木姜子枝葉中化學成分活性的研究

楊秀芳， 王 媛， 馬養(yǎng)民， 賈強強， 劉建軍, 康永祥

(1.陜西科技大學 化學與化工學院 教育部輕化工助劑化學與技術重點實驗室, 陜西 西安 710021； 2.西北農林科技大學 林學院， 陜西 楊凌 712100)

0 引言

木姜子(Litseapungens)屬植物隸屬于樟科木姜子族，為常綠或落葉喬木或灌木，種類多且分布廣，全世界約有200余種.主要分布在亞洲熱帶，亞熱帶以及美洲[1].我國獨有72種，以南方及西南溫帶地區(qū)[2]為主.木姜子是我國傳統(tǒng)的中草藥，其果、葉、根都可入藥[3].目前研究結果表明，木姜子屬植物含有豐富的化學成分，以甾體[4]、生物堿[5]、黃酮[6]、內酯[7，8]、木質素[9]等為主.活性研究顯示，該屬植物具有抑菌、抗氧化、抗腫瘤、抗炎、治療心血管疾病[10]、抑制血小板凝聚[11]等功效.為闡明木姜子藥理活性與其化學成分的構效關系，本文在對木姜子化學成分研究的基礎上，首次對分離得到的單體化合物進行了體外抑菌活性、抗氧化活性研究，為該藥物的研發(fā)提供理論基礎.

1 材料與方法

1.1 試藥

1.1.1 樣品

秦嶺太白山木姜子枝葉中分離純化得到了9個單體化合物，分別為棕櫚酸、芹菜素、芹菜素7-O-β-D-葡萄糖苷、異槲皮素、β-谷甾醇、山萘苷、松屬素pinocembrin、松屬素查兒酮、木犀草素7-O-β-D-葡萄糖苷[12].

1.1.2 供試菌種

真菌4株：西瓜枯萎病菌(F.oxysporumf.sp.niveum)、蘋果腐爛病菌(V.mali)、番茄灰霉病菌(B.cinerea)、芍藥炭疽病(C.gloeosporioides).

細菌6株:乳鏈球菌(Streptococcuslactis) 、 金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Esherichiacoli)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、納豆芽孢桿菌(Bacillusnatto)、枯草芽孢桿菌(Bacilussubtilis).

1.1.3 培養(yǎng)基

(1)PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯(去皮)200.0 g，葡萄糖7.5 g，KCl 0.125 g，NaNO35 g，K2HPO40.25 g，瓊脂18 .0 g ，F(xiàn)eSO40.002 5 g，MgSO4·H2O 0.125 g，蒸餾水1 000 mL.

(2)NA培養(yǎng)基：瓊脂1.5～2.0 g，蛋白胨1.0 g，牛肉膏0.5 g，KCl 0.5 g，去離子水100 mL，pH7.0～7.2,121 ℃滅菌20 min.

1.2 主要儀器設備

SW-CJ-1FD超凈工作臺，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；DH5000AB型電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津泰斯特有限公司；XFLH-50CA電熱式壓力蒸汽滅菌器，浙江新豐醫(yī)療器械有限公司； 723N可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；96孔板，上?？婆d生物科技有限公司.

1.3 生化試劑

牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、瓊脂，北京奧博星生物技術有限責任公司；1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)，阿拉丁試劑(上海)有限公司；抗壞血酸，天津市百世化工有限公司.

1.4 實驗方法

1.4.1 菌懸液的配置

從試管斜面上刮取少量的綠膿桿菌(P.a)、枯草芽孢桿菌(B.s)大腸桿菌(E.c)金黃色葡萄球菌(S.a)、乳鏈球菌 (S.l)、納豆芽孢桿菌 (B.n)、西瓜枯萎病菌(F.of.sp.n)、蘋果腐爛病菌(V.m)、番茄灰霉病菌 (B.c)、芍藥炭疽病菌(C.g)，將其接種到液體培養(yǎng)基中制成菌懸液.將配制好的菌懸液，轉移至恒溫振蕩器，在28 ℃培養(yǎng)48 h，用血細胞計數(shù)板將其濃度調至1×104～2×105cfu /mL，備用.

1.4.2 樣品溶液配置

將從木姜子枝葉中分離得到的9個單體化合物分別精密稱取.

(1)用二甲基亞砜溶解，配制成濃度為800μg·mL-1的溶液.

(2)用甲醇溶解，配制成2 000μg·mL-1的甲醇溶液.同時,配制濃度為0.1μg·mL-1的DPPH甲醇溶液置于冰箱中備用.

1.4.3 最小抑菌濃度(MIC)的測定

采用96孔板法，按照參考文獻[13]最小抑菌濃度(MIC)測定方法中的(1)～(3)操作.經(jīng)過倍半稀釋后，所有板孔中化合物被稀釋成系列濃度，其濃度大小依次為400μg·mL-1、200μg·mL-1、100μg·mL-1、50μg·mL-1、25μg·mL-1、12.5μg·mL-1、6.25μg·mL-1、3.13μg·mL-1、1.56μg·mL-1、0.78μg·mL-1.其中細菌以青霉素鈉作為陽性對照，真菌以酮康唑作為陽性對照.

向所有板孔中加入10μL的一種菌懸液.另取96孔板重復前面的操作，直至將所有的測試菌加完.把準備好的96孔板放入恒溫培養(yǎng)箱中，28 ℃下，細菌培養(yǎng)24 h，真菌培養(yǎng)48 h，用酶標儀在波長為595 nm處測定各個板孔的透光率.重復3～5次，以平均結果計.再由透光率計算各個樣品的抑制率[14].

