庹清章,董江濤,田璽擇,劉云霞,董偉杰,劉丹霞,李 微,吳 芳,章 樂,張萬江
(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室,新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室,新疆石河子 832002)
結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(MycobacteriumTuberculosis, MTB)引起的一種世界性傳染病,也是單一致病菌感染導(dǎo)致死亡率最高的感染性疾病。當機體吸入含有MTB的懸浮顆粒時,MTB先感染肺泡巨噬細胞[1]。一般認為,結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展過程中伴隨著機體免疫細胞的凋亡。宿主巨噬細胞凋亡可殺死寄生于其內(nèi)的MTB,阻止MTB在體內(nèi)播散,而未被清除的MTB仍潛伏于宿主巨噬細胞中。近期研究發(fā)現(xiàn),MTB小分子熱休克蛋白(small heat shock proteins, sHsps)Hsp16.3對MTB在宿主巨噬細胞中的潛伏有重要作用。本文將通過對MTB國際標準強毒株H37Rv菌株(H37Rv)與MTB國際標準強毒株H37Rv株Hsp16.3基因缺失突變菌株(△H37Rv)的對比研究,探討MTB小分子熱休克蛋白Hsp16.3的表達與宿主巨噬細胞凋亡的關(guān)系及機制,以期為結(jié)核病的治療帶來新的希望。
1.1模型建立和分組選用8周齡雄性SPF級(無特定病原體動物)昆明小鼠120只(購于石河子大學(xué)實驗動物中心),體質(zhì)量18~20 g,隨機分為△H37Rv(本課題組制備)感染組、H37Rv(中國食品藥品檢定研究院)感染組和無菌生理鹽水對照組(對照組)。每組40只,1、3、5、7、9、11、13、15 d各設(shè)5只。方法參見文獻[2]:在生物安全柜內(nèi),取在改良羅氏培養(yǎng)基上生長2~3周狀態(tài)良好的MTB△H37Rv菌落,置滅菌研菌器中,加少量含0.5 mL/L Tween-20的生理鹽水溶液充分研磨,使其成均勻渾濁的菌懸液。麥氏比濁法調(diào)細菌密度約1.0×107cfu/mL,于每只小鼠尾靜脈內(nèi)注射0.3 mL(約含活菌量3×106cfu/mL)。H37Rv組也按上述方法建立。對照組僅注射滅菌生理鹽水溶液。感染小鼠置生物安全三級實驗室內(nèi),IVC籠具中飼養(yǎng)。
1.2小鼠肺泡巨噬細胞的分離小鼠于感染后第1、3、5、7、9、11、13、15 d經(jīng)眼球放血,脫頸處死,暴露氣管,用消毒好的組織剪在氣管上做一切口(切勿剪斷),用連有注射器的無菌軟皮管從切口處插入氣管,絲線固定,用預(yù)熱至37 ℃的PBS液行支氣管肺泡灌洗,1 mL×10次,收集支氣管肺泡灌洗液,4 ℃ 1 500 r/min離心10 min,PBS液洗滌細胞1次。棄上清,加入含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)瓶中。置37 ℃、50 mL/L CO2孵箱中培養(yǎng)4 h,棄上清液和非貼壁的細胞,貼壁的即為小鼠肺泡巨噬細胞。
1.3激光共聚焦顯微鏡觀察各組感染小鼠肺泡巨噬細胞收集感染小鼠肺泡巨噬細胞,經(jīng)爬片、固定、封閉后,滴加稀釋后的一抗(稀釋度1∶1 500),均勻鋪于玻片上,濕盒內(nèi)放置,4 ℃過夜。PBS沖洗3 min×3次,滴加熒光二抗(稀釋度1∶500),室溫2 h,PBS沖洗干凈,硝酸甘油封片,于激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光強度及著色部位。
1.4小鼠肺泡巨噬細胞凋亡檢測收集各組、各時間點小鼠肺泡巨噬細胞,Annexin V-FITC/PI染色,1 h內(nèi)流式細胞儀檢測細胞凋亡,Cellquest軟件獲取數(shù)據(jù)。
1.5Westernblot檢測收集各組各時間點巨噬細胞,加細胞裂解液冰上裂解30 min,低溫離心12 000r/min×5 min×2次,上清液為提取總蛋白。測定蛋白濃度。進行SDS-PAGE凝膠(120 g/L分離膠+50 g/L濃縮膠)電泳及半干轉(zhuǎn)膜(恒壓23V、維持45 min)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,50 g/L的脫脂奶粉封閉1.5 h,TBST洗脫液洗脫5 min×3次。加稀釋一抗(均為兔多克隆抗體,Caspase-3為1∶1 000, Bcl-2為1∶300,β-actin以1∶1 000),4 ℃孵育過夜。TBST洗脫液洗膜5 min×3次。加入HRP標記的相應(yīng)二抗作用液(1∶3 000稀釋),室溫孵育2 h, 用ECL發(fā)光液顯影。以Quantity One成像系統(tǒng)采集圖像,將獲取的圖像用ImageJ圖像處理軟件分析蛋白相對表達量。
