鈣網(wǎng)蛋白介導(dǎo)的線粒體功能異常參與心肌細(xì)胞肥大過程

單 虎，魏 瑾，張 明，林 琳，閆 蕊，張 蓉

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，陜西西安 710004)

心肌細(xì)胞肥大是心臟在病理?xiàng)l件下維持正常功能的有效代償機(jī)制，然而心肌細(xì)胞肥大失代償可導(dǎo)致擴(kuò)張性心肌病、心力衰竭和猝死的發(fā)生[1-2]。線粒體功能異常是參與心肌細(xì)胞肥大及失代償過程中的重要機(jī)制[3]，主要表現(xiàn)為線粒體膜電位降低，數(shù)目減少，聚集伴腫脹[4]，線粒體DNA突變?cè)龆郲5]以及線粒體內(nèi)活性氧水平升高[6]。然而，肥大刺激[血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、內(nèi)皮素-1、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1等]導(dǎo)致線粒體功能異常的機(jī)制尚未明確。目前，研究已初步證實(shí)NADPH氧化酶、線粒體σ1受體及線粒體KATP通道等參與肥大刺激介導(dǎo)的線粒體損傷[7-8]。鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin, CRT)是一種主要分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子結(jié)合蛋白，除參與調(diào)節(jié)蛋白折疊、細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞黏附外[9]，CRT還可通過影響線粒體膜電位和鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)線粒體功能[10]。而且，在心肌細(xì)胞肥大過程中CRT表達(dá)水平明顯升高[11]。但是，CRT誘導(dǎo)的線粒體功能異常是否參與心肌細(xì)胞肥大尚未證實(shí)。本研究擬采用AngⅡ構(gòu)建大鼠心肌細(xì)胞肥大模型，觀察模型細(xì)胞中CRT表達(dá)和線粒體功能的變化及AngⅡ受體阻斷劑對(duì)它們的影響。

1 材料與方法

1.1材料新生SD大鼠(雌雄不拘)購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶(MP公司)，5-溴脫氧尿核苷(Brdu，Sigma公司)；DMEM/F12培養(yǎng)基(Thermo公司)，胎牛血清(Gibco公司)；α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白單克隆抗體(Santa Cruz公司)，CRT單克隆抗體(CST公司)，Alexa Fluor 594標(biāo)記二抗、羅丹明123(Invitrogen公司)，Hoechst 33258(上海碧云天)；AngⅡ(Sigma公司)，酶活性檢測(cè)試劑盒(南京建成)；Tris-Carb系液閃儀(Perkinelmer公司)、Hoefer轉(zhuǎn)膜儀、實(shí)時(shí)定量PCR儀(Bio-Rad公司)，熒光酶標(biāo)儀、分光光度儀(上海天普)、倒置相差顯微鏡(Olympus公司)。常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2新生大鼠心肌細(xì)胞原代分離培養(yǎng)與鑒定5只1 d齡SD大鼠消毒后移入超凈臺(tái)，無(wú)菌條件下迅速取出心臟，將左心室部分剪碎后移入1 g/L胰蛋白酶與0.5 g/L Ⅱ型膠原酶混合消化酶中，在37 ℃恒溫?fù)u床中消化7 min后吸取上清液與等體積含100 mL/L血清的完全培養(yǎng)基混合，重復(fù)消化8～10次。將所收集上清離心后以含100 mL/L血清的完全培養(yǎng)基(含100 U/mL青鏈霉素及0.1 mmol/L Brdu)重懸后置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)90 min，采用差速貼壁法去除貼壁的非心肌細(xì)胞。取培養(yǎng)第4天的心肌細(xì)胞常規(guī)固定通透后，以1∶200稀釋?duì)?橫紋肌肌動(dòng)蛋白單克隆抗體4 ℃孵育過夜，1∶200稀釋的Alexa Fluor 594標(biāo)記二抗室溫孵育2 h，Hoechst 33258標(biāo)記細(xì)胞核，熒光顯微鏡下觀察。

1.3實(shí)驗(yàn)分組將同期分離培養(yǎng)的心肌細(xì)胞隨機(jī)分為5組：模型組，共3組，分別以10-8mmol/L、10-7mmol/L、10-6mmol/L終濃度的AngⅡ干預(yù)48 h；纈沙坦組以10-6mmol/L終濃度纈沙坦預(yù)處理0.5 h后，再加入10-7mmol/L終濃度的AngⅡ繼續(xù)干預(yù)48 h；空白對(duì)照組不予任何處理。

1.4心肌細(xì)胞表面積的測(cè)定各組心肌細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后，于倒置相差顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞形態(tài)，每組隨機(jī)挑選10個(gè)視野，各視野下隨機(jī)挑選10個(gè)細(xì)胞，于40倍物鏡下攝片。用Image-Pro Plus專業(yè)圖像分析軟件測(cè)量細(xì)胞表面積，各組細(xì)胞表面積用該組100個(gè)細(xì)胞表面積的平均值代表。

