蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因的克隆、原核表達(dá)及其功能分析

杜次，李菁，唐云濤，彭清忠

1 吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000

2 植物資源保護(hù)與利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 吉首 416000

蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因的克隆、原核表達(dá)及其功能分析

杜次1,2，李菁1,2，唐云濤1,2，彭清忠1,2

1 吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000

2 植物資源保護(hù)與利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 吉首 416000

賴氨酸脫羧酶 (Lysine decarboxylase, LDC) 是抗老年癡呆藥——石杉堿甲生物合成的第一個(gè)酶。為了研究蛇足石杉中LDC的特性和功能，以其總RNA為模板，通過RT-PCR擴(kuò)增得到2個(gè)賴氨酸脫羧酶基因LDC1和LDC2，克隆至pMD?19-T中測序發(fā)現(xiàn)，兩基因同源性為95.3%，分別編碼212和202個(gè)氨基酸。將兩基因引入pET-32a(+)構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)/LDC1和pET-32a(+)/LDC2，分別轉(zhuǎn)入BL21(ED3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，在30 ℃條件下獲得可溶性表達(dá)產(chǎn)物Trx-LDC1和Trx-LDC2；采用Ni-NTA親和層析法純化目的蛋白，建立酶促反應(yīng)體系分析其脫羧酶活性，薄層層析 (TLC) 檢測表明重組融合蛋白Trx-LDC1和Trx-LDC2均能催化賴氨酸脫羧生成尸胺。利用生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)LDC1和LDC2理化性質(zhì)存在差異，但預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)基本一致。

蛇足石杉，賴氨酸脫羧酶，基因克隆，原核表達(dá)，酶活性，結(jié)構(gòu)預(yù)測

蛇足石杉[Huperzia serrata (Thumb.) Trev.]為石杉科石杉屬蕨類植物，別名千層塔、金不換、蛇足草等，系我國傳統(tǒng)中草藥，常用于治療瘀血腫痛、跌打損傷、肌肉痙攣、精神分裂等疾病[1-2]。上世紀(jì)80年代我國科學(xué)家首次從蛇足石杉中分離出石杉堿甲 (Huperzine A)，后經(jīng)研究證明是一種高效、可逆、選擇性強(qiáng)的乙酰膽堿酯酶抑制劑，治療老年癡呆癥 (Alzheimer's disease, AD) 療效顯著，而且具有毒性低、生物利用率高、易穿透血腦屏障、藥效長等優(yōu)點(diǎn)[2-4]。由于優(yōu)于同類其他藥物，石杉堿甲作為新一代治療老年癡呆藥物引起醫(yī)藥界的極度重視，而其藥源植物蛇足石杉也受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。

蛇足石杉生長緩慢、資源更新周期長，而石杉堿甲在全草中含量甚微，近些年由于提取石杉堿甲的高額利潤，對野生蛇足石杉進(jìn)行地毯式采收，使得該類植物資源日趨枯竭。一些學(xué)者嘗試尋求新途徑獲取石杉堿甲，如化學(xué)合成法、組織培養(yǎng)法、微生物發(fā)酵法等[5-10]，雖取得一些進(jìn)展，但離生產(chǎn)實(shí)踐有很遠(yuǎn)距離。解決資源短缺和實(shí)現(xiàn)新途徑生產(chǎn)石杉堿甲，首先有必要從分子水平理解石杉堿甲的生物合成機(jī)制。目前一些研究表明，石杉堿甲生物合成是以賴氨酸脫羧酶 (Lysine decarboxylase, LDC)介導(dǎo)賴氨酸脫羧開始，接著由銅氨氧化酶(Copper amine oxidase) 催化尸胺生成四氫吡啶(2,3,4,5-Tetrahydropyridine)，然后經(jīng)過一系列的酶促反應(yīng)生成石杉堿甲[3,11-12]。Sun等[13]曾對蛇足石杉中銅氨氧化酶基因進(jìn)行克隆和功能鑒定，但是目前尚未見賴氨酸脫羧酶基因功能表征方面的研究報(bào)道，而關(guān)于石杉堿甲整個(gè)合成途徑中的關(guān)鍵基因和調(diào)控機(jī)理也知之甚少。鑒于此，本研究擬采用RT-PCR方法從蛇足石杉中克隆賴氨酸脫羧基因，對其進(jìn)行重組表達(dá)和功能分析，以及生物信息學(xué)分析，以期豐富賴氨酸脫羧酶家族分子信息，為闡明蛇足石杉中石杉堿甲生物合成機(jī)制提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌BL21(DE3)、大腸桿菌JM109，質(zhì)粒pET-32a(+)為本實(shí)驗(yàn)室保藏；質(zhì)粒pMD?19-T購自大連寶生物工程有限公司(TaKaRa)。

