肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制及干預(yù)的研究進(jìn)展

李滿祥，盧家美

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院：1. 呼吸病研究室；2. 呼吸內(nèi)科，陜西西安 710004)

肺動脈高壓(pulmonary artery hypertension, PAH)是一組由多種病因引起的肺血管床受累，導(dǎo)致肺血管阻力和肺動脈壓力進(jìn)行性升高為特征的臨床綜合征[1]。其發(fā)病機(jī)制包括肺血管緊張性增高、結(jié)構(gòu)性重塑及原位血栓形成，其中肺血管重塑在各種類型的PAH發(fā)病中起關(guān)鍵性作用，而肺動脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cells, PASMCs)的異常增殖是構(gòu)成肺血管重塑的主要病理基礎(chǔ)[2]。因此，探索介導(dǎo)PASMCs增殖的分子機(jī)制及相關(guān)干預(yù)是目前PAH領(lǐng)域的研究熱點。本文就近年來與PASMCs增殖相關(guān)的分子信號機(jī)制做一回顧，并將相關(guān)干預(yù)研究的進(jìn)展做一小結(jié)。

1 肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制

1.1RhoA/ROCK信號通路RhoA是Rho家族中重要的一員，隸屬于Ras超家族小分子GTP蛋白。RhoA有GTP偶聯(lián)(激活)和GDP偶聯(lián)(失活)兩種存在狀態(tài)，多種細(xì)胞外活性介質(zhì)可通過與其特異性受體結(jié)合激活與之偶聯(lián)的RhoA蛋白分子。ROCK作為RhoA下游的主要靶分子，可傳遞或執(zhí)行RhoA的多種細(xì)胞生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn)，RhoA/ROCK信號通路在多種生理及病理生理狀態(tài)下起重要的作用，廣泛參與細(xì)胞收縮、遷移、增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)等的調(diào)控[3]。

早期研究發(fā)現(xiàn)，RhoA/ROCK信號通路介導(dǎo)了多種縮血管物質(zhì)誘導(dǎo)的血管收縮，進(jìn)一步研究證實該信號通路的活化與PASMCs增殖也密切相關(guān)[4]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，與多種PAH發(fā)病密切相關(guān)的5-羥色胺(5-HT)可于體外激活RhoA活性并誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的大鼠PASMCs增殖，以藥理學(xué)方法抑制RhoA/ROCK信號通路可阻斷5-HT的上述效應(yīng)[5]。TAJSIC等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧引起的PAH模型中，RhoA/ROCK信號通路的活性增強(qiáng)，抑制該信號通路可明顯抑制缺氧誘發(fā)的肺血管重塑。提示RhoA/ROCK信號通路介導(dǎo)了肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖/肺血管重塑及其隨后的PAH發(fā)生。

目前，認(rèn)為RhoA/ROCK信號通路介導(dǎo)PASMCs增殖的下游分子機(jī)制包括兩個方面[7-8]：①上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)的生成及分泌，破壞MMP/TIMP之間的平衡，促使細(xì)胞外間質(zhì)破壞及降解，釋放多種生長因子進(jìn)而誘導(dǎo)PASMCs增殖；②活化的RhoA可促使磷酸化的ERK1/2 MAPK核轉(zhuǎn)移，使其在細(xì)胞核內(nèi)磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子以啟動相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，通過調(diào)控增殖相關(guān)基因的表達(dá)介導(dǎo)了PASMCs的增殖。

1.2ERK1/2MAPK信號通路細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中的成員之一，其活性改變與多種惡性腫瘤、心血管疾病、糖尿病等發(fā)病密切相關(guān)，多種細(xì)胞外刺激可激活該信號通路。ERK1/2 MAPK信號通路的激活遵循MAPK家族的3級酶促連鎖反應(yīng)。Ras作為其上游激活蛋白激活Raf(MAPKKK)，進(jìn)而依次激活MEK(MAPKK)和ERK(MAPK)，完成了Ras-Raf-MEK-ERK信號途徑的活化。該信號通路廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、存活/凋亡等多種生理、病理過程。

研究發(fā)現(xiàn)，ERK1/2 MAPK作為主要促細(xì)胞增殖的信號通路參與包括PASMCs在內(nèi)的多種細(xì)胞的增殖。LI等[9]研究表明，5-HT可激活牛PASMCs中ERKl/2 MAPK信號通路，抑制該信號通路可明顯抑制5-HT誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞增殖。進(jìn)一步的研究證實，在多種PAH動物模型中ERKl/2 MAPK信號通路的活性明顯增強(qiáng)，并伴有明顯的肺血管重塑；預(yù)先敲除ERK1/2基因，則可預(yù)防/阻斷模型動物中肺血管重塑的發(fā)生及PAH的產(chǎn)生[10]。有研究提示，ERK1/2 MAPK介導(dǎo)PASMCs增殖的機(jī)制可能與其磷酸化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子(例如，Sep-1a、EIK-1、Jun、Fos)，促進(jìn)與細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)(如Cyclin D)相關(guān)[8]。