1.5蛋白質(zhì)合成速率的測(cè)定采用3H-亮氨酸摻入法，各組心肌細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后，PBS沖洗2遍，用含0.2 g/L EDTA的2.5 g/L胰酶將細(xì)胞消化為單細(xì)胞懸液，離心后以含1 μCi/mL3H-亮氨酸的PBS 1 mL重懸細(xì)胞，37 ℃水浴1.5 h后將心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)移至玻璃纖維濾膜上，以100 g/L三氯乙酸固定濾膜并烘干，將烘干后的濾膜放入含5 mL閃爍液的測(cè)定瓶中，用液體閃爍儀測(cè)定濾膜放射性。

1.6線粒體膜電位的測(cè)定將羅丹明123配制成5 μg/μL的母液，用PBS漂洗貼壁生長(zhǎng)的心肌細(xì)胞3次，再各孔中加入含5 μg/mL終濃度的新鮮培養(yǎng)液，放入孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)30 min，吸棄培養(yǎng)液，PBS輕輕洗滌細(xì)胞3遍，于熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)分別為535 nm和590 nm，紅色與綠色熒光強(qiáng)度比值反映膜電位水平。

1.7酶活性測(cè)定按照酶活性檢測(cè)試劑盒說明書操作，于分光光度儀550 nm和600 nm波長(zhǎng)分別檢測(cè)COX和SDH活性。

1.8RT-PCR檢測(cè)使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，隨后用RT-PCR試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按照SYBRExScriptTMRT-PCR試劑盒說明在iQ5多色實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)上進(jìn)行操作。CRT引物設(shè)計(jì)為5′-TTCTTGGACGGAGATGC-3′(正義)，5′-CATCTTGGCTTGTCTGC-3′(反義)；GAPDH，5′-TTGTGATGGGTGTGAACC-3′(正義)，5′-TTCTGAGTGGCAGTGATG-3′(反義)。以NADPH為內(nèi)部對(duì)照，采用2-ΔΔCt相對(duì)定量法計(jì)算各組中CRT基因表達(dá)。

1.9Westernblot檢測(cè)使用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，分別取300 μg蛋白質(zhì)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，繼而轉(zhuǎn)印到PVDF膜，常規(guī)封閉后分別用CRT單克隆抗體(1∶1 000)及β-actin單克隆抗體(1∶3 000)4 ℃孵育過夜，PBST洗滌后以相應(yīng)二抗室溫孵育2 h，ECL法顯影并于暗室內(nèi)曝光。以β-actin作為內(nèi)部對(duì)照，采用Image-Pro Plus圖像分析軟件分析各蛋白條帶的積分吸光度值。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間的比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞的純度鑒定在培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中以α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白單克隆抗體為一抗，經(jīng)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)鑒定，心肌細(xì)胞純度在90%以上(圖1、表1)。

圖1原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞的純度鑒定(免疫細(xì)胞化學(xué)染色)

Fig.1 The identification of neonatal rat cardiomyocytes (immunocytochemistry)

A：實(shí)驗(yàn)組(×40)；B：實(shí)驗(yàn)組(×100)；C：陰性對(duì)照組(PBS代替一抗，×40)。

表1以α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白的陽(yáng)性率評(píng)定原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞的純度

Tab.1 The purity of neonatal rat cardiomyocytes identified by α-sarcomeric actin positive rate

培養(yǎng)天數(shù)(d)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(個(gè))細(xì)胞總數(shù)(個(gè))陽(yáng)性率(%)1976100097.62941100094.14905100090.5

2.2纈沙坦對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的影響分別用3種不同濃度AngⅡ干預(yù)的模型組心肌細(xì)胞表面積、蛋白質(zhì)合成速率明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，提示心肌細(xì)胞肥大模型構(gòu)建成功。與3個(gè)模型組相比，纈沙坦組心肌細(xì)胞表面積、蛋白質(zhì)合成速率均明顯降低(P<0.05，圖2)。

2.3纈沙坦對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞線粒體功能異常的影響與對(duì)照組相比，3個(gè)模型組線粒體膜電位、COX及SDH活性均明顯降低，而與3個(gè)對(duì)照組相比，纈沙坦預(yù)處理可有效抑制AngⅡ誘導(dǎo)的線粒體膜電位和酶活性下降(P<0.05，圖3)。

2.4纈沙坦對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大中CRT表達(dá)的影響與對(duì)照組相比，模型組心肌細(xì)胞中CRT mRNA及蛋白水平隨著AngⅡ濃度增大而逐漸升高，而與3個(gè)模型組相比，纈沙坦預(yù)處理可明顯抑制CRT表達(dá)上調(diào)(P<0.01，圖4)。

