超聲輔助酶解谷朊粉制備ACE抑制肽工藝優(yōu)化

劉樹興， 石 凱

(陜西科技大學 生命科學與工程學院， 陜西 西安 710021)

0 引言

谷朊粉(Vital wheat gluten)又稱活性小麥面筋蛋白，物美價廉、氨基酸組成齊全的純天然植物性蛋白源,是從小麥面粉中經(jīng)水洗、分離、干燥提取

出來的天然蛋白質(zhì).在世界蛋白質(zhì)資源嚴重缺乏的當今，深入開發(fā)谷朊粉蛋白產(chǎn)品的研究，不僅可提高谷朊粉資源的利用率和企業(yè)的經(jīng)濟效益，而且對拓展蛋白質(zhì)資源具有重要的現(xiàn)實意義[1].

血管緊張素轉換酶( angiotensin converting enzyme,ACE ) 在人體血壓調(diào)節(jié)過程中起重要作用.ACE 抑制肽通過抑制血管緊張素I 向血管緊張素II轉換以及阻止ACE 降解緩激肽而起降血壓的作用[2].小麥蛋白經(jīng)過堿性蛋白酶作用后, 可以得到具有ACE 抑制活性的酶解物.

本文主要介紹超聲輔助酶解制備ACE抑制肽，對制備條件進行優(yōu)化，確定最優(yōu)工藝.同時也為小麥蛋白的綜合利用提供了理論依據(jù)，為小麥副產(chǎn)物提供更寬廣的利用空間.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

谷朊粉：陜西大河粉業(yè)有限公司；堿性蛋白酶酶活200 000 u/g以上；雙縮脲試劑、氫氧化鈉、三氯乙酸等分析純：天津市天力化學試劑有限公司.UV-2600/2600A紫外可見分光光度計：龍尼柯(上海)儀器有限公司；KQ-250TDV型高頻數(shù)控超聲波清洗器BS245分析天平：賽多利斯科學儀器(北京)有限公司； SC-3610低速離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；HH-s6型電熱恒溫水浴鍋：北京科偉水興儀器有限公司；KDN-04C型數(shù)顯消化爐、KDN-04C型凱氏定氮儀：上海洪紀儀器設備有限公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 谷朊粉理化特性測定

粗蛋白含量的測定：微量凱氏定氮法[3]；灰分含量的測定：灼燒法[4]；粗脂肪含量測定：酸水解法[5]；碳水化合物測定：DNS比色法[6].

對原料基本組成進行分析，具體見表1.

表1 小麥蛋白的基本成分

1.2.2 小麥蛋白的酶解工藝

稱取1 g左右小麥谷朊粉，加100 mL蒸餾水，攪拌后靜置30 min,加入一定量的酶,放入超聲波清洗器中，設置時間、溫度、功率,分別酶解，離心30 min(3 500 r/min,30 min)，取酶解上清液，冷藏待測.

1.2.3 水解度的測定

根據(jù)氨基酸的兩性作用，加入甲醛以固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性.用NaOH標準溶液滴定，以酸度計定終點.-COOH被完全中和時，pH值約為8.5～9.5.本法準確快速，可用于各類樣品游離氨基酸含量的測定.

取水解蛋白液20.00 mL于250 mL燒杯中，加入60 mL去二氧化碳蒸餾水并磁力攪拌，待攪拌穩(wěn)定后，用精密pH計指示pH值并加0.1 mol/LNaOH調(diào)整pH=8.2，記下消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，然后加入10 mL甲醛溶液，混勻，記錄將其pH值再用0.05 mol/LNaOH滴定至9.2時所耗氫氧化鈉的體積；同時取80 mL去二氧化碳水作空白實驗[7,8]；則水解蛋白液中蛋白質(zhì)的氨基氮為：

式中：C-0.05 mol/LNaOH標準溶液的濃度，mol/L；V-酶解液消耗NaOH標準溶液體積，mL ；V0-空白組消耗0.05 mol/LNaOH標準溶液體積，mL；0.014-氮的毫克當量；N-樣品底物中總氮含量，g.