1.1.2酶和試劑

Ex Taq?DNA聚合酶、T4 DNA 連接酶、NcoⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶，DL2 000 DNA marker，Protein molecular weight marker (Low)，Total RNA提取試劑 RNAiso Plus，PrimeScript?1st Strand cDNA Synthesis Kit，Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit Ver.2.0和MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.3.0均購自TaKaRa公司；Ni-NTA SefinoseTMResin Kit，IPTG和磷酸吡哆醛均購自上海生物工程有限公司；賴氨酸 (L-lysine) 和尸胺 (Cadaverine) 購自Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.1.3材料

蛇足石杉樣品采自湖南省古丈縣高望界自然保護(hù)區(qū)，經(jīng)吉首大學(xué)張代貴高級實(shí)驗(yàn)師鑒定為蛇足石杉。

1.2 方法

1.2.1總RNA提取及cDNA合成

野外采集蛇足石杉完整植株 (帶土壤)，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。從植株上剪取幼嫩葉片約100 mg，置于液氮預(yù)冷的研缽中迅速研磨成粉，立即使用RNAiso Plus試劑提取總RNA。采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，并用分光光度計(jì)測定RNA濃度，提取的總RNA于–70 ℃保存?zhèn)溆?。利用TaKaRa公司提供的PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按其說明書操作流程，以蛇足石杉總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

1.2.2 LDC基因克隆與測序

從NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索賴氨酸脫羧酶相關(guān)基因進(jìn)行同源比對，根據(jù)序列保守區(qū)域，采用vector NTI軟件設(shè)計(jì)一對包含全長LDC基因的擴(kuò)增引物L(fēng)DC-F和LDC-R (表1)，以cDNA第一鏈為模板擴(kuò)增蛇足石杉的LDC基因片段。配制50 μL反應(yīng)體系：10×Ex PCR緩沖液5.0 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 4.0 μL，引物 (LDC-F和LDC-R) 各1.0 μL，Ex Taq聚合酶0.25 μL，cDNA 4.0 μL，補(bǔ)加ddH2O至終體積50 μL；PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primers used in this study

利用Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit Ver.2.0對PCR產(chǎn)物進(jìn)行割膠純化，電泳檢測純化結(jié)果，并用紫外分光光度計(jì)測定其濃度。按廠家說明書將純化的DNA片段連接至載體pMD?19-T上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞JM109，通過氨芐抗性和藍(lán)白斑篩選，挑取陽性菌落進(jìn)行PCR檢測，從檢測合格的重組菌株中提取質(zhì)粒，送TaKaRa公司測序。

1.2.3 LDC基因的原核表達(dá)

根據(jù)LDC基因序列設(shè)計(jì)一對引物L(fēng)DC-eF和LDC-eR (表1)，分別在引物5'端引入NcoⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。以1.2.2中的重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化擴(kuò)增產(chǎn)物，采用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切；同時(shí)對表達(dá)載體pET-32a(+)進(jìn)行雙酶切。采用MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.3.0對酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化，分光光度計(jì)檢測各酶切產(chǎn)物濃度。利用T4 DNA連接酶于4 ℃對兩純化產(chǎn)物進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，在氨芐和氯霉素抗性平板上篩選轉(zhuǎn)化子。從平板上挑取多個(gè)菌落進(jìn)行全菌PCR檢測，提取相應(yīng)克隆子的重組質(zhì)粒，并進(jìn)行NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定。

將鑒定的陽性克隆子接種至LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃搖床培養(yǎng)3?4 h (OD600約為1.0)，添加IPTG (終濃度260 μg/mL)，繼續(xù)30 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng) (150 r/min) 4 h。同時(shí)以空載體重組菌BL21(DE3)/pET-32a(+)作對照。取經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)的菌液于1.5 mL離心管中，離心收集菌體，用PBS洗滌和重懸菌體。重懸菌液分2份，其中一份加入2 μL溶菌酶 (100 mg/mL)，室溫靜置10 min后反復(fù)凍融3次，12 000 r/min離心10 min，收集上清液和沉淀。分別在上清、沉淀、全菌 (另一份) 和對照組全菌中加入等體積的2×上樣緩沖液，沸水浴3 min，短暫離心后于12%的SDS-PAGE中電泳檢測。