1.6統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件,多組間比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1激光共聚焦顯微鏡觀察各組感染小鼠肺泡巨噬細胞感染小鼠肺泡巨噬細胞內(nèi)MTB膜上的熱休克蛋白Hsp65與一抗(只針對MTB的65 ku的小鼠單克隆抗體)結(jié)合,再與綠色熒光(FITC)標記的二抗結(jié)合。在激光共聚焦顯微鏡下,MTB H37Rv菌株和△H37Rv感染組小鼠肺泡巨噬細胞內(nèi)均可見大量綠色熒光,僅對照組未見綠色熒光(圖1),表明MTBH37Rv菌株和△H37Rv菌株感染小鼠肺泡巨噬細胞的動物模型建立成功。
圖1激光共聚焦顯微鏡觀察各組小鼠肺泡巨噬細胞
Fig.1 Alveolar macrophages of infected mice under CLSM (×200)
A:對照組;B:H37Rv組;C:△H37Rv組。
2.2各組小鼠肺泡巨噬細胞的凋亡情況經(jīng)流式細胞技術(shù)檢測,Cellquest軟件分析,可見各組細胞凋亡率(圖2)并建立了各組小鼠肺泡巨噬細胞的凋亡率-時間曲線(圖3)?!鱄37Rv組巨噬細胞的凋亡率逐漸上升,至感染7 d時達到高峰,隨后逐漸降低。1~7 d內(nèi),各時間點△H37Rv組巨噬細胞凋亡率均顯著高于H37Rv組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),隨時間延長發(fā)生了逆轉(zhuǎn),△H37Rv組巨噬細胞凋亡率9~11 d內(nèi)低于H37Rv組,而13~15 d內(nèi)高于H37Rv菌株組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
圖2流式細胞儀檢測各組小鼠的肺泡巨噬細胞的凋亡情況
Fig.2 Apoptosis of alveolar macrophages of infected mice detected by flow cytometry
A:對照組;B:H37Rv組;C:△H37Rv組。
圖3H37Rv組、△H37Rv組和對照組巨噬細胞凋亡率-時間曲線
Fig.3 Relationship between apoptosis rate and infection time of the microphages in the three groups
2.3各組小鼠肺泡巨噬細胞內(nèi)Caspase-3和Bcl-2蛋白的表達情況Western Blot檢測結(jié)果顯示各時間點H37Rv組和△H37Rv組均可誘導(dǎo)巨噬細胞Caspase-3蛋白表達,與對照組相比,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);隨時間延長,H37Rv和△H37Rv組巨噬細胞Caspase-3的表達水平亦相應(yīng)增加,至感染第7天時達到高峰,而且△H37Rv組在13 d時出現(xiàn)第二次高峰;△H37Rv組Caspase-3表達水平始終高于H37Rv組(圖4、圖5)。
H37Rv組和△H37Rv組各時間點均可誘導(dǎo)巨噬細胞Bcl-2蛋白表達,與對照組相比,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。△H37Rv組巨噬細胞Bcl-2蛋白的表達水平在感染1~7 d無明顯變化,9 d以后逐漸升高,但表達水平始終低于H37Rv組,且7 d后更為顯著(圖4、圖6)。
圖4Westernblot檢測巨噬細胞內(nèi)Caspase-3及Bcl-2蛋白表達情況
Fig.4 Western blot analysis of the protein expressions of Caspase-3 and Bcl-2 in the macrophages
A:對照組;B:H37Rv組;C:△H37Rv組。
圖5各組巨噬細胞Caspase-3的相對表達量-時間曲線
Fig.5 Relationship between relative expression of Caspase-3 and infection time of the microphages in the three groups
圖6各組巨噬細胞Bcl-2的相對表達量-時間曲線
Fig.6 Relationship between relative expression of Bcl-2 and infection time of the microphages in the three groups