1.2.4 ACE抑制率的測定

硼酸鹽緩沖液的配制：分別稱取0.618 3 g硼酸、1.753 2 g NaCl溶于適量超純水中，定容至100 mL，配制成0.1 mol/L的硼酸溶液(含0.3 mol/L的NaCl)；再分別稱取0.953 4 g四硼酸鈉、1.753 2 g NaCl溶于適量超純水中，定容至100 mL，配制成0.025 mol/L的硼砂溶液(含0.1 mol/L的硼酸根，0.3 mol/L的NaCl)；將配制好的硼砂溶液逐漸加到硼酸溶液中，磁力攪拌，調(diào)節(jié)pH值至8.3即可.

0.1 UN/mL ACE溶液的配制：將ACE溶于上述硼酸鹽緩沖溶液中，配成濃度為0.1 UN/mL.

5 mmol/L HHL溶液的配制：將HHL溶于上述硼酸鹽緩沖溶液中，配成5 mmol/L.

ACE抑制活性測定采用紫外吸光度體外檢測法[9,10]，稱取凍干的酶解物樣品，加入上述磷酸鹽緩沖液中，配制成濃度為2.5 mg/mL的溶液，取50μL樣品溶液加入50μL 0.1 UN/mL的ACE溶液，混勻后，于37 ℃水浴預熱10 min，加入100μL 5 mmol/L的HHL溶液，置于漩渦混合儀上震蕩搖勻，37 ℃水浴反應30 min后，加入100μL 1 mol/L的HCL溶液震蕩以終止反應，冷卻至室溫后，加入2 mL乙酸乙酯混合均勻后取0.9 mL酯層，放入烘干箱烘干后，溶于2 mL水中，分別于228 nm處測吸光度.定量馬尿酸的生成量，同時做空白和對照實驗.

取三支試管，按表2加入樣品處理液(酶解液)和試劑等.

表 2 試劑加樣

則抑制率的計算公式為：

式中:a—樣品228 nm處吸光度；b—空白228 nm處吸光度；c—對照228 nm處吸光度.

1.2.5 不同超聲功率對谷朊粉水解度和抑制率的影響

分別設定超聲功率為100 W、150 W、200 W、250 W，酶濃度為30 mg/g，溫度為50 ℃，時間為1 h，超聲條件下用堿性蛋白酶酶解，觀察超聲功率對水解度和抑制率，并確定適宜的酶解功率.

1.2.6 不同超聲時間對谷朊粉水解度和抑制率的影響

分別設定酶解時間為30 min、60 min、90 min、120 min，酶濃度30 mg/g，溫度為50 ℃，超聲功率為250 W，進行超聲酶解，考察酶解時間對水解度和抑制率的影響，并確定適宜的酶解時間.

1.2.7 不同超聲溫度對谷朊粉水解度和抑制率的影響

分別設定超聲酶解溫度為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃，時間為1 h，超聲功率為250 W，酶濃度為30 mg/g，考察酶解溫度對水解度和抑制率的影響，并確定適宜的酶解溫度.

1.2.8 超聲輔助不同酶濃度對谷朊粉水解度和抑制率的影響

分別設定酶的濃度為10 mg/g、20 mg/g、30 mg/g、40 mg/g，溫度為50 ℃，超聲功率為250 W，時間為60 min，超聲酶解，考察酶濃度對水解度和抑制率的影響，并確定適宜的酶濃度.

2 結果與討論

2.1 不同超聲功率對水解度和抑制率的影響

由圖1可以看出，小麥面筋蛋白多肽的水解度和抑制率隨著功率的增加而上升，在功率為200 W后水解度和抑制率增速出現(xiàn)明顯增加，說明單位時間內(nèi)功率 200 W之后超聲產(chǎn)生的空化事件較多，從而使酶解效果較好[11]，因此實驗選擇超聲波功率為 250 W進行后續(xù)實驗.

圖1 不同超聲功率對水解度和抑制率的影響

2.2 不同超聲時間對水解度和抑制率的影響

由圖2可以看出，水解度在0～60 min快速上升,之后變化趨于平緩,水解度在此時已經(jīng)達到飽和，而抑制率隨著酶解時間的延長，抑制率先增加再降低，在 90 min時達到最大值，隨后抑制率逐漸降低，可能是水解物的ACE活性既受體系的肽濃度影響[12],也可能與水解產(chǎn)物中肽的組成相關.為獲得較高抑制率的酶解產(chǎn)物,考慮到ACE 抑制率活性較好，且生產(chǎn)效率較高的因素，選擇酶解時間為60 min.