3 討 論

CRT在調(diào)節(jié)心肌線粒體功能中的作用已經(jīng)得到廣泛的認(rèn)同，而其是否在心肌肥大發(fā)生過程中參與線粒體損傷尚未得到證實(shí)。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)觀察了心肌肥大發(fā)生過程中CRT表達(dá)的變化及纈沙坦對(duì)其表達(dá)的影響。

圖2各組細(xì)胞表面積、蛋白質(zhì)合成速率的比較

Fig.2 Comparison of cell surface area and protein synthesis rate between the groups

A：各組細(xì)胞表面積；B：各組細(xì)胞蛋白合成速率。與對(duì)照組相比，*P<0.01；與纈沙坦組相比，#P<0.01。

圖3各組細(xì)胞線粒體膜電位、呼吸鏈酶活性的比較

Fig.3 Comparison of mitochondrial membrane potential level and enzyme activities between the groups

A：各組細(xì)胞線粒體膜電位；B：各組細(xì)胞線粒體中呼吸鏈酶活性。與對(duì)照組相比，*P<0.05；與纈沙坦組相比，#P<0.05。

圖4各組細(xì)胞CRT表達(dá)水平的比較

Fig.4 Comparison of CRT expression between the groups

A：各組細(xì)胞CRT mRNA相對(duì)水平；B：各組細(xì)胞CRT蛋白相對(duì)水平。與對(duì)照組相比，*P<0.01；與纈沙坦組相比，#P<0.01。

在我們構(gòu)建的心肌肥大細(xì)胞模型中，3個(gè)濃度梯度的AngⅡ均可誘導(dǎo)原代心肌細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞表面積增大、蛋白合成速率加快等肥大特征及線粒體膜電位、酶活性降低等線粒體功能受損表現(xiàn)，同時(shí)CRT表達(dá)水平隨AngⅡ濃度增加呈現(xiàn)劑量依賴性升高，而纈沙坦預(yù)處理可消除AngⅡ誘導(dǎo)的CRT表達(dá)上調(diào)作用，并減輕AngⅡ誘導(dǎo)的線粒體功能損傷。結(jié)合既往研究所證實(shí)CRT表達(dá)上調(diào)可導(dǎo)致線粒體功能受損，上述實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虺醪阶C實(shí)：CRT介導(dǎo)的線粒體損傷可能參與心肌肥大過程。

CRT是一種主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的鈣結(jié)合蛋白，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)、鈣離子相關(guān)信號(hào)通路、基因表達(dá)和細(xì)胞黏附的生物學(xué)作用[12]。CRT在胚胎期心臟中表達(dá)較高，是心臟發(fā)育必不可少的重要因素[13]。然而，出生后心臟中CRT表達(dá)水平迅速下降，當(dāng)CRT過度表達(dá)時(shí)則會(huì)出現(xiàn)心律失常、心腔擴(kuò)大、心源性猝死等嚴(yán)重后果[14-15]。目前，CRT在心血管疾病發(fā)病機(jī)制中的作用得到越來(lái)越多研究者的重視，ARNAUDEAU等[10]已發(fā)現(xiàn)CRT介導(dǎo)線粒體鈣穩(wěn)態(tài)失衡是心肌細(xì)胞功能異常的重要機(jī)制。本課題組前期以擴(kuò)張性心肌病大鼠模型為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)其心肌組織中CRT表達(dá)升高，并伴隨信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3)磷酸化過程受阻，線粒體損傷發(fā)生；離體培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞CRT表達(dá)下調(diào)后，STAT3磷酸化受阻及線粒體損傷得到部分逆轉(zhuǎn)。由此可見，CRT通過CRT-STAT3信號(hào)通路介導(dǎo)的線粒體損傷參與擴(kuò)張性心肌病的發(fā)病過程[16]。早在1997年，TSUTSUI等人就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥大模型中CRT表達(dá)異常升高，但其在心肌肥大過程中的具體作用及機(jī)制尚未明確。本研究發(fā)現(xiàn)心肌肥大細(xì)胞模型中CRT表達(dá)水平升高，并呈現(xiàn)AngⅡ濃度依賴性，同時(shí)，心肌細(xì)胞線粒體功能下降，而給予纈沙坦預(yù)處理后，AngⅡ不能誘導(dǎo)CRT表達(dá)升高，隨著CRT表達(dá)水平的降低，線粒體功能也得到一定程度的恢復(fù)。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可初步證實(shí)CRT介導(dǎo)的線粒體損傷參與AngⅡ誘導(dǎo)心肌肥大過程。

綜上所述，在AngⅡ刺激下，CRT表達(dá)升高所誘導(dǎo)的線粒體功能異常可能是心肌肥大的重要機(jī)制之一。該研究有助于闡述心肌肥大過程中線粒體功能受損的可能機(jī)制，為進(jìn)一步的基礎(chǔ)與臨床研究奠定了理論基礎(chǔ)。

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