1.2.4表達(dá)產(chǎn)物純化及活性鑒定

將重組菌接種于1 L液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體，PBS洗滌3次，使用Ni-NTA SefinoseTMResin蛋白純化試劑盒中的結(jié)合緩沖液重懸菌體，溶菌酶酶解，冰浴超聲破碎細(xì)胞，12 000 r/min離心收集上清液。按照試劑盒操作說明，采用Ni-NTA純化柱進(jìn)行重組蛋白純化，12%的SDS-PAGE電泳檢測純化結(jié)果。

在1.5 mL離心管中配制500 μL酶反應(yīng)體系，使各試劑終濃度分別為：磷酸鉀緩沖液(pH 8.0) 100 mmol/L、磷酸吡哆醛 (PALP) 0.20 mmol/L、賴氨酸10.0 mmol/L、重組賴氨酸脫羧酶1.00 mg/mL。將反應(yīng)混合液于37 ℃水浴鍋中反應(yīng)至出現(xiàn)渾濁，向反應(yīng)液中加入1滴濃HCl混勻，然后加入500 μL氯仿劇烈振蕩，10 000 r/min離心10 min棄去兩相中間不溶物。氮吹儀40 ℃吹干，干燥后的兩相殘留物用1 mol/L的HCl溶解，取溶解后的上清用丹磺酰氯衍生劑進(jìn)行衍生，同時(shí)對賴氨酸和尸胺標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行丹磺酰氯衍生，氯仿萃取濃縮衍生物進(jìn)行薄層層析 (TLC) 檢測，展開劑為氯仿、乙醚、三乙胺 (配比為8∶1∶2)。使用全自動點(diǎn)樣儀(CAMAG ATS 4，瑞士) 點(diǎn)樣，全自動展開儀(CAMAG ADC 2，瑞士) 進(jìn)行展開，然后用TLC Visualizer進(jìn)行檢測成像。

1.2.5 LDC基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

LDC基因編碼蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測采用ExPASy Bioinformatics Resource Portal 提供的在線工具Protparam (http://web.expasy.org/ protparam/)；LDC蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)搜索分別采用在線工具PROSITE (http://prosite.expasy.org/) 和NCBI 在線工具 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ structure/cdd/wrpsb.cgi/)；蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析和三維建模采用SWISS-MODEL (http:// swissmodel.expasy.org/)。

2 結(jié)果與分析

2.1 LDC基因的克隆和序列分析

根據(jù)植物賴氨酸脫羧酶相關(guān)基因和EST同源序列設(shè)計(jì)保守引物，利用RT-PCR技術(shù)從蛇足石杉莖尖嫩葉總RNA中擴(kuò)增獲得2個(gè)基因片段，如圖1所示，長度分別約為1 100 bp和650 bp。對擴(kuò)增所得的2個(gè)基因片段進(jìn)行克隆測序，采用Vector NTI 軟件分析，發(fā)現(xiàn)兩序列均包含有完整開放閱讀框，長度分別為639 bp和609 bp，編碼212個(gè)和202個(gè)氨基酸，兩編碼基因分別命名為LDC1和LDC2；同源比對分析發(fā)現(xiàn)，LDC1除在3'末端比LDC2多出30 bp小片段外，其余序列均完全一致，兩者同源性為95.3%。將2個(gè)基因送GenBank注冊，Accession number分別為JQ308624.1和JQ308625.1。

2.2 賴氨酸脫羧酶基因的原核表達(dá)

采用1.2.3中的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，分別在LDC基因起始密碼部位引入NcoⅠ酶切位點(diǎn)，終止密碼后引入XhoⅠ酶切位點(diǎn)。純化的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切、回收后，與經(jīng)過同樣雙酶切的表達(dá)載體pET-32a(+)進(jìn)行連接，即構(gòu)建成重組質(zhì)粒pET-32a(+)/LDC，構(gòu)建過程如圖2所示。

