。

當P<0.05時影響顯著，P<0.01時影響極顯著。由表3可知，培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間對發(fā)酵液中抗生素產量的影響為顯著，淀粉含量對發(fā)酵液中抗生素產量的影響為極顯著。所以可以將對發(fā)酵液中抗生素產量影響不顯著的因素控制在一個較好的水平上，選擇3個影響顯著的因素做進一步的響應面試驗。

2.2 最陡爬坡試驗結果

由Plackett-Burman試驗可知，放線菌G5發(fā)酵條件中淀粉含量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間3個因素對抗生素的產量有顯著影響，其中淀粉含量和培養(yǎng)時間有顯著的正效應，應增加；培養(yǎng)溫度有顯著的負效應，應減少。根據3個因素效應大小的比例設定其變化方向及步長進行試驗[4]。

由表4可知，第3組的試驗效果最好，所以以第3組試驗各因素的水平作為中心點。

2.3 Box-Behnken試驗設計及結果

根據Plackett-Burman試驗和最陡爬坡試驗來確定Box-Behnken試驗的因素和水平。具體見表5。

根據Box-Behnken的中心組合設計原理，進一步進行3因素3水平的響應曲面分析試驗，共進行17組試驗，其結果見表6。17個試驗點可分為兩類，其一是析因點，自變量取值在3因素的各自水平所構成的三維定點，共有12個析因點；其二是零點，為區(qū)域的中心點。零點試驗重復5次，用以估計試驗誤差。對其試驗結果進行分析，其結果見表7。

由表7可知，模型P值小于0.01，為極顯著，失擬項P值為0.140 2，不顯著?；貧w方程的R2為0.966 9，調整后的R2為0.924 3，均大于0.8，表明其對模型擬合的可靠性。利用Design-Expert.V.8.0.6軟件處理數據得回歸方程：

D=21.93-0.92X1-0.29X2-0.21X3+0.16X1X2-0.25 X2X3-1.92X12-1.01X22-0.51X32

根據回歸方程做出響應曲面分析，其結果見圖1至圖3。

從圖1至圖3中可以看出，D值的大小隨著兩個因素值的增加呈先升高后降低的趨勢，說明各交互因子均有一個最佳組合使D值達到最大。為了求得最佳值，將擬合方程式分別對各自變量求偏導等于零。得到如下方程式：

-0.92+0.16X2-3.84X1=0

-0.29+0.16X1-0.25X3-2.02X2=0

-0.21-0.25X2-1.02X3=0

從而求得X1=-0.25，X2=-0.15，X3=-0.17，經換算得到各因素實際對應水平為：淀粉含量X1=21.66 g/L，培養(yǎng)溫度X2=27.70 ℃，培養(yǎng)時間X3=7.75 d。即當淀粉含量為21.66 g/L、培養(yǎng)溫度為27.70 ℃、培養(yǎng)時間為7.75 d時，回歸方程預測得D值為22.67 mm。經過驗證試驗，在上述條件下D值為23.00 mm。

3 小結與討論

本試驗運用了響應面法中的Plackett-Burman試驗設計、最陡爬坡試驗、Box-Behnken試驗設計來優(yōu)化放線菌G5的發(fā)酵條件。利用Plackett-Burman試驗設計來確定主效應因子為淀粉含量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)天數。利用最陡爬坡試驗來確定3個主效因子的變化方向和步長，Box-Behnken試驗則用于確定最優(yōu)值，得出其最優(yōu)條件為淀粉含量21.66 g/L、培養(yǎng)溫度27.70 ℃、培養(yǎng)時間7.75 d。模型預測的D值為22.67 mm，經驗證結果為23.00 mm。結果表明模型預測與試驗驗證結果基本一致，用該模型可以合理、有效地預測D值。

參考文獻：

[1] 李 晶，安德榮，劉翠娟，等.放線菌S-159-05抑菌活性物質的初步研究[J].科技與開發(fā)，2007，46（11）：755-757.

[2] 李淑彬，楊勁松，劉 陽，等.抗真菌抗生素高產菌株的推理選育及其發(fā)酵調控研究[J].中山大學學報，2001，40（4）：13-16.