圖2 不同超聲時間對水解度和抑制率的影響

2.3 不同溫度對谷朊粉水解度和抑制率的影響

由圖3可以看出，溫度的變化對水解度和ACE抑制率均有較大的影響[13]，隨著溫度的變化，水解度和ACE抑制率的變化趨勢基本一致，隨著溫度的增加，兩者呈現(xiàn)先上升再降低的趨勢.當溫度達到 50 ℃時，水解度和ACE抑制率均達到最大值，而再升高溫度兩者均出現(xiàn)明顯下降，說明ACE抑制肽的結構或成分會隨著溫度的升高發(fā)生變化從而使ACE抑制作用下降，因此實驗選擇的超聲波水浴溫度為50 ℃.

圖3 不同溫度對谷朊粉水解度 和抑制率的影響

2.4 不同酶濃度對谷朊粉水解度和抑制率的影響

由圖4可以看出，酶濃度的增加對于水解度和ACE抑制率的影響較為明顯，隨著酶濃度的增加水解度也不斷增加，當酶濃度到30 mg/g時增加趨勢變緩，說明酶量的增加提高了酶對不溶性蛋白的作用能力[14]，但是當加酶濃度增加到一定程度時，即當全部底物均與蛋白酶結合的時候，水解度就不再提高了.ACE 抑制率隨著加酶量的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在 30 mg/g時達到最大值，隨后降低，說明ACE抑制率并不會隨著加酶濃度增加而不斷升高，當加酶量增加到一定程度時，可能是由于ACE抑制肽的結構或成分隨著酶量的增高發(fā)生改變反而會使ACE抑制率下降[15].因此選擇加酶濃度為30 mg/g.

圖4 不同酶濃度對谷朊粉水解度 和抑制率的影響

2.5 堿性蛋白酶正交試驗結果與討論

根據(jù)前面對于堿性蛋白酶四種單因素的研究，現(xiàn)選用超聲功率為250 W，時間為1 h，溫度為50 ℃，酶濃度為30 mg/g設計正交試驗，本試驗采用L9(43)正交試驗設計.分別用A、B、C、D來表示超聲功率、酶量、溫度、時間.因素、水平的選取如表3 所示，實驗方案和實驗結果如表4所示.

表3 正交因素水平表

表4 水解度正交試驗結果表

根據(jù)極差R的大小，進行因素主次排隊.R越大，表示因素水平的變化對試驗指標的影響越大，因此在本試驗中就越重要；反之R越小，表示因素水平的變化對試驗指標的影響越小，這個因素水平就越不重要.

由以上結果可以得知A>B>C>D，即超聲功率大小對水解程度的影響最大，其次是酶濃度，溫度和酶解時間的影響較小.最優(yōu)組合為A3B2C2D2.即超聲功率為100%、時間為1 h、溫度為50 ℃、酶濃度為30 mg/g，此時水解度最大.

2.6 驗證試驗

在超聲功率為250 W、時間為60 min、溫度為50 ℃、酶濃度為30 mg/g，測得其水解度，與正交實驗最優(yōu)組進行對比，結果見表5所示.

表5 驗證試驗結果

即超聲波輔助酶解的最佳工藝條件為：聲功率為100%、時間為60 min、溫度為50 ℃、酶濃度為30 mg/g，在此工藝條件下小麥蛋白的水解度為14.64%,抑制率為80.37%.

3 結論

(1)由于ACE是一類專一性相對較寬的酶，因此水解度和ACE抑制率沒有一定的相關性.不能簡單的以水解度的高低判斷多肽的ACE抑制率.超聲輔助酶解在得出的最大水解度條件下，其抑制活性高達80%以上.

(2)原料經(jīng)超聲波預處理后酶解得到的水解度和抑制率都得到大大的提高，同時能明顯縮短反應時間，加快反應效率，為超聲化學在酶解制備生物活性肽提供簡單快捷的方法.

(3)谷朊粉酶解制備ACE抑制肽最佳工藝參數(shù)為：在超聲功率為250 W下，酶濃度30 mg/g，酶解溫度為50 ℃，水解時間60 min.

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