重組質(zhì)粒pET-32a(+)/LDC轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，通過PCR擴(kuò)增和NcoⅠ/XhoⅠ雙酶切篩選陽性克隆子。將鑒定正確的重組菌株接種于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)IPTG低溫誘導(dǎo)表達(dá)發(fā)現(xiàn)，含pET-32a(+)/LDC1的重組菌株和含pET-32a(+)/LDC2的重組菌株分別產(chǎn)生Trx-LDC1和Trx-LDC2融合蛋白，如圖3A所示。Trx-LDC1和Trx-LDC2融合蛋白大小約為40 kDa，在重組菌破碎后的上清液和沉淀部分均存在，其中沉淀部分含量較高，表明融合蛋白的可溶性比例較少。根據(jù)融合蛋白所帶組氨酸標(biāo)簽，采用Ni-NTA柱對可溶性重組蛋白進(jìn)行純化，獲得純度較高的融合蛋白Trx-LDC1和Trx-LDC2，如圖3B所示。

2.3 重組賴氨酸脫羧酶的活性鑒定

按照文獻(xiàn)[14]和[15]方法分別建立Trx-LDC1和Trx-LDC2融合蛋白酶促反應(yīng)體系，37 ℃進(jìn)行催化反應(yīng)后加入濃HCl終止反應(yīng)，并通過氯仿萃取去除重組融合蛋白；兩液相反應(yīng)物干燥后與丹磺酰氯進(jìn)行?；苌磻?yīng)，由于丹磺?；哂袕?qiáng)烈熒光，衍生物能利用薄層層析 (TLC) 進(jìn)行檢測，如圖4所示，兩融合蛋白反應(yīng)體系中均有尸胺生成 (泳道2和3)，而加熱滅活的融合蛋白反應(yīng)體系中未檢測到尸胺(泳道4和5)，據(jù)此，可以推測融合蛋白Trx-LDC1和Trx-LDC2具有賴氨酸脫羧酶活性，能催化賴氨酸脫羧生成尸胺。

圖1 賴氨酸脫羧酶基因的RT-PCR擴(kuò)增Fig. 1 RT-PCR amplification of LDC gene from Huperzia serrata. M: DNA marker; 1, 2: RT-PCR products of LDC gene; ct: control.

圖2 重組質(zhì)粒pET-32a(+)/LDC的構(gòu)建Fig. 2 Construction of recombinant plasmid pET-32a(+)/LDC.

圖3 重組蛋白Trx-LDC1和Trx-LDC2的SDS-PAGE電泳Fig. 3 SDS-PAGE analysis of recombinant Trx-LDC1 and Trx-LDC2. (A) Unpurified recombinant fusion proteins. (B) Purified recombinant fusion proteins. M: protein molecular weight markers; 1, 2 and 3: supernatant, precipitation and entire cell from BL21(DE3) transformants including pET32a(+)/LDC1 respectively; 4, 5 and 6: supernatant, precipitation and entire cell from BL21(DE3) transformants including pET32a(+)/LDC2 respectively; ct: recombinant cells only with pET-32a(+). LDC1: purified Trx-LDC1; LDC2: purified Trx-LDC2.

圖4 重組蛋白Trx-LDC1和Trx-LDC2酶促反應(yīng)的TLC檢測Fig. 4 TLC detection of recombinant Trx-LDC1/ Trx-LDC2 enzyme reaction. 1: Cadaverine (Cad); 2, 3: products of Trx-LDC1/Trx-LDC2 enzyme reaction respectively; 4, 5: products of boiling-inactivated Trx-LDC1/Trx-LDC2 enzyme reaction respectively; 6: L-lysine.

2.4 LDC基因編碼蛋白的理化性質(zhì)和空間結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.4.1 LDC理化性質(zhì)

LDC1基因預(yù)測編碼212個(gè)氨基酸，LDC2編碼202個(gè)氨基酸，根據(jù)ExPASy Bioinformatics Resource Portal 提供的在線工具Protparam對兩基因編碼蛋白進(jìn)行分析，推測LDC1分子式為C1035H1650N274O302S10，分子量為23.08 kDa，等電點(diǎn)PI為5.59；帶負(fù)電殘基(Asp + Glu)為28，帶正電殘基(Arg + Lys)為23；LDC1的不穩(wěn)定系數(shù)為31.96，脂肪系數(shù)為97.45，親水系數(shù)為0.008。LDC2分子式為C985H1589N267O282S9，分子量為21.97 kDa，等電點(diǎn)PI為7.74；帶負(fù)電殘基(Asp + Glu)為24，帶正電殘基(Arg + Lys)為25；LDC2的不穩(wěn)定系數(shù)為25.59，脂肪系數(shù)為100.35，親水系數(shù)為0.013。結(jié)果表明兩蛋白理化性質(zhì)有一些差異。