[3] 郝學財，余曉斌，劉志鈺，等.響應面法在優(yōu)化微生物培養(yǎng)基中的應用[J].食品研究與開發(fā)，2006，27（1）：38-41.

[4] 陳秉梅，侯志國，李忠琴，等.基于SAS9.1的芽孢桿菌發(fā)酵條件優(yōu)化[J].計算機與應用化學，2011，28（5）：575-579.

[5] 蘇 偉，趙 利，劉建濤，等.黃精多糖抑菌及抗氧化性能研究[J].食品科學，2007，28（8）：55-57.

[6] 肖懷秋，李玉珍.海金沙草總黃酮提取工藝的響應面優(yōu)化[J].氨基酸和生物資源，2010，34（8）：68-72.

[7] DAVIES O L.The Design and Analysis of Industrial Experiments[M]. New York：Hafner Publishing Company，1967.

1.2.2 最陡爬坡試驗 根據“1.2.1”試驗的結果確定最陡爬坡試驗的爬坡方向和各因素效應值的大小，確定變化步長，快速逼近最優(yōu)區(qū)域[7]。

1.2.3 Box-Behnken試驗設計 對試驗數據采用多元二次方程來擬合因素和響應面值之間的函數關系，通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)提取條件，確定最優(yōu)值。

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗設計結果

表2為Design-Expert.V.8.0.6軟件設計的12組試驗，再利用濾紙片抑菌法得到響應值D。用SPSS軟件處理表2中的數據，得到各因素的主要效應及其顯著性（表3）。

當P<0.05時影響顯著，P<0.01時影響極顯著。由表3可知，培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間對發(fā)酵液中抗生素產量的影響為顯著，淀粉含量對發(fā)酵液中抗生素產量的影響為極顯著。所以可以將對發(fā)酵液中抗生素產量影響不顯著的因素控制在一個較好的水平上，選擇3個影響顯著的因素做進一步的響應面試驗。

2.2 最陡爬坡試驗結果

由Plackett-Burman試驗可知，放線菌G5發(fā)酵條件中淀粉含量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間3個因素對抗生素的產量有顯著影響，其中淀粉含量和培養(yǎng)時間有顯著的正效應，應增加；培養(yǎng)溫度有顯著的負效應，應減少。根據3個因素效應大小的比例設定其變化方向及步長進行試驗[4]。

由表4可知，第3組的試驗效果最好，所以以第3組試驗各因素的水平作為中心點。

2.3 Box-Behnken試驗設計及結果

根據Plackett-Burman試驗和最陡爬坡試驗來確定Box-Behnken試驗的因素和水平。具體見表5。

根據Box-Behnken的中心組合設計原理，進一步進行3因素3水平的響應曲面分析試驗，共進行17組試驗，其結果見表6。17個試驗點可分為兩類，其一是析因點，自變量取值在3因素的各自水平所構成的三維定點，共有12個析因點；其二是零點，為區(qū)域的中心點。零點試驗重復5次，用以估計試驗誤差。對其試驗結果進行分析，其結果見表7。

由表7可知，模型P值小于0.01，為極顯著，失擬項P值為0.140 2，不顯著?；貧w方程的R2為0.966 9，調整后的R2為0.924 3，均大于0.8，表明其對模型擬合的可靠性。利用Design-Expert.V.8.0.6軟件處理數據得回歸方程：

D=21.93-0.92X1-0.29X2-0.21X3+0.16X1X2-0.25 X2X3-1.92X12-1.01X22-0.51X32

根據回歸方程做出響應曲面分析，其結果見圖1至圖3。

從圖1至圖3中可以看出，D值的大小隨著兩個因素值的增加呈先升高后降低的趨勢，說明各交互因子均有一個最佳組合使D值達到最大。為了求得最佳值，將擬合方程式分別對各自變量求偏導等于零。得到如下方程式：