MTB是典型的胞內(nèi)致病菌,主要在巨噬細胞等宿主免疫系統(tǒng)細胞內(nèi)存活和繁殖。MTB感染人體后,主要被宿主巨噬細胞吞噬,未被機體免疫系統(tǒng)清除而潛伏下來的MTB也主要寄生于宿主巨噬細胞內(nèi)[3]。MTB感染的后果以及結(jié)核病的發(fā)生與否與宿主巨噬細胞密切相關(guān)[4]。宿主巨噬細胞發(fā)生凋亡后,可殺死寄生于其內(nèi)的MTB,阻止MTB在體內(nèi)播散,并能激活鄰近未感染的巨噬細胞,增強機體對MTB的殺傷能力[5]。因此, 干預(yù)和調(diào)控宿主巨噬細胞的凋亡進程,可促進MTB在宿主巨噬細胞中的成功存活[6]。
在MTB感染過程中,MTB與宿主巨噬細胞相互作用和適應(yīng),調(diào)控宿主巨噬細胞凋亡,MTB有誘導(dǎo)或抑制巨噬細胞凋亡的作用,當這兩種作用達到平衡時,MTB則以休眠狀態(tài)存在于巨噬細胞中,形成所謂的“逃避”,使自身的存活、繁殖與宿主的一系列免疫反應(yīng)達到一種動態(tài)平衡[7]。
Hsp16.3是近年發(fā)現(xiàn)的MTB中一個存在于膜上的主要抗原蛋白,由144個氨基酸組成,分子質(zhì)量為16 277 u,等電點為4.85,序列分析表明屬于sHsps家族。MTB小分子熱休克蛋白Hsp16.3是一個組成性表達蛋白,正常條件下有少量表達[8],在MTB進入靜止生長期時顯著表達[9-10]。MTB進入巨噬細胞后大量表達合成MTB小分子熱休克蛋白Hsp16.3;敲除Hsp16.3基因而得到的突變菌株在體外的生長情況與正常菌株相同,但突變菌株不能在小鼠骨髓衍生的巨噬細胞以及THP-1細胞株中生長[11-12],說明MTB小分子熱休克蛋白Hsp16.3可能對MTB在巨噬細胞中的潛伏起著保護作用。同時有研究進一步證明,MTB進入宿主巨噬細胞時誘導(dǎo)大量表達的Hsp16.3對MTB能夠在宿主巨噬細胞內(nèi)長期生長、繁殖和致病有重要作用,有助于MTB細胞膜增厚以及增強MTB抵抗脅迫環(huán)境,如NO、氧自由基、缺氧等因素的抗氧化能力等,同時使MTB在宿主巨噬細胞內(nèi)轉(zhuǎn)變成靜止期,有助于MTB在宿主巨噬細胞內(nèi)成為滯留菌,長期在宿主巨噬細胞內(nèi)生長繁殖[13-14]。小鼠體內(nèi)實驗研究表明,敲除Hsp16.3基因而得到的突變菌株在感染早期和晚期對小鼠肺泡巨噬細胞有更強的致凋亡作用,這進一步說明MTB小分子熱休克蛋白Hsp16.3的表達抑制了小鼠肺泡巨噬細胞的凋亡[15]。盡管發(fā)現(xiàn)MTB小分子熱休克蛋白Hsp16.3對于MTB在宿主巨噬細胞內(nèi)的生存是必需的,但是其在體內(nèi)的生理功能以及相關(guān)的保護機制卻并不清楚[16]。
天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(cysteine aspartate-specific protease, Caspase)在細胞凋亡的過程中起關(guān)鍵作用,細胞凋亡各個階段都能檢測到不同程度的Caspase增高。Caspase-3是凋亡過程中最關(guān)鍵的蛋白酶,是多種死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分。本研究顯示,在感染的早期(1~7 d)和晚期(13~15 d),△H37Rv組巨噬細胞內(nèi)的Caspase-3表達水平高于H37Rv組;而在感染早期和晚期△H37Rv組巨噬細胞凋亡率也顯著高于H37Rv組,這可能是Caspase-3蛋白表達量的增加促進了巨噬細胞的凋亡,表明MTB小分子熱休克蛋白Hsp16.3的表達抑制了巨噬細胞凋亡的核心因子Caspase-3的表達,這可能是MTB小分子熱休克蛋白Hsp16.3抑制巨噬細胞凋亡、保護MTB處于休眠狀態(tài)的重要作用機制之一。
B細胞淋巴瘤/白血病-2家族位于線粒體外膜上,包括抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-XL等)和促凋亡蛋白(Bax、Bad等)。其中Bcl-2是一種重要的凋亡抑制蛋白,具有保護細胞的功能,Bcl-2的過度表達可引起細胞核谷胱甘肽的積聚,導(dǎo)致核內(nèi)氧化還原平衡改變,從而降低了Caspase的活性,阻止凋亡誘導(dǎo)因子和細胞色素C從線粒體釋放,抑制凋亡[17]。本研究結(jié)果顯示,在感染早期(1~7 d),△H37Rv感染組Bcl-2的表達水平無明顯變化,但在9 d后逐漸升高,而巨噬細胞凋亡率卻在此時逐漸下降,但△H37Rv感染組Bcl-2的表達水平始終低于H37Rv組且7 d后表現(xiàn)更為顯著,這表明Bcl-2表達增加對巨噬細胞的凋亡形成有明顯抑制作用,而MTB小分子熱休克蛋白Hsp16.3的表達促進了Bcl-2蛋白的表達。
由此推斷:在MTB感染的早期和晚期,MTB小分子熱休克蛋白Hsp16.3的表達能有效抑制小鼠肺泡巨噬細胞凋亡,可能通過抑制Caspase-3表達以及促進Bcl-2表達而實現(xiàn)。這將為結(jié)核病的預(yù)防、控制和根除提供新的靶點,同時也為結(jié)核病治療時間的選擇提供了理論依據(jù)。
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