2.4.2 LDC的二級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過在線軟件對LDC1和LDC2二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示LDC1的二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)構(gòu)成，分別占43.8%和34.4%，無規(guī)則卷曲占21.8%；同樣LDC2的二級結(jié)構(gòu)也主要由α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)構(gòu)成，分別占43.5%和34.2%，無規(guī)則卷曲占22.3%。由SWISS-MODEL在線分析軟件對LDC1和LDC2進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)模建，得到三維模型如圖5所示。雖然LDC1比LDC2在C末端多出10個(gè)氨基酸，但從二級結(jié)構(gòu)預(yù)測和三維結(jié)構(gòu)模建可知，LDC1和LDC2的高級結(jié)構(gòu)基本一致，從而表現(xiàn)出相同的生物活性。

圖5 LDC1和LDC2的三維結(jié)構(gòu)模建Fig. 5 Predicted three-dimensional structures of LDC1 and LDC2.

3 討論

目前有關(guān)石杉堿甲生物合成途徑、代謝調(diào)控機(jī)理及關(guān)鍵基因功能的研究資料非常匱乏。一些研究表明賴氨酸脫羧酶是參與石杉堿甲生物合成的第一個(gè)酶/入口酶[3,11-12]，但是在蛇足石杉和其他石杉科植物中均未見編碼該酶基因的研究報(bào)道。本研究根據(jù)其他植物賴氨酸脫羧酶基因和推測的EST序列設(shè)計(jì)保守引物，從蛇足石杉中成功克隆出2個(gè)賴氨酸脫酶基因 (LDC1和LDC2)，同源性達(dá)95%，即LDC1除在3'末端比LDC2多30 bp外，其余序列均一致；由于兩者的編碼蛋白LDC1比LDC2多10個(gè)氨基酸，生物信息學(xué)分析表明LDC1和LDC2理化性質(zhì)存在差異，但是其預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)基本一致，這與其后分析的兩重組表達(dá)蛋白均具有催化賴氨酸脫羧基功能相印證。根據(jù)這些結(jié)果我們可以推測LDC1在C末端多出的10個(gè)氨基酸并非其酶活性中心或底物結(jié)合區(qū)域序列，或也非其他必需氨基酸序列，不影響該酶的結(jié)構(gòu)和功能；蛇足石杉中為什么存在如此形式的2個(gè)LDC基因尚不清楚，但在此可進(jìn)一步推測LDC1和LDC2可能來源于同一祖先基因，在進(jìn)化過程中LDC1出現(xiàn)冗余片段，或者一個(gè)基因是另一個(gè)基因整合到植物染色體中的拷貝形式，整合過程中發(fā)生了插入或缺失突變等。另外，通過氨基酸序列相似性比對還發(fā)現(xiàn)，LDC1和LDC2蛋白序列與野芭蕉Musa balbisiana (BAG70979.1)、玉米Zea mays (NP001148565.1)、蒺藜苜蓿Medicago truncatula (XP003588965.1) 和擬南芥Arabidopsis thaliana (CAB87668.1) 推測的LDC氨基酸序列具有較高的同源性 (數(shù)據(jù)未提供)，該結(jié)果是否暗示低等蕨類蛇足石杉與上述高等植物在進(jìn)化上有較近親緣關(guān)系有待研究。

為了驗(yàn)證克隆獲得的2個(gè)LDC基因功能，我們將其引入可溶性表達(dá)載體pET-32a(+)，分別于37 ℃、30 ℃和25 ℃進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE分析表明37 ℃條件下表達(dá)量最高，但重組蛋白均為包涵體，25 ℃表達(dá)量非常低，幾乎檢測不到重組蛋白 (數(shù)據(jù)未提供)；30 ℃重組蛋白以包涵體和可溶性兩種形式存在，但可溶性表達(dá)量比較低。如果要提高可溶性蛋白表達(dá)水平，還需對表達(dá)條件做進(jìn)一步探討。將30 ℃誘導(dǎo)的可溶性蛋白Trx-LDC1和Trx-LDC2進(jìn)行分離和純化后，我們曾多次嘗試用腸激酶對融合蛋白進(jìn)行酶切，遺憾的是酶切過程中蛋白變性產(chǎn)生沉淀析出，最后我們選用融合蛋白Trx-LDC1和Trx-LDC2進(jìn)行酶活性分析，酶促反應(yīng)結(jié)果表明它們均具有催化賴氨酸脫羧生成尸胺的能力。根據(jù)TLC檢測結(jié)果中底物賴氨酸和產(chǎn)物尸胺的比例，可初步確定重組融合蛋白總體酶活性力比較低，其主要原因可能是酶反應(yīng)條件不適宜所致，當(dāng)然也不排除融合蛋白TrxA片段空間位阻效應(yīng)妨礙LDC與底物結(jié)合等其他因素的影響。