-0.92+0.16X2-3.84X1=0

-0.29+0.16X1-0.25X3-2.02X2=0

-0.21-0.25X2-1.02X3=0

從而求得X1=-0.25，X2=-0.15，X3=-0.17，經換算得到各因素實際對應水平為：淀粉含量X1=21.66 g/L，培養(yǎng)溫度X2=27.70 ℃，培養(yǎng)時間X3=7.75 d。即當淀粉含量為21.66 g/L、培養(yǎng)溫度為27.70 ℃、培養(yǎng)時間為7.75 d時，回歸方程預測得D值為22.67 mm。經過驗證試驗，在上述條件下D值為23.00 mm。

3 小結與討論

本試驗運用了響應面法中的Plackett-Burman試驗設計、最陡爬坡試驗、Box-Behnken試驗設計來優(yōu)化放線菌G5的發(fā)酵條件。利用Plackett-Burman試驗設計來確定主效應因子為淀粉含量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)天數。利用最陡爬坡試驗來確定3個主效因子的變化方向和步長，Box-Behnken試驗則用于確定最優(yōu)值，得出其最優(yōu)條件為淀粉含量21.66 g/L、培養(yǎng)溫度27.70 ℃、培養(yǎng)時間7.75 d。模型預測的D值為22.67 mm，經驗證結果為23.00 mm。結果表明模型預測與試驗驗證結果基本一致，用該模型可以合理、有效地預測D值。

參考文獻：

[1] 李 晶，安德榮，劉翠娟，等.放線菌S-159-05抑菌活性物質的初步研究[J].科技與開發(fā)，2007，46（11）：755-757.

[2] 李淑彬，楊勁松，劉 陽，等.抗真菌抗生素高產菌株的推理選育及其發(fā)酵調控研究[J].中山大學學報，2001，40（4）：13-16.

[3] 郝學財，余曉斌，劉志鈺，等.響應面法在優(yōu)化微生物培養(yǎng)基中的應用[J].食品研究與開發(fā)，2006，27（1）：38-41.

[4] 陳秉梅，侯志國，李忠琴，等.基于SAS9.1的芽孢桿菌發(fā)酵條件優(yōu)化[J].計算機與應用化學，2011，28（5）：575-579.

[5] 蘇 偉，趙 利，劉建濤，等.黃精多糖抑菌及抗氧化性能研究[J].食品科學，2007，28（8）：55-57.

[6] 肖懷秋，李玉珍.海金沙草總黃酮提取工藝的響應面優(yōu)化[J].氨基酸和生物資源，2010，34（8）：68-72.

[7] DAVIES O L.The Design and Analysis of Industrial Experiments[M]. New York：Hafner Publishing Company，1967.

1.2.2 最陡爬坡試驗 根據“1.2.1”試驗的結果確定最陡爬坡試驗的爬坡方向和各因素效應值的大小，確定變化步長，快速逼近最優(yōu)區(qū)域[7]。

1.2.3 Box-Behnken試驗設計 對試驗數據采用多元二次方程來擬合因素和響應面值之間的函數關系，通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)提取條件，確定最優(yōu)值。

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗設計結果

表2為Design-Expert.V.8.0.6軟件設計的12組試驗，再利用濾紙片抑菌法得到響應值D。用SPSS軟件處理表2中的數據，得到各因素的主要效應及其顯著性（表3）。

當P<0.05時影響顯著，P<0.01時影響極顯著。由表3可知，培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間對發(fā)酵液中抗生素產量的影響為顯著，淀粉含量對發(fā)酵液中抗生素產量的影響為極顯著。所以可以將對發(fā)酵液中抗生素產量影響不顯著的因素控制在一個較好的水平上，選擇3個影響顯著的因素做進一步的響應面試驗。

2.2 最陡爬坡試驗結果

由Plackett-Burman試驗可知，放線菌G5發(fā)酵條件中淀粉含量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間3個因素對抗生素的產量有顯著影響，其中淀粉含量和培養(yǎng)時間有顯著的正效應，應增加；培養(yǎng)溫度有顯著的負效應，應減少。根據3個因素效應大小的比例設定其變化方向及步長進行試驗[4]。