1.3PI3K/AKT信號通路PI3K/AKT信號通路參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、葡萄糖轉(zhuǎn)運等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。PI3K可經(jīng)兩種方式激活，一是活化的小分子G蛋白Ras與PI3K的p110亞單位(催化亞基)結(jié)合激活PI3K，另一種方式是酪氨酸激酶受體與多種生長因子結(jié)合導(dǎo)致受體二聚體化，從而激活受體的酪氨酸激酶，進(jìn)而激活PI3K。激活后的PI3K可使細(xì)胞膜上的PIP2磷酸化為PIP3,進(jìn)而激活蛋白激酶B(AKT)。AKT可激活或抑制下游多種靶分子，調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、浸潤、轉(zhuǎn)移、存活/凋亡等[11]。

研究發(fā)現(xiàn)，缺氧及生長因子可激活PASMCs中PI3K/AKT信號通路的活性，誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞增殖；抑制PI3K或AKT的功能可抑制缺氧及生長因子刺激的平滑肌細(xì)胞增殖，提示PI3K/AKT信號通路可特異性介導(dǎo)PASMCs的增殖[12]。WANG等[13]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT信號通路可通過差異性調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)(上調(diào)Cyclin D和下調(diào)p27表達(dá))，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展，導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞增殖。動物研究進(jìn)一步證實，抑制PI3K/AKT信號通路可預(yù)防及治療多種誘因?qū)е碌腜AH的發(fā)生[14]。

1.4BMP/TGF-β-Smad信號通路骨形成蛋白(BMP)屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)家族的一員，廣泛調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化及凋亡[15]。BMP可使BMP受體Ⅰ(BMPRⅠ)與BMP受體Ⅱ(BMPRⅡ)形成異聚體，活化的BMPRⅡ激活BMPRⅠ，進(jìn)而磷酸化下游多種亞型的Smad蛋白，使不同亞型的Smad形成異聚體并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，通過上調(diào)DNA結(jié)合抑制蛋白(Id)的表達(dá)，抑制bHLH類轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生物學(xué)功能[16]。

研究發(fā)現(xiàn)，BMPRⅡ基因突變在家族遺傳性PAH及特發(fā)性PAH的發(fā)病中起重要作用[17]。BMPRⅡ基因突變可導(dǎo)致Smad 1/5活性降低，DNA結(jié)合抑制蛋白(Id)表達(dá)減少，削弱了其對平滑肌細(xì)胞增殖的抑制作用及促凋亡作用，導(dǎo)致PASMCs過度增殖，進(jìn)而導(dǎo)致PAH的發(fā)生。新近研究發(fā)現(xiàn)，BMPRⅡ功能異?；虮磉_(dá)減低亦可見于缺氧及野百合堿誘發(fā)的PAH動物模型中，提示恢復(fù)BMPRⅡ功能及表達(dá)可能對多種PAH的干預(yù)均具有重要意義[18]。

1.5鈣激活的Calcineurin/NFAT信號通路Calcineurin/NFAT信號通路在介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣信號傳遞過程中起重要作用。Calcineurin是一種鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性絲氨酸、蘇氨酸去磷酸化酶，可使胞質(zhì)內(nèi)活化T細(xì)胞核因子(NFAT)家族轉(zhuǎn)錄因子去磷酸化并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，與其它信號通路調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子(AP1、GATA等)協(xié)同調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)細(xì)胞收縮、增殖、分化、炎癥反應(yīng)等多種功能[19]。多種細(xì)胞外刺激及介質(zhì)可通過誘導(dǎo)細(xì)胞外鈣內(nèi)流及細(xì)胞內(nèi)鈣釋放激活該信號通路。