雖然已有學(xué)者研究了大豆Glycine max、煙草Nicotiana glauca、多葉羽扇豆Lupinus polyphyllus和柳葉黃薇Heimia salicifolia等植物的賴氨酸脫羧酶活性和功能[16-20]，但是至今有關(guān)植物L(fēng)DC的分子信息仍然知之甚少。本研究首次從蛇足石杉中分離出2個(gè)LDC基因，通過生物信息學(xué)分析和原核重組表達(dá)研究了其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和酶活性，這些結(jié)果為進(jìn)一步闡述LDC的生物學(xué)功能及其編碼蛋白的酶學(xué)性質(zhì)奠定基礎(chǔ)。石杉堿甲作為新一代治療老年癡呆的珍稀藥物，隨著對其生物合成入口酶LDC及代謝過程中其他關(guān)鍵酶 (基因) 的逐步認(rèn)識，將能全面解析其生物合成路徑和分子作用機(jī)制，為通過生物技術(shù) (如組織/細(xì)胞培養(yǎng)、代謝工程等) 手段解決石杉堿甲藥源問題提供科學(xué)依據(jù)。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Cloning, prokaryotic expression and characterization of lysine decarboxylase gene from Huperzia serrata

Ci Du1,2, Jing Li1,2, Yuntao Tang1,2, and Qingzhong Peng1,2

1 College of Biology and Environmental Sciences Jishou University, Jishou 416000, Hunan, China
2 Key Laboratory of Plant Resource Conservation and Utilization, College of Hunan Province, Jishou 416000, Hunan, China

Huperzine A is a promising drug to treat Alzheimer's disease (AD). To date, its biosynthetic pathway is still unknown. Lysine decarboxylase (LDC) has been proposed to catalyze the first-step of the biosynthesis of huperzine A. To identify and characterize LDCs from Huperzia serrata, we isolated two LDC fragments (LDC1 and LDC2) from leaves of H. serrata by RT-PCR and then cloned them into pMD?19-T vector. Sequence analysis showed that LDC1 and LDC2 genes shared 95.3% identity and encoded the protein of 212 and 202 amino acid residues respectively. Thus, we ligated LDC genes into pET-32a(+) to obtain recombinant expressing vectors pET-32a(+)/LDC1 and pET-32a(+)/LDC2 respectively. We further introduced two expression vectors into Escherichia coli BL21(DE3) and cultured positive colonies of E. coli in liquid LB medium. After inducing for 4 hours with 260 μg/mL IPTG at 30 ℃, soluble recombinant Trx-LDC1 and Trx-LDC2 were obtained and isolated for purification using a Ni-NTA affinity chromatography. We incubated purified recombinant proteins with L-lysine in the enzyme reaction buffer at 37 ℃ and then derived the reaction products using dansyl chloride. It was found that both Trx-LDC1 and Trx-LDC2 had decarboxylase activity, could convert L-lysine into cadaverine by way of thin layer chromatography assay. Further, bioinformatics analysis indicated that deduced LDC1 and LDC2 had different physicochemical properties, but similar secondary and three-dimensional structures.

Huperzia serrata, lysine decarboxylase, gene cloning, prokaryotic expression, enzyme activity, structure prediction

October 15, 2013; Accepted: December 10, 2013

Qingzhong Peng. Tel: +86-743-8725365; E-mail: qzpengjsu@163.com

杜次, 李菁, 唐云濤, 等. 蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因的克隆、原核表達(dá)及其功能分析. 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(8):1299?1307.

Du C, Li J, Tang YT, et al. Cloning, prokaryotic expression and characterization of lysine decarboxylase gene from Huperziaserrata. Chin J Biotech, 2014, 30(8): 1299?1307.

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31260081), Scientific Research Fund of Hunan Provincial Education Department (No. 13A078).

國家自然科學(xué)基金 (No. 31260081)，湖南省教育廳科學(xué)研究基金 (No. 13A078) 資助。