式中：P為抑制率，K0為溶劑對照孔透光率，K1為樣品孔透光率，K2為空白對照孔透光率.

1.4.4 抗氧化活性測定(DPPH法)

參照文獻[15]，對96孔板編號，方法與1.4.3中(1)基本相同，按編號采用倍半稀釋法向各孔中分別注入100μL的松屬素pinocembrin、松屬素查兒酮、山萘苷、芹菜素、芹菜素7-O-β-D-葡萄糖苷、異槲皮素、木犀草素7-O-β-D-葡萄糖苷的2 000μg·mL-1的甲醇溶液，再用移液槍依次注入0.1μg·mL-1100μL DPPH甲醇溶液混合，于室溫下遮光放置30 min，在517 nm波長，測定每個樣品孔的吸光度(Ai)；以100μL甲醇和100μL濃度為0.1μg·mL-1DPPH溶液混合液代替樣品為空白,吸光度記為A0；100μL甲醇和100μL 對應樣品濃度的甲醇混合液為樣品底物吸收校正液,吸光度記為A1.重復測定3～5 次，以樣品濃度為橫坐標，DPPH自由基清除率為縱坐標作圖，并進行回歸分析，計算樣品清除率為50%時樣品的濃度值(IC50).清除率計算公式為：

2 結果與討論

2.1 化合物的抗菌活性

從木姜子分離得到的化合物棕櫚酸(Ⅰ)、β-谷甾醇(Ⅱ)、松屬素(pinocembrin)(Ⅲ)、松屬素查兒酮(Ⅳ)、山萘苷(Ⅴ)、芹菜素(Ⅵ)、芹菜素7-O-β-D-葡萄糖苷(Ⅶ)、異槲皮素(Ⅷ)、木犀草素7-O-β-D-葡萄糖苷(Ⅸ)的MIC測試結果見表1.其中有8個化合物對測試的10種菌顯示出不同程度的抑制生長作用.其中黃酮類化合物Ⅲ-Ⅸ對多種測試菌有抑制作用，MIC大多數(shù)不超過50μg·mL-1；松屬素查兒酮對細菌抑制效果大于真菌，尤其是對枯草芽孢桿菌和綠膿桿菌的MIC達到12.5μg·mL-1；化合物Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ對植物病原真菌的抑制生長活性大于細菌，MIC均小于50μg·mL-1,其中對蘋果腐爛病菌、芍藥炭疽病菌的MIC為12.5μg·mL-1；但化合物棕櫚酸對10種測試菌均未表現(xiàn)出明顯的抑制作用.以上分析結果表明，木姜子屬植物中抑菌活性比較好的化合物為黃酮類化合物.

表1 不同化合物對細菌最小抑菌濃度(MIC)

注：表中CK1、CK2為對照，其中CK1為青霉素鈉，CK2為酮康唑.

表2 化合物的抗氧化活性結果

2.2 化合物的抗氧化活性

抗氧化活性數(shù)據(jù)IC50顯示(如表2):測試樣品化合物的抗氧化作用不同,均不及Vc(抗壞血酸).但具有清除DPPH自由基的能力,說明木姜子中黃酮類化合物具有廣譜抗氧化作用，活性由高到低順序為：異槲皮素>芹菜素>木犀草素7-O-β-D-葡萄糖苷>芹菜素7-O-β-D-葡萄糖苷>山萘苷>松屬素查兒酮>松屬素Pinocembrin.由實驗結果再結合化合物的結構，發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物抗氧化作用的構效關系如下.

(1)黃酮骨架結構中B環(huán)對其抗氧化活性影響較大，而B環(huán)上的4′-OH表現(xiàn)出強的優(yōu)勢.這可能是由于B環(huán)上的4′-OH有利于增長黃酮分子結構中的共軛鏈，形成相對穩(wěn)定的中間體；其次，黃酮類化合物抗氧化性的強弱還與B環(huán)上的酚羥基數(shù)目有關.如：異槲皮素的抗氧化活性>芹菜素，木犀草素7-O-β-D-葡萄糖苷抗氧化作用>芹菜素7-O-β-D-葡萄糖苷.表現(xiàn)在這些化合物的IC50值比B環(huán)沒有羥基的松屬素查兒酮和松屬素Pinocembrin的IC50值低.

(2)C環(huán)的C-2和C-3之間的雙鍵對其抗氧化活性也有影響.如：化合物Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ的抗氧化活性都高于松屬素Pinocembrin.分析原因可能是C-2和C-3雙鍵加氫后，共軛體系縮短，使黃酮骨架上羥基的作用降低，導致黃酮的抗氧化活性也有所減弱.

(3)黃酮結構中的酚羥基成苷對抗氧化活性也有影響.如：芹菜素7-O-β-D-葡萄糖苷的IC50值比芹菜素的IC50值高3倍；也就是說7-位酚羥基氧成糖苷后，使其抗氧化活性降低，原因可能是空間位阻效應，導致黃酮骨架上羥基抗氧化能力有所下降.

3 結論

(1)抗菌實驗結果顯示，木姜子主要活性成分為黃酮類化合物，這些化合物對微生物有很好的抑制作用，可以作為抑菌劑進一步開發(fā)利用.

(2)抗氧化數(shù)據(jù)表明，木姜子中黃酮類化合物具有廣譜抗氧化性，其中異槲皮素抗氧化活性比較好，這為天然抗氧化劑植物原料開發(fā)利用提供了途徑.

通過對木姜子中多種化合物的生物活性研究表明，木姜子有多種活性成分，應該加大秦巴山區(qū)這一重要資源的開發(fā)利用，為該地區(qū)的經(jīng)濟發(fā)展注入新的活力.

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