早期研究發(fā)現(xiàn)，Calcineurin / NFAT信號通路參與調(diào)控淋巴細(xì)胞炎癥反應(yīng)[20]，隨后的研究證實該信號通路的激活介導(dǎo)了心肌細(xì)胞肥厚及多種腫瘤細(xì)胞增殖[21-22]。新近的研究發(fā)現(xiàn), Calcineurin/NFAT信號通路與PAH的發(fā)生密切相關(guān)。本課題組的研究證實，Calcineurin/NFAT信號通路可特異性上調(diào)Cyclin A的表達(dá)并激活Cyclin依賴性激酶(CDK)，引起DNA合成增加及細(xì)胞周期進(jìn)展，促進(jìn)PASMCs的增殖進(jìn)而參與PAH的發(fā)病[23]。體內(nèi)研究證實，在缺氧誘發(fā)的PAH動物模型中可檢測到Calcineurin/NFAT信號通路的激活，通過藥理學(xué)方法抑制該信號通路可顯著減輕肺血管重塑并抑制PAH的發(fā)生[24]。

1.6Notch3信號通路Notch系統(tǒng)是一個高度保守的細(xì)胞信號通路，與細(xì)胞的增殖、分化、收縮、遷移等細(xì)胞生物學(xué)功能密切相關(guān)。當(dāng)Notch受體與其配基結(jié)合后，誘發(fā)兩次連續(xù)的Notch受體裂解反應(yīng)，釋放出Notch受體的細(xì)胞內(nèi)域(NICD)并進(jìn)入細(xì)胞核，與細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子C啟動子結(jié)合因子-1(CBF1)結(jié)合，取代 CBF1與共抑制子(CIR、SKIP、SHARP、SMRT等)結(jié)合并召集共激活子，從而激活轉(zhuǎn)錄因子CBF1的活性，以調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)[25]。

研究發(fā)現(xiàn)，Notch3信號通路特異性的參與了PAH的發(fā)生。LI等[26]研究提示，在正常PASMCs中僅表達(dá)低水平的Notch3受體，但在PAH患者或動物模型中PASMCs的Notch3受體表達(dá)明顯增加，且Notch3受體表達(dá)量與PAH的嚴(yán)重性呈正相關(guān)。體外實驗也證實，Notch3信號通路的活化可刺激PASMCs增殖，而基因技術(shù)阻抑Notch3受體表達(dá)可抑制PASMCs的增殖[27]。但是，Notch3信號通路通過活化調(diào)控哪些靶基因的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致PASMCs增殖，目前尚不清楚。

2 抑制肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖的干預(yù)研究

隨著對PAH發(fā)病機(jī)制的深入研究，針對其發(fā)病機(jī)制中關(guān)鍵分子的靶向治療已經(jīng)越來越受到人們的關(guān)注。一些新型抗PAH藥物不斷出現(xiàn)，5型磷酸二酯酶抑制劑、內(nèi)皮素受體拮抗劑、前列環(huán)素類似物等已經(jīng)用于臨床，用于數(shù)種PAH 的治療[24]。體外細(xì)胞培養(yǎng)及動物研究提示，他汀類降脂藥物、PPAR-γ受體激動劑、環(huán)孢素A等亦具有抑制PASMCs增殖的作用，有望成為治療PAH的新方法。下文將對這些治療藥物做一概述。

2.15型磷酸二酯酶(PDE5)抑制劑西地那非是PDE5特異性抑制劑，已廣泛用于多種類型PAH的治療并取得良好效果，且耐受性較好[24]。該類藥物的作用機(jī)制在于擴(kuò)張肺動脈、抑制肺血管平滑肌細(xì)胞增殖。分子生物學(xué)研究提示，PDE5抑制劑從如下方面發(fā)揮抑制PASMCs的作用：①抑制cGMP的降解，通過激活PKG信號通路廣泛抑制多個促平滑肌細(xì)胞增殖的信號機(jī)制[28-29]；②上調(diào)絲裂原激活蛋白激酶磷酸酶-1(MKP-1)的表達(dá)，去磷酸化ERK1/2，進(jìn)而抑制ERK1/2 MAPK介導(dǎo)的PASMCs增殖[30]。

2.2前列環(huán)素類似物研究發(fā)現(xiàn)，PAH患者中前列環(huán)素合成酶的水平降低，前列環(huán)素的產(chǎn)生明顯減少。前列環(huán)素治療PAH的機(jī)制在于其擴(kuò)張肺血管并抑制PASMCs增殖。前列環(huán)素在臨床上用于PAH的治療已有10余年的時間，可明顯提高運動耐力，改善血流動力學(xué)指標(biāo)，提高患者生活質(zhì)量。但早期的前列環(huán)素類似物半衰期較短，需長期持續(xù)給藥。目前長效前列環(huán)素類似物已用于臨床，可口服、靜脈及局部吸入給藥[31]。前列環(huán)素抑制PASMCs增殖的分子機(jī)制在于：①通過刺激cAMP的產(chǎn)生，激活PKA從而抑制平滑肌細(xì)胞增殖[32]；②通過cAMP依賴性上調(diào)DNA結(jié)合抑制蛋白(Id)，抑制平滑肌細(xì)胞增殖[33]。