由表4可知，第3組的試驗效果最好，所以以第3組試驗各因素的水平作為中心點。

2.3 Box-Behnken試驗設計及結果

根據Plackett-Burman試驗和最陡爬坡試驗來確定Box-Behnken試驗的因素和水平。具體見表5。

根據Box-Behnken的中心組合設計原理，進一步進行3因素3水平的響應曲面分析試驗，共進行17組試驗，其結果見表6。17個試驗點可分為兩類，其一是析因點，自變量取值在3因素的各自水平所構成的三維定點，共有12個析因點；其二是零點，為區(qū)域的中心點。零點試驗重復5次，用以估計試驗誤差。對其試驗結果進行分析，其結果見表7。

由表7可知，模型P值小于0.01，為極顯著，失擬項P值為0.140 2，不顯著?；貧w方程的R2為0.966 9，調整后的R2為0.924 3，均大于0.8，表明其對模型擬合的可靠性。利用Design-Expert.V.8.0.6軟件處理數據得回歸方程：

D=21.93-0.92X1-0.29X2-0.21X3+0.16X1X2-0.25 X2X3-1.92X12-1.01X22-0.51X32

根據回歸方程做出響應曲面分析，其結果見圖1至圖3。

從圖1至圖3中可以看出，D值的大小隨著兩個因素值的增加呈先升高后降低的趨勢，說明各交互因子均有一個最佳組合使D值達到最大。為了求得最佳值，將擬合方程式分別對各自變量求偏導等于零。得到如下方程式：

-0.92+0.16X2-3.84X1=0

-0.29+0.16X1-0.25X3-2.02X2=0

-0.21-0.25X2-1.02X3=0

從而求得X1=-0.25，X2=-0.15，X3=-0.17，經換算得到各因素實際對應水平為：淀粉含量X1=21.66 g/L，培養(yǎng)溫度X2=27.70 ℃，培養(yǎng)時間X3=7.75 d。即當淀粉含量為21.66 g/L、培養(yǎng)溫度為27.70 ℃、培養(yǎng)時間為7.75 d時，回歸方程預測得D值為22.67 mm。經過驗證試驗，在上述條件下D值為23.00 mm。

3 小結與討論

本試驗運用了響應面法中的Plackett-Burman試驗設計、最陡爬坡試驗、Box-Behnken試驗設計來優(yōu)化放線菌G5的發(fā)酵條件。利用Plackett-Burman試驗設計來確定主效應因子為淀粉含量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)天數。利用最陡爬坡試驗來確定3個主效因子的變化方向和步長，Box-Behnken試驗則用于確定最優(yōu)值，得出其最優(yōu)條件為淀粉含量21.66 g/L、培養(yǎng)溫度27.70 ℃、培養(yǎng)時間7.75 d。模型預測的D值為22.67 mm，經驗證結果為23.00 mm。結果表明模型預測與試驗驗證結果基本一致，用該模型可以合理、有效地預測D值。

參考文獻：

[1] 李 晶，安德榮，劉翠娟，等.放線菌S-159-05抑菌活性物質的初步研究[J].科技與開發(fā)，2007，46（11）：755-757.

[2] 李淑彬，楊勁松，劉 陽，等.抗真菌抗生素高產菌株的推理選育及其發(fā)酵調控研究[J].中山大學學報，2001，40（4）：13-16.

[3] 郝學財，余曉斌，劉志鈺，等.響應面法在優(yōu)化微生物培養(yǎng)基中的應用[J].食品研究與開發(fā)，2006，27（1）：38-41.

[4] 陳秉梅，侯志國，李忠琴，等.基于SAS9.1的芽孢桿菌發(fā)酵條件優(yōu)化[J].計算機與應用化學，2011，28（5）：575-579.

[5] 蘇 偉，趙 利，劉建濤，等.黃精多糖抑菌及抗氧化性能研究[J].食品科學，2007，28（8）：55-57.

[6] 肖懷秋，李玉珍.海金沙草總黃酮提取工藝的響應面優(yōu)化[J].氨基酸和生物資源，2010，34（8）：68-72.

[7] DAVIES O L.The Design and Analysis of Industrial Experiments[M]. New York：Hafner Publishing Company，1967.