2.3內(nèi)皮素受體拮抗劑內(nèi)皮素(ET)不僅是一種重要的血管活性物質(zhì)，還具有促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖的功能，在各種PAH發(fā)病中起重要作用。波生坦作為非選擇性內(nèi)皮素受體(ETR)拮抗劑，已在我國及歐美用于治療WHO心功能分級為Ⅲ～Ⅳ級的動脈型及血栓栓塞性PAH。大量臨床研究及循證醫(yī)學(xué)證據(jù)證實，ETR拮抗劑可提高PAH患者運動耐量及生存率，顯著改善血液動力學(xué)指標(biāo)，但不引起體循環(huán)血壓下降[34]。該類藥物可阻斷ET-1與ETR特異性結(jié)合后激活的促細(xì)胞增殖的Calcineurin/NFAT、RhoA/ROCK等信號通路，從而發(fā)揮抑制PASMCs增殖的作用[35]。

2.4他汀類降脂藥他汀類藥物是一種3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，已作為降血脂藥物廣泛用于臨床。研究證實，他汀類降脂藥具有廣泛的心血管保護(hù)作用，其機(jī)制不能以單純的降血脂作用來解釋[36]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該類藥物可抑制PAH模型中的肺血管重塑，這與該類藥物抑制PASMCs增殖有關(guān)[28]。他汀類藥物抑制PASMCs增殖的機(jī)制與其抑制小分子G蛋白RhoA的激活及序列性上調(diào)HO-1和p21的表達(dá)以抑制細(xì)胞周期進(jìn)展有關(guān)[37-38]。但是，目前他汀類藥物用于PAH治療的研究僅限于實驗動物水平，其臨床療效尚有待進(jìn)一步驗證。

2.5PPAR-γ受體激動劑過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)是一種依賴配體激活的核受體轉(zhuǎn)錄因子，激活的PPAR-γ可與維甲酸受體X形成異二聚體進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[39]。PPAR-γ可調(diào)控細(xì)胞的分化、增殖、代謝等多種功能，作為藥物的治療靶點，其激動劑羅格列酮已應(yīng)用于糖尿病的治療。目前的研究證實，激活PPAR-γ可抑制體外培養(yǎng)的PASMCs的增殖及模型動物中PAH的發(fā)生[40]。其抑制PASMCs增殖的機(jī)制在于序列性上調(diào)HO-1及p21WAF1的表達(dá)，抑制CDK活性，阻礙細(xì)胞G1→S期的進(jìn)展[39]。需要注意的是羅格列酮在臨床中表現(xiàn)出不良的心血管事件，使用此類藥物需嚴(yán)密監(jiān)測。但隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，高效價、安全的新型PPAR-γ受體激動劑必將有望研制成功，為PAH治療帶來廣闊的前景。

2.6環(huán)孢素A環(huán)孢素A(CsA)作為一種強(qiáng)效免疫抑制劑已廣泛用于器官移植后的排異反應(yīng)，其作用機(jī)制在于CsA特異性抑制Calcineurin磷酸酶的活性，使其下游的轉(zhuǎn)錄因子NFAT不能去磷酸化活化，從而抑制其介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)[41]。研究發(fā)現(xiàn)，Calcineurin/NFAT信號通路亦介導(dǎo)了體外PASMCs的增殖及PAH動物模型中肺血管重塑的發(fā)生，而CsA可抑制PASMCs的增殖及其動物模型中的肺血管重塑，從而抑制PAH的發(fā)生[28,42]，提示CsA具有潛在的治療PAH的價值，值得進(jìn)一步的研究驗證。

3 結(jié) 語

肺動脈高壓是一種發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、預(yù)后極差的疾病。PASMCs與PAH的發(fā)病關(guān)系密切，其異常增殖是肺血管結(jié)構(gòu)性重塑的關(guān)鍵病理基礎(chǔ)，可導(dǎo)致血管緊張性增高、管壁增厚和管腔狹窄，致使血管阻力進(jìn)行性升高，最終誘發(fā)PAH[43]。而持續(xù)的PAH可導(dǎo)致右心衰竭甚至死亡。因此，進(jìn)一步探索PASMCs增殖的分子機(jī)制、尋求新的抑制其增殖的治療靶點和有效治療模式，是PAH治療的關(guān)鍵和研究熱點。

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